一株能降解海水柴油污染物的基因工程细菌Y8-alkB2的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一株能降解海水柴油污染物的基因工程菌的制备、鉴定及其降解能力的测定。本发明利用现代生物工程技术，采用合成alkB2基因；并选择柴油降解率低的海洋土著菌Y8，构建了Y8-alkB2基因工程菌。经过鉴定，确定Y8属于克雷伯氏菌属；Y8-alkB2含有alkB2转基因片段，能表达ALKB蛋白。对该基因工程菌的降解率的测定和降解条件的分析，显示该基因工程菌株能有效提高土著菌Y8的柴油降解效率，稳定、高效地对柴油污染物进行降解，有望应用于海水柴油污染的治理。
【专利说明】—株能降解海水柴油污染物的基因工程细菌Y8-alkB2
1【技术领域】
[0001]本发明涉及一株能降解海水柴油污染物的基因工程菌的制备、鉴定及其降解能力的测定。
2【背景技术】
[0002]微生物降解是去除环境中石油污染物的主要途径。生物修复是指利用生物特别是微生物来催化降解环境污染物，减小或最终消除环境污染的受控或自发过程，是在微生物降解基础上发展起来的新兴的环保技术。
[0003]土著微生物降解污染物的潜力巨大，但驯化时间长、生长速度慢、代谢活性低，因而转入外源高效污染物降解基因，能够提高生物修复效率。近年来，构建高效的基因工程菌以显著提高污染物的降解效率成为油类污染治理的一个热点，它为解决生物修复周期长等问题提供了崭新的途径。国外学者Charkrabany经过研究发现能降解芳烃、萜烃、多环芳烃的细菌的降解基因位于质粒上，他根据质粒容易传递的特性将能够降解脂(含质粒A)的一种假单胞菌作为受体细胞，分别将能够降解芳烃(含质粒B)、萜烃(含质粒C)、多环芳烃(含质粒D)的质粒，用遗传工程的方法人工转入受体细胞，获得多质粒的“超级细菌”，这一新型菌能同时降解四种石油组分，能把原油中约2 / 3的烃类消耗。它的突出优点是比自然菌降解速度快。所以，本研究着重选取恰当的基因，构建基因工程菌，以期解决土著菌降解效率低的难题。
[0004]烷烃降解菌的降解酶基因以烷烃末端但加氧酶AlkB相关的烷烃羟化酶为目前的研究热点。烷烃进入细菌后，先被细胞膜上的AlkB蛋白进行末端羟基化，然后在乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的作用下进一步氧化，最后加上乙酰辅酶A，进入β氧化循环，分解成二氧化碳和水，AlkB酶是烷烃降解的限速酶。
[0005] 某些微生物能以烷烃为碳源已被公认，但大多数生化和遗传研究主要还是集中在有限的几个原型系统，Alcanivorax borkumensis烧烃轻化酶系统是其中之一，Alcanivorax borkumensis是海洋微生物中一种独特的、以烧烃为主要的特异性底物生长的杆状Y-蛋白菌。该菌遍布全球众多海域，包括太平洋、地中海、日本海、中国沿海和北极。在没有污染的海洋中，该菌数量很少，但在石油污染的开发海域或海岸，该菌可快速生长成为污染水域中的优势菌群，在石油降解菌群中，该菌所占比例为80-90%。近期研究报道证明A.borkumensis在石油污染生物修复中发挥关键作用。2006年，NatureB1technology报道了 A.borku-mensis SK2的基因组全长序列及其功能分析结果,发现该菌基因组中含有多个编码烃类物质分解代谢酶系统的基因簇，如alkSBlGJH基因簇，gntR和alkB2，p450等。这些基因编码的蛋白在η-烷烃转变成脂肪酸的过程中发挥重要作用，其中alkB2编码的烷烃羟化酶是不含血红素铁的膜蛋白，其催化的烷烃羟化反应是烷烃降解作用过程中的第一步也是关键步骤，其烷烃降解的范围是C8-C16。因此，我们选择A.borku-mensis SK2的alkB2基因为目的基因。3
【发明内容】
[0006]本发明的目的是制备一株能降解海水柴油污染物的基因工程菌，并鉴定其降解能力。
[0007]Y8菌是从定海港口受污染的海水中，采用富集培养微生物的方法，分离获得的对油类污染降解效率较低的土著菌，但能在以柴油为唯一碳源的海水培养基中生长繁殖。经紫外分光光度法检测，其对柴油污染物的7天降解效率仅为10~15%。
[0008]对Y8菌株直接进行菌落PCR扩增，得到16S rDNA的基因序列，构建系统发育树，结果表明Y8菌株与Klebsiella oxytoca strain ATCC13182相似度达到99%,由此可确定该菌株属于克雷伯氏菌，重建的系统发生树表明Y8与Klebsiella oxytoca strain ATCC13182所构的支为姐妹群关系。
[0009]提取Y8基因组，经PCR分析得知Y8中未含有烷烃羟化酶AlkB2，由于烷烃羟化酶是柴油降解的重要限速酶，所以采用基因转导的方法，在Y8中转入alkB2基因，构建基因工程菌 Y8-alkB2。
[0010]经鉴定Y8-alkB2能特异表达AlkB2蛋白，对柴油的降解率分别为:2天，20.14% ；4 天，51.94% 以及 6 天，72.16%。
4【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1:根据Y816s rDNA序列构建的系统发育树。
[0012]图2 =PCR鉴定Y8中alkB2基因表达:P_质粒；G_基因组。
[0013]图3:PCom8-alkB2质粒的鉴定(质粒大小、PCR和酶切)
[0014]图4:Y8-alkB2菌株抽提质粒PCR、酶切鉴定以及蛋白表达鉴定的鉴定。
[0015]图5:Y8与Y8_alkB2菌株对柴油的降解效率比较。
5【具体实施方式】
[0016]以下通过具体实施对本发明做进一步说明。
[0017]实施例1.污染海水中细菌的富集、培养
[0018]从受污染的海水区域采集表层水样，用灭菌后的4L棕色玻璃瓶取2L表层海水后密封保存，24h内进行微生物的富集培养和分离工作。
[0019]将采集的水样取ImL接种于含0.5% (V / V)柴油的10mL灭菌的人工海水培养基(MMC)中。MMC 的配方为(每升含量):NaC124g ；MgS04.7H200.7g ；NH4NO3Ig ；KC10.7g ；KH2P042g ；Na2HPO4.12H203g ；pH7.5，灭菌后补加适量微量元素混合。微量元素经0.22 μ m滤膜过滤除菌，其组成(每升含量)如下:CaCl22mg ；FeCl3.6H2050mmg ；CuSO40.5mmg ；MnCl2.4Η200.5mg ；ZnSO4.7H2010mg / L。在 30°C,200r / min 的摇床培养 7 天后，从培养液中取出ImL转入10mL新鲜培养基中，培养基的油浓度提高至I % (v / v)，在相同的条件下培养；油浓度按梯度(0.5%、1%、1.5%、2%、2.5% )提高，富集培养五个周期。
[0020]实施例2.Y8菌株的分离
[0021]用移液枪(枪头已灭菌)吸取ImL富集培养物置于9mL无菌水中，作为KT1稀释液进行倍比稀释，分别制成10_2、10_3、10_4、10_5、10_6、10_7、10_8稀释液；分别吸取0.2mL不同稀释度的样品滴入LB固体培养基内，涂布8个平板，对应编号，倒置于35°C生化培养箱培养I~2天；再在平板上挑取单菌落，采取分区划线法，使菌种进一步纯化；纯化后的菌株保存在斜面培养基中，并于4°C冰箱中保藏；实验均在无菌室超净工作台操作。
[0022]将分离纯化的细菌分别接种于5ml LB液体培养基中，200rpm，35°C下振荡培养12h，至菌悬液OD600nm值为0.8~1.0 (菌体浓度为18~19Cells / mL)，然后将0.5ml去掉LB培养基的各菌悬液分别加入50mL相同柴油浓度的MMC中，设空白对照，200rpm，30°C下振荡培养7天，将能以柴油作为唯一碳源生长的菌株保存，即为Y8。
[0023]实施例3.Y8菌株降解率的初步测定
[0024]取保存的Y8菌种，LB平板划线，30°C恒温培养过夜，挑取单克隆，接种于5mL LB培养基中，于30°C、200rpm的摇床培养8小时。吸取0.5mL活化后的菌液至1.5mLEP管中，在3000rpm条件下离心5min，弃上清；用0.5mL的MMC培养基悬浮沉淀，再次在3000rpm条件下离心5min,重复洗漆菌体一次。将沉淀菌体用0.5mL MMC培养基悬浮后,接种于50mL添加过I %柴油的MMC培养基中，于30°C、200rpm的摇床培养一周。
[0025]根据《海洋监测规范-海水分析》(GB17378.4-2007)，用石油醚萃取MMC中的残留柴油，采用紫外分光光度法测定柴油的残留量，以未接菌的含相同柴油浓度的MMC培养基为对照， 计算降解率。该实验设3个重复。柴油降解率计算公式为:=Il-(C0-C1) / CcJ X 100%，其中，Ctl和C1分别为对照组柴油浓度和接菌组柴油浓度。Y8的柴油降解率初步测定为10-15%。
[0026]实施例4.Y8菌株的16S rDNA鉴定
[0027]Y8菌株用TAKARA的DNA提取试剂盒直接提取DNA作为模板，PCR反应体系(50 μ I)为 Premix EX Taq PCR MasterMix (TAKARA) 25 μ I，引物 27F (5，-AGR GTTTGATYVTGGCTCAG-3’)和 1492R(5’-GGHTACCTTGTTACGACTT-3’)各2μ I (1pmol)，DNA 模板 2 μ 1(约 20ng)，超纯水19 μ I。PCR 扩增程序为 94°C 1min ；94°C lmin，53°C 90s，72°C 90s，30 个循环；72°C 1min0扩增产物进行测序，测序结果用DNAstar软件来拼接，DNA序列检测结果如下:
[0028]5， -TGCAAGTCGAACGGTAGCACAGAGAGCTTGCTCTCGGGTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGGGGTAAGGTTAATAACCTTGTTCATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAAACTGGCAGGCTGGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTTCCCTTGAGGAGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAACTTAGCAGAGATGCTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGATTCGGTCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCATATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTATGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCG-3，
[0029]将测得的菌株的16S rDNA序列通过EzTaxon Server vers1n2.1与其中核酸数据库进行比对分析，相似的序列进行多重匹配排列分析(clustalxl.83)，用Mega4分析软件中的Neighbor Joining方法构建系统发育树(图1)。结果表明:Y8菌株与Klebsiellaoxytoca strain ATCC13182相似度达到99%，由此可确定该菌株属于克雷伯氏菌，重建的系统发生树表明Y8与Klebsiellaoxytoca strainATCC13182所构的支为姐妹群关系。
[0030]实施例5.Y8的alkB2基因表达
[0031]通过碱裂解法，抽提Y8中基因组和土著质粒，按照genebank上alkB2序列，设计alkB2通用引物，经PCR鉴定Y8的alkB2基因表达，结果如图2所示:与阳性对照菌W3相t匕，Y8中无alkB2基因表达，由于Y8能在以以柴油作为唯一碳源的条件扩增，说明Y8具有利用柴油的一系列酶，然而作为柴油降解限速酶AlkB2，其在Y8中表达缺失，为了进一步增强Y8的降解效率，釆用基因工程的手段，转入alkB2基因，以期提高Y8的柴油降解效率。
[0032]实施例6.PCom8-alkB2质粒的构建和鉴定
[0033]按照genebank上alkB2序列，运用DNA club、Clustal X等软件设计目的基因两端的酶切位点:Sal I和Nde I，交由生物技术公司合成目的基因alkB2_SK2。目的基因序列为:
[0034]latgttcgaga atacgaatcc tgatgtaatg ctaaaaatga aaaaatatgg ctacctggct
[0035]61ttttgggcaa ttatggtgcc gcttgttcct ttttctgcct tcgtgggggt ggaaagtggc
[0036]121acgcaggatt attgggcctg gtttatgtat gccttcatct tcgggattat cccggtactg
[0037]181gattatttgg tgggtaaaga tccgactaat cccagtgaag atgtgcaggttcccactatg
[0038]241agtgaggaag ttttttaccg ggtctctgca atcgccatgg gcttcgtatg gatcgcggta
[0039]301ttgttctatg ctggtcatat tttcatgaac aatggctacg gtctgctggg caaaatcggt
[0040]361tggattgtct ctattggcac cgtaggtggc attatcgcaa tcaatttggg gcatgagttg
[0041]421atccacaaag atcccaaagt ggaaaattgg atgggtggtt tgttgctgtc tagcgtcacc
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[0043]541gacgcatcgt ccagccgtta taaccaaagtctgtataact ttcttcccaa ggcgtttgta
[0044]601cataacttca ttaacgcctg gagtctggaa aaaaaatacc tggagcgtaa agggaagaag
[0045]661aacattagtg ttcataatga acttatctgg tggtcagca tttctgcgttgttcgcggcc
[0046]721acattcggac tgctttgggg ttggcagggg gtggtgttct ttctggggca gagtttcttt
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[0049]901ttaactaact tggccctgtt tcaactacag cgccacagtg accaccatgc ttacgccaag
[0050]961cgtcgttatc aggtcttgcg ccattatgaa gaaagtccgc agttgccggc aggttacgcc
[0051]1021accatgtatg tgttggcctt gataccgcca ctgtggagaa aggtgatgaa tcctcgagta
[0052]1081gaagcgtatt acgagggtga attggatcaa ctgttccgcg atggcaagcg agtgaacaat
[0053]1141atcgcttaa / /
[0054]pCom8空载体和PCR产物经Sal I和Nde I酶切，酶切条件为37 °C，6h。酶切产物过柱回收，回收的空载体和PCR产物经T4连接酶连接，连接条件为4°C，过夜。连接产物转导入大肠杆菌DH5 α，经LB平板培养过夜，挑取单克隆，抽提质粒，根据目的基因序列，设计上下游引物对提取的重组质粒进行PCR鉴定，引物序列为:上游引物5’ TTGCTTGATGCGATGTTT3';下游引物 5’ AGTCCGTTCACGATACCC3’ ；根据酶切位点，通过 SalI和Nde I酶切鉴定质粒；根据质粒大小，通过琼脂糖凝胶电泳，鉴定质粒，具体结果如图3所示，结果表明重组质粒pCom8-alkB2PCR片段大小为150bp，酶切产物全长为1150bp。电泳鉴定后，质粒又交由生物技术公司测序，经blast表明，各目的基因与genebank登录序列一致，证明重组质粒构建成功。
[0055]实施例7.Y8-alkB2菌株的构建与鉴定
[0056]pCom8_alkB2质粒通过电转化的方式导入土著菌Y8，完成基因工程菌Y8_alkB2构建。阳性菌克隆通过对抽提的质粒进行酶切和PCR鉴定，结果如图4所示:质粒PCR片段大小为150bp，酶切产物全长为1150bp，与pCom8-alkB2相同，证明质粒成功导入Y8。为了进一步验正pCom8-alkB2质粒在土著菌Y8中能否表达AlkB2蛋白，我们通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测alkB2基因在Y8中的表达。结果表明:alkB2基因在1%柴油诱导时，在Y8中能够正确表达，表达的目的蛋白分子量与预期一致，条带大小约为49KD。
[0057]实施例8.Y8-alkB2菌株的柴油降解率检测
[0058]检测基因工程菌Y8_alkB2和土著菌Y8在1%柴油浓度的海水培养基中培养3d后的柴油降解率。结果如图5所示:土著菌Y8和基因工程菌Y8-alkB2的降解率分别为9.64%
20.64% (2 天);11.26%和 51.94% (4 天);1L33%和 72.16% (6 天)，提示基因工程菌Y8-alkB2能显著提高土著菌的降解效率。 [0059]本发明，本领域技术人员可通过借鉴本文，明显能不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内，适当改变动物模型、辐射剂量和检测方法实现本应用。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动，都被视为在本发明精神、范围和内容中。
【权利要求】
1.一株能降解海水柴油污染物的基因工程细菌Y8-alkB2SK2，其特征是土著菌Y8转入一种焼径末端单加氧酶基因(alkane monooxygenase, alkB)片段，并能在以柴油为唯一碳源的海水培养基中生长繁殖，提高土著菌Y8的柴油降解率。
2.权利要求1所述的土著菌Y8，其特征为Y8属于变形菌纲、肠杆菌目、肠杆菌科、克雷伯氏菌属，其中 Y8 的 16s rDNA 序列 BLAST 比对与 Klebsiella oxytoca strain ATCC13182相似度达到99%。
3.权利要求1所述的alkB2SK2目的基因片段具有如下的序列: latgttcgaga atacgaatcc tgatgtaatg ctaaaaatga aaaaatatgg ctacctggct 61ttttgggcaa ttatggtgcc gcttgttcct ttttctgcct tcgtgggggt ggaaagtggc 121acgcaggatt attgggcctg gtttatgtat gccttcatct tcgggattat cccggtactg 181gattatttgg tgggtaaaga tccgactaat cccagtgaag atgtgcaggttcccactatg 241agtgaggaag ttttttaccg ggtctctgca atcgccatgg gcttcgtatg gatcgcggta 301ttgttctatg ctggtcatat tttcatgaac aatggctacg gtctgctggg caaaatcggt 361tggattgtct ctattggcac cgtaggtggc attatcgcaa tcaatttggg gcatgagttg 421atccacaaag atcccaaagtggaaaattgg atgggtggtt tgttgctgtc tagcgtcacc 481tatgcgggtt tcaaggtgga gcatgtgcgg ggtcatcacg tccacgtatc taccccggat 541gacgcatcgt ccagccgtta taaccaaagt ctgtataact ttcttcccaa ggcgtttgta 601cataacttca ttaacgcctg gagtctggaa aaaaaatacc tggagcgtaa agggaagaag 661aacattagtg ttcataatga acttatctgg tggtacagca tttctgcgtt gttcgcggcc 721acattcggac tgctttgggg ttggcagggg gtggtgttct ttctggggca gagtttcttt 781gccgccctag ccttagagat cattaactac attgaacact acggtttgca tcgccgtgtg 841aatgacaagg ggcgtttcga gcgggtgaca cctgcacata gctggaactc caacttcttg 901ttaactaact tggccctgtt tcaactacag cgccacagtg accaccatgc ttacgccaag 961cgtcgttatc aggtcttgcg ccattatgaa gaaagtccgc agttgccggc aggttacgcc 1021accatgtatg tgttggcctt gataccgcca ctgtggagaa aggtgatgaa tcctcgagta 1081gaagcgtatt acgagggtga attggatcaa ctgttccgcg atggcaagcg agtgaacaat 1141atcgcttaa / / 。
4.按照权利要求1所述，所说的提高土著菌Y8的柴油降解率，其特征为:在以柴油为唯一碳源的海水培养基中培养2天、4天和6天，Υ8和Y8-alkB2的降解率分别为:9.64%和.20.64% (2 天);11.26%和 51.94% (4 天);1L33%和 72.16% (6 天)。
【文档编号】C12R1/22GK104031871SQ201310522030
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年1月3日 优先权日:2014年1月3日
【发明者】刘琼, 何颖, 沈先荣, 李珂娴, 王庆蓉, 侯登勇, 蒋定文, 刘玉明, 陈伟 申请人:中国人民解放军海军医学研究所