一种鉴别绵羊肉和山羊肉的方法及其试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种快速有效的绵羊肉和山羊肉的分子鉴别方法，包括以下步骤：提取待测样品基因组DNA；采用上游引物：F5′-TCTCAGCCCAACTCCTGACACCATG-3′，下游引物：R5′-TGGGCAATTTTAAATGAGCAACCTT-3′，以所提取的样品基因组DNA为模板进行PCR扩增；采用凝胶电泳对扩增产物进行鉴定。采用本发明的技术方案，能够有效和可靠地鉴别绵羊肉和山羊肉，在食品安全、打击假冒伪劣产品中具有广范的应用。
【专利说明】一种鉴别绵羊肉和山羊肉的方法及其试剂盒
【技术领域】:
[0001]本发明属于分子生物学检测领域，涉及利用DNA分子标记技术鉴别绵羊肉和山羊肉的方法。
【背景技术】:
[0002]羊肉通常是绵羊肉和山羊肉的统称，是我国传统的食药两用、营养丰富的肉类食品，一直以来深受消费者的喜爱。绵羊肉和山羊肉都具有蛋白含量高、低脂肪和低胆固醇的特性，但两者存在较大差异。山羊肉膻味重，胆固醇含量比绵羊肉低；绵羊肉比山羊肉脂肪含量高而口感细腻，膻味轻；中医认为，山羊肉属凉性，绵羊肉属热性，适合不同的人群食用。因此，受不同地区饮食习惯等因素的影响，消费者形成了对绵羊肉和山羊肉的选择性消费，直接引起绵羊肉和山羊肉的价格差异。
[0003]近年来，受羊肉消费需求急剧上升、饲养成本增加等因素影响，我国羊肉价格显著上涨。特别是市场流通的日益发达，羊肉经冷冻后再出售已是现代市场营销的主要手段。由于羊肉冷冻后通过感官检查很难区分其真假，一些不法商贩以价格低廉的禽肉冒充，损害了消费者利益。传统的感观检查和理化检验方法难以有效完成对绵羊肉和山羊肉的鉴别，也无法鉴别以禽肉假冒的冷冻羊肉，给当前的肉品监管工作提出了严峻挑战。
[0004]PCR全称聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction),是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火(复性)及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。
[0005]凝胶电泳技术是分离、鉴定、纯化DNA分子的常用方法。根据电泳中所用介质的不同，主要有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚合后的凝胶形成网状结构，具有浓缩效应、电荷效应和分子筛效应，能够有效分离不同分子量大小的DNA片断。琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广，不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段，采用水平装置电泳。聚丙烯酰胺分离小片段DNA效果较好，其分辩力极高，甚至相差Ibp的DNA片段都能分开，采用垂直装置电泳。
[0006]在动物源类肉品的种属鉴定方面，采用的遗传标记主要来源于线粒体基因组(常用的包括细胞色素b基因、12S rRNA基因、16S rRNA基因和控制区序列)，但未见应用基因组遗传标记鉴别绵羊肉和山羊肉的报道。
【发明内容】
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[0007]本发明的目的是构建一种快速有效的绵羊肉和山羊肉的分子鉴别方法。为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案:
[0008]本发明一方面涉及一种鉴别绵羊肉和山羊肉的方法，包括以下步骤:提取待测样品基因组 DNA ；采用上游引物:F5' -TCTCAGCCCAACTCCTGACACCATG-3'，下游引物:R5' -TGGGCAATTTTAAATGAGCAACCTT-3丨，以所提取的样品基因组DNA为模板进行PCR扩增；采用凝胶电泳对扩增产物进行鉴定。[0009]在本发明的一个优选实施方式中，所述的提取待测样品基因组DNA的方法为苯酹-氯仿法。[0010]在本发明的另一个优选实施方式中，所述的凝胶电泳是聚丙烯酰胺凝胶电泳。[0011]在本发明的另一个优选实施方式中，所述的凝胶电泳还包括标准样品的凝胶电泳，所述的标准样品是绵羊肉和/或山羊肉相应基因的PCR扩增产物。[0012]本发明另一方面还涉及一种试剂盒，其包括上游引物:F5' -TCTCAGCCCAACTCCTGACACCATG-3'，下游引物:R5' -TGGGCAATTTTAAATGAGCAACCTT-3'。[0013]在本发明的一个优选实施方式中，所述试剂盒中任选包括DNA聚合酶，Taq酶。[0014]采用本发明的技术方案，能够有效和可靠地鉴别绵羊肉和山羊肉，在食品安全、打击假冒伪劣产品中具有广范的应用。
【专利附图】
【附图说明】:[0015]图1:新鲜和冷冻肌肉样品PCR扩增产物的I %琼脂糖凝胶电泳图谱。图中，泳道M为标准分子量参照DL2000，从上至下片断大小依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和IOObp ;泳道I为新鲜肉用山羊肉，泳道2为新鲜绒山羊肉，泳道3为新鲜奶山羊肉，泳道4为冷冻肉用山羊肉，泳道5为冷冻绒山羊肉，泳道6为冷冻奶山羊肉；泳道7为新鲜肉用绵羊肉，泳道8为新鲜毛用绵羊肉，泳道9为新鲜肉毛兼用绵羊肉，泳道10为冷冻肉用绵羊肉，泳道11为冷冻毛用绵羊肉，泳道12为冷冻肉毛兼用绵羊肉；泳道13为新鲜鸡肉，泳道14为新鲜鸭肉，泳道15为新鲜鹅肉，泳道16为冷冻鸡肉，泳道17为冷冻鸭肉，泳道18为冷冻鹅肉。[0016]图2:新鲜羊肉样本PCR扩增产物的8%聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱。图中，泳道M为标准分子量参照DL2000，从上至下片断大小依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp和250bp ；泳道I为新鲜肉用山羊肉，泳道2为新鲜绒山羊肉，泳道3为新鲜奶山羊肉；泳道4为新鲜肉用绵羊肉，泳道5为新鲜毛用绵羊肉，泳道6为新鲜肉毛兼用绵羊肉。[0017]图3:冷冻羊肉样本PCR扩增产物的8%聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱。图中，泳道M为标准分子量参照DL2000，从上至下片断大小依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp和250bp ；泳道I为冷冻肉用山羊肉，泳道2为冷冻绒山羊肉，泳道3为冷冻奶山羊肉；泳道4为冷冻肉用绵羊肉，泳道5为冷冻毛用绵羊肉，泳道6为冷冻肉毛兼用绵羊肉。[0018]图4:绵羊和山羊混合DNA样本PCR扩增产物的8%聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱。图中，泳道M为标准分子量参照DL2000，从上至下片断大小依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp和250bp ;泳道I为山羊，泳道2为绵羊，泳道3为绵羊与山羊DNA按1:1混合，泳道4为绵羊与山羊DNA按5:1混合，泳道5为绵羊与山羊DNA按10:1混合，泳道6为绵羊与山羊DNA按15:1混合，泳道7为绵羊与山羊DNA按1:5混合，泳道8为绵羊与山羊DNA按1: 10混合，泳道9为绵羊与山羊DNA按1: 15混合。
【具体实施方式】:[0019]实施例1:不同种属来源肌肉样品DNA提取、PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测[0020](一 )提取肌肉样品基因组DNA[0021]采用常规的苯酚-氯仿法提取新鲜的或者冷冻的肌肉组织样品基因组DNA。提取方法如下:
[0022]①组织样品的处理
[0023]采集不同生产类型的绵羊和山羊肌肉样本，绵羊包括肉用型(杜泊羊)、毛用型(中国美利奴羊)和肉毛兼用型(小尾寒羊)，山羊包括肉用型(波尔山羊)、绒用型(陕北白绒山羊)和奶用型(萨能奶山羊)。每种类型肌肉样本分成两部分，一部分_20°C直接冷冻，另一部分4°C保存。同时，采集新鲜和冷冻的鸡、鸭、鹅肉样本。切取新鲜的(或冷冻的)肌肉组织约0.5g，除去结缔组织，用预冷至4°C的生理盐水清洗；在冰浴中剪碎后，置于玻璃匀浆器，加入约2.0mL组织匀浆液匀浆至无明显组织块存在。
[0024]②细胞裂解
[0025]将匀浆后的组织液转移至5ml离心管中，加入等体积的裂解缓冲液，再加入蛋白酶K溶液至终浓度200 u g/mL,混匀后55°C水浴中缓慢振荡处理12h。
[0026]③酚/氯仿法抽提
[0027]裂解处理后的混合物中加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)混合液，缓慢旋转摇匀5min后4°C 10000r/min离心IOmin ;用宽口径吸管谨慎地吸取上层水相，转移至另一离心管中，加等体积氯仿/异戊醇(24:1),4°C 10000r/min离心lOmin。
[0028]④乙醇沉淀与洗涤`
[0029]用宽口径吸管小心吸出上层含DNA的水相，转移至离心管中，再向管中加入2.5倍体积的预冷无水乙醇，上下倒置混匀。12000r/min离心IOmin,弃上清液；75%的预冷乙醇洗涤一次，12000r/min离心lOmin，弃上清液；用吸头将管壁残留的乙醇去除，室温干燥15min (不要等DNA沉淀完全干燥，否则DNA不易溶解)。
[0030]⑤DNA溶解与保存
[0031]在盛有干燥DNA的离心管中加入适量TE缓冲液(100-200 y L)，4°C溶解。样品DNA采用紫外分光光度计测定浓度后稀释至IOOng/y L，_20°C保存备用。
[0032]( 二)引物设计、PCR扩增与检测
[0033]根据绵羊角蛋白基因家族成员KRTAP1-4基因序列(GenBank序列号XO1610)设计一对PCR引物，上游引物为:F5' -TCTCAGCCCAACTCCTGACACCATG-3'，下游引物为:R5' -TGGGCAATTTTAAATGAGCAACCTT-3;。引物由上海生工生物工程有限公司合成。
[0034]以步骤(一)中提取的肌肉样品基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系总体积为 25 ii 1，包含 10XBuffer2.5u L, MgCl2 (25mmol/L) 2.0 y L，dNTPs (2.5mmol/L)2.0u L, lOpmol/L 上、下游引物各 1.0u L,5U/u L Taq DNA 聚合酶 0.3 y L，IOOng/ u LDNA模板I U L，灭菌超纯水15.2u L0扩增反应的条件为:94°C预变性3min ；94°C 45s，59 °C 45s，72°C 45s，34个循环后72°C延伸8min，4°C保存。
[0035]取2 ii L PCR扩增产物在I %的琼脂糖凝胶电泳中检测有无特异性目标产物条带。
[0036](三)聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定
[0037]取检测有特异性目标条带的PCR扩增产物I U L在8%聚丙烯酰胺凝胶上电泳，电泳缓冲液为I X(20V/cm胶长度)电泳lh。
[0038]从胶板上取下凝胶,放入硝酸银染色液(染色液含0.2% AgN03、I %冰醋酸和10%无水乙醇，现配现用。)中于摇床上染色20min，然后用蒸馏水漂洗2次，每次持续15s。
[0039]漂洗后的凝胶放入显影液(含3%的无水NaOH，每200mL溶液临用前加ImL甲醛，现配现用)在摇床上显色约Smin (见到清晰的DNA条带为止)，显影后立刻用蒸馏水洗涤2次，每次持续15s。
[0040]将胶平铺于灯箱上，凝胶成像系统拍照保存。根据条带泳动位置反映出扩增产物的分子大小来鉴别肌肉样品来源，山羊肌肉样本的PCR扩增产物为630bp，绵羊肌肉样本的扩增产物为600bp。在8%聚丙烯酰胺凝胶上，绵羊样本的扩增产物由于比山羊样本的扩增产物小30bp，泳动速度明显快于山羊样本的扩增产物。
[0041]1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，电泳图谱如图1所示。结果表明，所有的绵羊和山羊肌肉样本中都能扩增出一条单一明亮的特异性条带，而所有的鸡、鸭、鹅肉样本都未能扩增出条带。
[0042]实施例2:绵羊和山羊肌肉样本PCR扩增产物聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定[0043]检测有特异性目标条带的绵羊和山羊肌肉样本PCR扩增产物，取I U L在8%聚丙烯酰胺凝胶上电泳，银染法显带，结果如图2和图3所示。
[0044]结果表明，绵羊和山羊肌肉样本的PCR扩增产物在凝胶上表现为绵羊样本的扩增产物泳动速度快于山羊样本的扩增产物，说明两者扩增产物的分子大小不同。
[0045]实施例3:混合羊肉DNA样本的灵敏度分析
[0046]将绵羊和山羊的DNA样品按不同质量比例混合后进行PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，结果如图4所不。
[0047]结果表明，当绵羊与山羊的DNA样品按1:10、1:5、1:1、5:1和10:1混合时，能同时扩增出绵羊和山羊的特异性条带；当绵羊与山羊的DNA样品按1:15和15:1混合时，只能扩增出一种特异性条带。说明当绵羊和山羊DNA混合样品在10:1至1:10范围内时，能检测到两种混合样本；当绵羊和山羊DNA混合样品中任何一种DNA达到和超过15:1时，就不能检测到另一种DNA样品的存在。
[0048]实施例4 =PCR扩增产物的测序验证
[0049]以绵羊和山羊DNA为模板分别进行PCR扩增，扩增产物通过I %琼脂糖凝胶电泳分离，在紫外灯下切下目标条带，以凝胶回收试剂盒纯化目标片段后直接双向测序。
[0050]测序结果表明，绵羊和山羊样本的PCR扩增产物大小不同，绵羊的扩增产物为600bp (图5)，山羊的扩增产物为630bp (图6)，与凝胶电泳分离的结果相一致，验证了应用本专利申请方法鉴别绵羊肉和山羊肉的有效性和可靠性。
[0051]应当理解的是，上述【具体实施方式】仅是例举性说明，而不是对本发明的限制，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
【权利要求】
1.一种鉴别绵羊肉和山羊肉的方法，包括以下步骤: 提取待测样品基因组DNA ； 采用上游引物:F5' -TCTCAGCCCAACTCCTGACACCATG-3'，下游引物:R5' -TGGGCAATTTTAAATGAGCAACCTT-3!，以所提取的样品基因组DNA为模板进行PCR扩增； 采用凝胶电泳对扩增产物进行鉴定。
2.根据权利要求1所述的方法，所述的提取待测样品基因组DNA的方法为苯酚-氯仿法。
3.根据权利要求1所述的方法，所述的凝胶电泳是聚丙烯酰胺凝胶电泳。
4.根据权利要求1所述的方法，所述的凝胶电泳还包括标准样品的凝胶电泳，所述的标准样品是绵羊肉和/或山羊肉相应基因的PCR扩增产物。
5.一种试剂盒，其包括上游引物:F5, -TCTCAGCCCAACTCCTGACACCATG-3'，下游引物:R5' -TGGGCAATTTTAAATGAGCAACCTT-3'。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，所述试剂盒中任选包括DNA聚合酶，Taq酶。
7.权利要求5或6 所述的试剂盒在鉴别绵羊肉和山羊肉中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK103614467SQ201310576876
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年11月9日 优先权日:2013年11月9日
【发明者】王兰萍, 耿荣庆 申请人:王兰萍