双水相萃取快速分离纯化右旋糖酐蔗糖酶的方法
【专利摘要】本发明公开了一种双水相萃取快速分离纯化右旋糖酐蔗糖酶的方法，发明人通过添加聚乙二醇和外源性葡聚糖构建PEG/Dextran双水相体系，从而建立了本发明的方法。该法解决了目前采用硫酸铵沉淀法、膜分离法等分离右旋糖酐蔗糖酶的方法存在酶活回收率低、操作困难、单一方法分离纯度低等问题。本发明绿色环保、安全高效、操作简单，耗时短,可适用于短时间内快速分离纯化右旋糖酐蔗糖酶。
【专利说明】双水相萃取快速分离纯化右旋糖酐蔗糖酶的方法【技术领域】
[0001]本发明属于生物分离工程【技术领域】，尤其涉及一种双水相萃取快速分离纯化右旋糖酐蔗糖酶的方法。
【背景技术】
[0002]右旋糖酐鹿糖酶(Dextransucrase,系统分类号EC2.4.1.5)属于糖酐水解酶70家族(Family70)，由肠膜明串珠菌发酵获得，是一种催化蔗糖合成右旋糖酐的糖基转移酶，催化合成的右旋糖酐可作为血浆代用品，在食品、医药、化工等行业均具有广泛的应用。但是， 肠膜明串珠菌发酵得到的右旋糖酐蔗糖酶含有多种杂质，与产物葡聚糖混合在一起，以致粗酶液非常粘稠，给酶的分离纯化造成了极大的困难。
[0003]目前，有多种方法可用于右旋糖酐蔗糖酶的分离纯化，如硫酸铵沉淀法、超滤、有机溶剂沉淀法、色谱分离等。硫酸铵沉淀法在很大程度上损伤了右旋糖酐蔗糖酶的活性，当用质量浓度超过80%的硫酸铵处理时，酶活回收率不超过10%。超滤法虽具有较高的酶活回收率，但粗酶液粘度高，易造成膜堵塞，膜通量下降较快，不适合工业化应用。有机溶剂沉淀法的沉淀特异性高于硫酸铵沉淀法，且沉淀不用脱盐，过滤较为容易，但是容易引起酶的变性失活。色谱分离一般与其他纯化方法(如超滤、盐析、葡聚糖酶降解)等结合使用，虽然它能得到纯度较高的酶，但易造成酶污染、酶活损失严重、处理量少，只能用于实验室规模，很难进行工业化生产。
[0004] 双水相萃取是指两种亲水性聚合物水溶液在一定条件下可以形成双水相，利用被分离物在两相中分配系数不同而实现分离的技术，该法具有易分相、价格低廉、萃取高效温和、无毒、萃取物活性损失小、除杂能力强、萃取率高、可连续操作、安全方便等优点，可广泛的用于蛋白质、酶、核酸、氨基酸、多肽、细胞器等产品的分离和纯化。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是提供一种操作简单、快速高效的双水相萃取快速分离纯化右旋糖酐蔗糖酶的方法，以提高右旋糖酐蔗糖酶的酶活回收率、节约纯化时间。
[0006]为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案:双水相萃取快速分离纯化右旋糖酐蔗糖酶的方法，包括以下步骤:
[0007](I)用肠膜明串珠菌发酵产右旋糖酐蔗糖酶制备右旋糖酐蔗糖酶粗酶液；
[0008](2)向步骤(1)的粗酶液中添加聚乙二醇(PEG)和外源性葡聚糖(Dextran)构建 PEG/Dextran双水相体系；
[0009](3)将步骤(2)的PEG/Dextran双水相体系低温静置分层和高速离心分离；
[0010](4)将步骤(3)分离的下相透析浓缩即得右旋糖酐蔗糖酶(含葡聚糖)。
[0011]步骤(1)按以下操作进行:将肠膜明串珠菌CICC21724在43号固体培养基斜面试管中复活后，接种至43号固体培养基；待长出茁壮的单菌落后，挑取2环单菌落接种至种子培养基；待菌种繁殖至对数期时，以2%(v/v)的接种量接种于产酶培养基，培养20-26h ;然后将培养液在12000r/min、4°C、20min的条件下离心去除菌体，收集上清液即得右旋糖酐蔗糖酶粗酶液。
[0012]43 号固体培养基配方为蔗糖 130g/L、蛋白胨 2.0g/L、KH2PO40.3g/L、Na2HPO4L 4g/ L、琼脂20.0g/L, pH7.0-7.2 ;种子培养基配方为蔗糖50g/L、酵母膏10g/L、蛋白胨10g/L、 KH2PO40.3g/L、Na2HPO4L 4g/L，pH6.8 ;产酶培养基配方为蔗糖 50g/L、酵母膏 12.5g/L、牛肉膏 20g/L、KH2PO4L Og/L、Na2HP043.6g/L, pH7.0-7.2。
[0013]固体培养基培养菌种的条件为25±3°C ;种子培养基和产酶培养基培养菌种的条件为25±3°C、150±50r/min，装液量是所盛容器标准容量的20%。
[0014]步骤(2)中PEG/Dextran双水相体系构成为:粗酶液20mL，加入一定浓度的PEG 溶液和外源性Dextran溶液，用无菌水补足至体系总质量为40g ；PEG的分子量为6000， PEG6000的质量终浓度(w/w)为15% ；外源性Dextran的分子量为I万、4万或7万， Dextran-TlO的质量终浓度(w/w)为0.8%~2.4%, Dextran_T40的质量终浓度(w/w)为 0.8% ~2.4%, Dextran-T70 的质量终浓度(w/w)为 0.4% ~2.0%。
[0015]步骤(2)中盛放PEG/Dextran双水相体系采用50mL的Beckman离心管。
[0016]步骤(3)按以下操作进行:构建PEG/Dextran双水相体系后，均匀混合，置于4V 的冰箱中静置lh，然后利用高速冷冻离心机在12000r/min、4°C条件下离心20min后，倒掉上相，将下相用0.02mol/L的醋酸钠缓冲液(pH5.4)稀释定容至15mL。
[0017]步骤(4)中透析选用分子量为7000Da的透析袋。
[0018]针对目前右旋糖酐蔗糖酶制备过程中存在的问题，发明人通过添加聚乙二醇和外源性葡聚糖构建PEG/Dextran双水相体系，从而建立了本发明双水相萃取快速分离纯化右旋糖酐蔗糖酶的方法。该法萃取高效温和，最佳萃取条件下，右旋糖酐蔗糖酶的酶活回收率可达95.99%，比活力为29.90U/mg，纯化倍数为1.86倍；所得右旋糖酐蔗糖酶中只含有葡聚糖(对酶活有一定的保护和稳定作用)，杂质少，可用于酶法合成右旋糖酐的研究和生产。同时，本发明萃取耗时短，操作简单，可适用于快速分离右旋糖酐蔗糖酶。
【具体实施方式】
[0019]以下各实施例所用培养基及培养条件如下:
[0020]固体培养基配方为蔗糖130g/L、蛋白胨 2.0g/L、KH2PO40.3g/L、Na2HPO4L 4g/L、 琼脂20.0g/L, pH7.0-7.2 ;种子培养基配方为蔗糖50g/L、酵母膏10g/L、蛋白胨10g/L、 KH2PO40.3g/L、Na2HPO4L 4g/L，pH6.8 ;产酶培养基配方为蔗糖 50g/L、酵母膏 12.5g/L、牛肉膏 20g/L、KH2PO4L 0g/L、Na2HP043.6g/L, pH7.0-7.2。
[0021]固体培养基培养菌种的条件为25±3°C ;种子培养基和产酶培养基培养菌种的条件为25±3°C、150±50r/min，装液量是所盛容器标准容量的20%。
[0022]实施例1
[0023]将肠膜明串珠菌CICC21724在43号固体培养基斜面试管中复活后，接种至43号固体培养基；待长出茁壮的单菌落后，挑取2环单菌落接种至种子培养基；待菌种繁殖至对数期时，以2%(v/v)的接种量接种于产酶培养基，培养20-26h ;然后将培养液在12000r/ min、4°C、20min的条件下离心去除菌体，收集上清液即得右旋糖酐蔗糖酶粗酶液。
[0024]取粗酶液20mL置于50mL的Beckman离心管中，分别加入12mL质量浓度50%的PEG6000溶液和1.60mL质量浓度20%的Dextran-TlO溶液，使其质量终浓度(w/w)分别为15%和0.8%，用无菌水补足至体系总质量为40g，构建成PEG/Dextran双水相体系。构建PEG/Dextran双水相体系后，充分摇匀均匀混合，置于4°C的冰箱中静置Ih使得分相充分，然后利用高速冷冻离心机在12000r/min、4°C条件下离心20min后，倒掉上相，将下相用 0.02mol/L的醋酸钠缓冲液(pH5.4)稀释定容至15mL，测得右旋糖酐蔗糖酶的酶活回收率为79.61%，比活力为25.90U/mg，纯化倍数为1.61倍。然后，选用分子量为7000Da的透析袋，将分离的下相透析浓缩即得右旋糖酐蔗糖酶(含葡聚糖)。
[0025]实施例2
[0026]制备右旋糖酐蔗糖酶粗酶液同实施例1。
[0027]取粗酶液20mL置于50mL的Beckman离心管中，分别加入12mL质量浓度50%的 PEG6000溶液和4.80mL质量浓度20%的Dextran-TlO溶液，使其质量终浓度(w/w)分别为15%和2.4%，用无菌水补足至体系总质量为40g，构建成PEG/Dextran双水相体系。构建PEG/Dextran双水相体系后，充分摇匀均匀混合，置于4°C的冰箱中静置Ih使得分相充分，然后利用高速冷冻离心机在12000r/min、4°C条件下离心20min后，倒掉上相，将下相用 0.02mol/L的醋酸钠缓冲液(pH5.4)稀释定容至15mL，测得右旋糖酐蔗糖酶的酶活回收率为66.81%，比活力为20.23U/mg，纯化倍数为1.26倍。然后，选用分子量为7000Da的透析袋，将分离的下相透析浓缩即得右旋糖酐蔗糖酶(含葡聚糖)。
[0028]实施例3
[0029]制备右旋糖酐 蔗糖酶粗酶液同实施例1。
[0030]取粗酶液20mL置于50mL的Beckman离心管中，分别加入12mL质量浓度50%的 PEG6000溶液和1.28mL质量浓度25%的Dextran_T40溶液，使其质量终浓度(w/w)分别为15%和0.8%，用无菌水补足至体系总质量为40g，构建成PEG/Dextran双水相体系。构建PEG/Dextran双水相体系后，充分摇匀均匀混合，置于4°C的冰箱中静置Ih使得分相充分，然后利用高速冷冻离心机在12000r/min、4°C条件下离心20min后，倒掉上相，将下相用
0.02mol/L的醋酸钠缓冲液(pH5.4)稀释定容至15mL，测得右旋糖酐蔗糖酶的酶活回收率为89.90%,比活力为32.58U/mg,纯化倍数为1.48倍。然后，选用分子量为7000Da的透析袋，将分离的下相透析浓缩即得右旋糖酐蔗糖酶(含葡聚糖)。
[0031]实施例4
[0032]制备右旋糖酐蔗糖酶粗酶液同实施例1。
[0033]取粗酶液20mL置于50mL的Beckman离心管中，分别加入12mL质量浓度50%的 PEG6000溶液和3.20mL质量浓度20%的Dextran_T40溶液，使其质量终浓度(w/w)分别为15%和2.0%，用无菌水补足至体系总质量为40g，构建成PEG/Dextran双水相体系。构建PEG/Dextran双水相体系后，充分摇匀均匀混合，置于4°C的冰箱中静置Ih使得分相充分，然后利用高速冷冻离心机在12000r/min、4°C条件下离心20min后，倒掉上相，将下相用
0.02mol/L的醋酸钠缓冲液(pH5.4)稀释定容至15mL，测得右旋糖酐蔗糖酶的酶活回收率为72.39%，比活力为23.04U/mg，纯化倍数为1.05倍。然后，选用分子量为7000Da的透析袋，将分离的下相透析浓缩即得右旋糖酐蔗糖酶(含葡聚糖)。
[0034]实施例5
[0035]制备右旋糖酐蔗糖酶粗酶液同实施例1。[0036]取粗酶液20mL置于50mL的Beckman离心管中，分别加入12mL质量浓度50%的 PEG6000溶液和0.80mL质量浓度20%的Dextran_T70溶液，使其质量终浓度(w/w)分别为15%和0.4%，用无菌水补足至体系总质量为40g，构建成PEG/Dextran双水相体系。构建PEG/Dextran双水相体系后，充分摇匀均匀混合，置于4°C的冰箱中静置Ih使得分相充分，然后利用高速冷冻离心机在12000r/min、4°C条件下离心20min后，倒掉上相，将下相用
0.02mol/L的醋酸钠缓冲液(pH5.4)稀释定容至15mL，测得右旋糖酐蔗糖酶的酶活回收率为67.84%，比活力为15.25U/mg，纯化倍数为1.14倍。然后，选用分子量为7000Da的透析袋，将分离的下相透析浓缩即得右旋糖酐蔗糖酶(含葡聚糖)。
[0037]实施例6
[0038] 制备右旋糖酐蔗糖酶粗酶液同实施例1。
[0039]取粗酶液20mL置于50mL的Beckman离心管中，分别加入12mL质量浓度50%的 PEG6000溶液和4.0OmL质量浓度20%的Dextran_T70溶液，使其质量终浓度(w/w)分别为15%和2.0%，用无菌水补足至体系总质量为40g，构建成PEG/Dextran双水相体系。构建PEG/Dextran双水相体系后，充分摇匀均匀混合，置于4°C的冰箱中静置Ih使得分相充分，然后利用高速冷冻离心机在12000r/min、4°C条件下离心20min后，倒掉上相，将下相用
0.02mol/L的醋酸钠缓冲液(pH5.4)稀释定容至15mL，测得右旋糖酐蔗糖酶的酶活回收率为58.42%，比活力为13.62U/mg，纯化倍数为1.02倍。然后，选用分子量为7000Da的透析袋，将分离的下相透析浓缩即得右旋糖酐蔗糖酶(含葡聚糖)。
【权利要求】
1.一种双水相萃取快速分离纯化右旋糖酐蔗糖酶的方法，其特征在于包括以下步骤:(1)用肠膜明串珠菌发酵产右旋糖酐蔗糖酶制备右旋糖酐蔗糖酶粗酶液；(2)向步骤(1)的粗酶液中添加聚乙二醇和外源性葡聚糖构建PEG/Dextran双水相体系;(3)将步骤(2)的PEG/Dextran双水相体系低温静置分层和高速离心分离；(4)将步骤(3)分离的下相透析浓缩即得右旋糖酐蔗糖酶。
2.根据权利要求1所述的双水相萃取快速分离纯化右旋糖酐蔗糖酶的方法，其特征在于步骤(1)按以下操作进行:将肠膜明串珠菌CICC21724在43号固体培养基斜面试管中复活后，接种至43号固体培养基；待长出茁壮的单菌落后，挑取2环单菌落接种至种子培养基；待菌种繁殖至对数期时，以2%的接种量接种于产酶培养基，培养20-26h ;然后将培养液在12000r/min、4°C、20min的条件下离心去除菌体,收集上清液即得右旋糖酐鹿糖酶粗酶液。
3.根据权利要求2所述的双水相萃取快速分离纯化右旋糖酐蔗糖酶的方法，其特征在于:所述43号固体培养基配方为蔗糖130g/L、蛋白胨2.0g/L、KH2PO40.3g/L、Na2HPO4L 4g/ L、琼脂20.0g/L，pH7.0-7.2 ;所述种子培养基配方为蔗糖50g/L、酵母膏10g/L、蛋白胨IOg/ L、KH2PO40.3g/L、Na2HPO4L 4g/L，pH6.8 ;所述产酶培养基配方为蔗糖 50g/L、酵母膏 12.5g/ L、牛肉膏 20g/L、KH2PO4L Og/L、Na2HP043.6g/L, pH7.0-7.2。
4.根据权利要求2所述的双水相萃取快速分离纯化右旋糖酐蔗糖酶的方法，其特征在于:所述固体培养基培养菌种的条件为25±3°C;所述种子培养基和产酶培养基培养菌种的条件为25±3°C、150±50r/min，装液量是所盛容器标准容量的20%。
5.根据权利要求1所述的双水相萃取快速分离纯化右旋糖酐蔗糖酶的方法，其特征在于步骤(2)中PEG/Dextran双水相体系构成为:粗酶液20mL，加入一定浓度的PEG溶液和外源性Dextran溶液，用无菌水补足至体系总质量为40g的分子量为6000，PEG6000 的质量`终浓度为15% ;所述外源性Dextran的分子量为I万、4万或7万,Dextran-TlO的质量终浓度为0.8%~2.4%, Dextran-T40的质量终浓度为0.8%~2.4%，Dextran_T70的质量终浓度为0.4%~2.0%。
6.根据权利要求5所述的双水相萃取快速分离纯化右旋糖酐蔗糖酶的方法，其特征在于步骤(2)中盛放PEG/Dextran双水相体系采用50mL的Beckman离心管。
7.根据权利要求6所述的双水相萃取快速分离纯化右旋糖酐蔗糖酶的方法，其特征在于步骤(3)按以下操作进行:构建PEG/Dextran双水相体系后，均匀混合，置于4°C的冰箱中静置Ih，然后利用高速冷冻离心机在12000r/min、4°C条件下离心20min后，倒掉上相，将下相用0.02mol/L pH5.4的醋酸钠缓冲液稀释定容至15mL。
8.根据权利要求1所述的双水相萃取快速分离纯化右旋糖酐蔗糖酶的方法，其特征在于步骤(4)中透析选用分子量为7000Da的透析袋。
【文档编号】C12N9/10GK103571806SQ201310560298
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年11月12日 优先权日:2013年11月12日
【发明者】陈山, 刘玫, 梁赢, 张义平, 姚晓麦, 浦媛媛, 邹青松, 黄磊, 谢政, 相萍萍 申请人:广西大学