一种促进骨髓再生的Endomucin抗体药物的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种促进骨髓再生的Endomucin抗体药物，公开了Endomucin对造血细胞的增殖、分化具有负调控作用，即对骨髓恢复、再生具有抑制作用，而Endomucin抗体可以削弱这种抑制作用，促进骨髓造血功能的恢复。采用骨髓瘤细胞融合技术制备Endomucin单克隆抗体，制成药物制剂，对5-Fu化疗的小鼠进行治疗，能够促进骨髓细胞的恢复、再生，可以显著提高化疗小鼠的生存率，对骨髓再生功能具有明显的促进作用。Endomucin在调控骨髓造血功能方面的功能，具有巨大的潜在临床应用和研究价值。
【专利说明】—种促进骨髓再生的Endomucin抗体药物
【技术领域】
[0001]本发明提供一种促进骨髓再生的Endomucin抗体药物，具有促进骨髓受损后的恢复和再生的功能，属于生物制药【技术领域】。
【背景技术】
[0002]现在，放射治疗和化学药物治疗仍是治疗肿瘤和防止肿瘤复发的主要手段，其主要毒、副作用之一是损伤患者的骨髓系统，造成骨髓造血和免疫功能抑制，导致患者出现贫血、出血、感染、甚至危及生命的现象，严重影响了疗效，经常导致治疗的失败。因此，如何能有效的促进肿瘤患者自身骨髓的造血功能恢复、再生具有非常重要的意义。
[0003]放、化疗对骨髓造成的损伤包括造血干细胞和由骨髓间充质细胞组成的造血微环境。目前已经上市的粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)、促红细胞生成素(EP0)、和白介素-11 (IL-1l)等药物都具有很大的局限性，其靶细胞主要是已经定向分化的造血祖细胞，而不是作为造血源头细胞的造血干细胞。这些药物只作用于增生期的造血祖细胞，只能暂时性提高血细胞数量，如果骨髓造血干细胞和造血微环境长期得不到改善，不但无效，还可能加速骨髓造血功能的衰竭。目前，临床上还没有用于促进造血干细胞自我更新和促进受损骨髓间充质细胞再生修复的药物。
[0004]造血干细胞是一群具有自我更新能力和多向分化潜能的原始造血细胞，具备高度的自我更新能力，可分化生成所有类型的血细胞。单个造血干细胞就可以重建个体的造血系统和免疫系统，这种巨大的造血重建潜能每年能挽救45000人的生命。
[0005]本发明涉及的“Endomucin ”为造血干细胞膜表面的一个受体蛋白分子。在国内外，Endomucin在骨髓造血的功能方面的研究尚未见报道。`
【发明内容】
[0006]本发明公开了一种促进骨髓再生的Endomucin抗体药物，其目的是提出作为造血干细胞膜表面的受体蛋白的Endomucin，在放、化疗骨髓的恢复、再生过程中的抑制功能，进而制备能够促进骨髓再生的Endomucin单克隆抗体药物。
[0007]本发明提供了 Endomucin在制备促进骨髓再生的抗体药物中的用途。
[0008]本发明进一步公开了促进骨髓再生的Endomucin抗体药物,其特征在于:
无色透明溶液的剂型，每支Endomucin抗体剂量为20mg/mL,含140mM NaCl, 0.5mM
EDTA,pH7.4。
[0009]本发明公开了促进骨髓再生的Endomucin抗体药物的制备方法，包括以下步骤:
I)Endomucin基因的克隆、蛋白表达与纯化
采用基因合成的方法制备人Endomucin基因，将人Endomucin全长基因分别克隆到PGEX-2T载体中，使目的基因接到谷胱苷肽巯基转移酶(GST)基因后面，以GST-Endomucin融合蛋白的形式在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了高效表达；然后应用ant1-GST的亲和层析介质Glutathione - Sepharose对GST-Endomucin融合蛋白进行纯化，采用凝血酶切下GST肽段，获得纯度超过98%的人Endomucin蛋白；
2)Endomucin单克隆抗体的制备与纯化
①抗原免疫:选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照0、7天、14天、28天的免疫方案,每次将0.5mL, 20mg的人Endomucin蛋白抗原注射免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞；
②细胞融合:在免疫结束后的第14天，采用眼球摘除放血法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备IOmL脾细胞悬液；将准备好的SP20骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按1:2比例混合，并加入10%的促融合剂聚乙二醇；使各种淋巴细胞与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞；
③杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化:在HAT培养基中培养杂交瘤细胞，只有少数是分泌人Endomucin单克隆抗体的细胞能够生长，用有限稀释法在96孔细胞培养板上进行杂交瘤细胞的筛选和克隆化培养，应 用ELISA方法筛选出能产生Endomucin单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞；在TlOO细胞培养瓶中进行杂交瘤细胞的克隆扩增，培养条件为37°C，5%C02,然后取IOmL细胞混悬液转入850 mL罗氏瓶中进一步扩增，最后向收获的细胞培养液中加入20% 二甲基亚砜，在液氮中对杂交瘤细胞株进行冻存；④单克隆抗体的大量制备:应用CelliGen Plus生物反应器,工作容积14升罐体中间填装200g的聚酯片载体Cytodex I ；聚酯片载体Cytodex I是由50%聚酯纤维和50%聚丙烯制备的直径为6mm的小圆盘，比表面积为120mm2/mm3 ;搅拌和通气在固定床的上方，在搅拌中产生负压，促使培养基不断流经聚酯片载体Cytodex I，以利于营养物质和气体的传递；采用连续灌流方式对杂交瘤细胞进行培养，培养基是⑶杂交瘤细胞培养基；培养条件为:温度37°C，pH7.2，搅拌速度60-80rpm，溶氧40-50%，接种细胞密度2-3X 105/mL，四气混合系统供气(氧气、空气、氮气、二氧化碳)；在培养过程中，杂交瘤细胞产生单克隆抗体并分泌到细胞培养液中，培养21天后收集细胞培养液，应用Contifuge Stratos连续流离心机进行连续流离心处理,在4°C、12000rpm条件下离心去除细胞及其碎片，流速80mL/min,离心收获的上清液是含有人Endomucin单克隆抗体的细胞培养上清液；
⑤单克隆抗体的纯化:
应用AKTA Explorer 100蛋白纯化系统进行人Endomucin单克隆抗体的亲和层析纯化；亲和层析柱的介质为Mabselect Sure,将人Endomucin单克隆抗体的细胞培养上清液进行亲和层析柱纯化；柱层析纯化的流速是5mL/min,以20mM, pH7.4的磷酸盐缓冲液作为平衡柱缓冲液和上样缓冲液，以4个柱体积(CV)的平衡缓冲液平衡Mabselect Sure柱后，将离心收获的含有人Endomucin单克隆抗体的细胞培养上清液调整为pH7.4后直接上柱，上样量约是10CV，上样结束后以约2CV的平衡缓冲液洗净未结合的蛋白；以20mM，pH4.0的柠檬酸缓冲液洗脱并收获Endomucin单克隆抗体，然后以0.1N NaOH冲洗层析柱4CV，清洗柱中的杂蛋白和再生介质，以20%乙醇冲洗层析柱2CV保存柱子；通过一步亲和层析柱纯化收获纯度超过95%的人Endomucin单克隆抗体；将纯化收获的人Endomucin单克隆抗体溶液应用Centramate Cassette超滤器进行超滤浓缩和溶液置换,采用截留分子量10000道尔顿的膜包，超滤缓冲液为pH7.4，140mM NaCl, 0.5mM EDTA,将Endomucin抗体溶液体系置换为pH7.4，140mM NaCl, 0.5mM EDTA,按照终浓度20mg/mL进行稀释配制，制备人Endomucin单克隆抗体制剂。
[0010]本发明采用经典的5-氟尿嘧啶(5-FU)化疗小鼠的骨髓损伤和再生模型，应用基因芯片技术对化疗后小鼠骨髓细胞基因表达谱的变化进行分析。Endomucin基因的表达量呈现先上升后下降的现象，表达量最高相差11倍以上，与具有调控造血功能的已知基因(如⑶34、Kit ligand)具有相同的变化规律。克隆了人Endomucin基因，通过基因疫苗的模式在正常小鼠体内实现Endomucin基因过表达，发现实验组骨髓细胞数量与对照组比较提高了 2倍，有显著性差异。在小鼠血清中检测到效价为1:10000的Endomucin抗体，将该小鼠的血清注射5-Fu化疗的小鼠，可以显著促进小鼠骨髓细胞和外周血白细胞、血小板的数量的增多和恢复。表达、纯化了 Endomucin蛋白，在此基础上制备Endomucin单克隆抗体，应用该抗体药物可以显著性提高小鼠对5-Fu的耐受能力和5-Fu后的生存能力。
[0011]5-Fu是尿嘧啶类似物，是通过抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶来阻断脱氧尿嘧啶核苷酸转变为脱氧胸腺嘧啶核苷酸，从而抑制DNA的生物合成，是细胞周期特异性细胞毒药物，在细胞周期的S期被掺入到DNA中导致细胞死亡，所以5-Fu能选择性杀伤快速增殖的造血细胞，然而增殖缓慢和分化成熟的细胞对5-Fu不敏感。Endomucin对造血细胞的增殖、分化具有负调控作用，即对骨髓恢复、再生具有抑制作用。在5-Fu损伤作用下，基因表达量迅速提高使造血干细胞保持在Gtl期，不进入S期以应对5-Fu对细胞的杀伤。当骨髓造血进入恢复期后，它们的表达量下降以促进造血干细胞进入S期，增殖并分化成各种血细胞。而Endomucin抗体可以拮抗这种抑制作用，从而促进骨髓造血功能的恢复。
[0012]本发明的积极效果在于:
提供了 Endomucin对造血细胞的增殖、分化具有负调控作用，即对化疗后受损伤骨髓的恢复、再生过程具有抑制作用，而Endomucin抗体可以拮抗这种抑制作用，促进骨髓造血功能的恢复。采用骨髓瘤细胞融合技术制备Endomucin单克隆抗体,制成药物制剂，对5_Fu化疗的小鼠进行治疗，能够促进骨髓细胞和外周血细胞的恢复、再生，可以显著提高化疗小鼠的生存率，对骨髓再生功 能具有明显的促进作用。Endomucin在调控骨髓造血功能方面的机制，具有巨大的潜在临床应用和研究价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1为5-Fu化疗小鼠骨髓细胞数量的变化图；
图2为5-Fu化疗小鼠外周血白细胞数量的变化图；
图3为5-Fu化疗小鼠外周血血小板数量的变化图。
【具体实施方式】
[0014]实施例1
I)Endomucin基因的克隆、蛋白表达与纯化
采用基因合成的方法制备人Endomucin基因(Genebank编号:AF205940)，将人Endomucin全长基因分别克隆到pGEX_2T载体中，使目的基因接到谷胱苷肽巯基转移酶(GST)基因后面，以GST-Endomucin融合蛋白的形式在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了高效表达。人Endomucin蛋白的表达量占菌体总蛋白的33%。然后应用ant1-GST的亲和层析介质Glutathione-Sepharose对GST-Endomucin融合蛋白进行纯化,采用凝血酶切下GST肽段，获得纯度超过98%的人Endomucin蛋白。
[0015]2)人Endomucin免疫小鼠血清对骨髓造血的促进作用将人Endomucin蛋白肌肉注射小鼠，每支注射10ug，分别在ld，14d, 28d注射3次后，应用摘眼球法采集小鼠血液，37度放置30分钟后，3000rpm离心20分钟，收集离心上清液获得人Endomucin免疫小鼠血清。
[0016]将5_Fu(200mg/kg)尾静脉注射Balb/c小鼠，然后注射100 ii L人Endomucin免疫小鼠血清，连续注射5天，监测14天内骨髓细胞数量、外周血白细胞和血小板数量的变化。与对照组比较:
a.实验组骨髓细胞数量在第11天和第14天明显提高(图1)，有显著性差异(p〈0.01)，并且在第11天已经恢复到化疗前的水平，较对照组提前了 3天。
[0017]b.实验组的外周血白细胞数量在第11天和第14天明显提高(图2)，有显著性差异(p〈0.01);并且在第11天已经接近恢复到化疗前的水平。
[0018]c.实验组的外周血血小板数量在第11天明显提高(图3)，与对照组有显著性差异(p〈0.01);对照组在第11天也接近恢复到化疗前的水平。
[0019]上述结果表明，人Endomucin免疫小鼠血清有助于5_Fu化疗小鼠骨髓细胞和外周血细胞的提前恢复，化疗后第14天的骨髓细胞、外周血白细胞和血小板的数量较对照组也明显升高。受损后的骨髓造血功能得到了恢复。(参见图广3)
3)Endomucin单克隆抗体的制备与纯化
①抗原免疫:选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照0、7天、14天、28天的免疫方案,每次将0.5mL, 20mg的人Endomucin蛋白抗原注射免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞。
[0020]②细胞融合:在免疫结束后的第14天，采用眼球摘除放血法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备IOmL脾细胞悬液。将准备好的SP20骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按1:2比例混合，并加入10%的促融合`剂聚乙二醇。使各种淋巴细胞与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。
[0021 ] ③杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化:在HAT培养基中培养杂交瘤细胞，只有少数是分泌人Endomucin单克隆抗体的细胞能够生长，用有限稀释法在96孔细胞培养板上进行杂交瘤细胞的筛选和克隆化培养，应用ELISA方法筛选出能产生Endomucin单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞。在T100细胞培养瓶中进行杂交瘤细胞的克隆扩增，培养条件为370C , 5%C02,然后取IOmL细胞混悬液转入850 mL罗氏瓶中进一步扩增，最后向收获的细胞培养液中加入20% 二甲基亚砜，在液氮中对杂交瘤细胞株进行冻存。④单克隆抗体的大量制备:应用CelliGen Plus生物反应器(美国NBS公司)，工作容积14升罐体中间填装200g的聚酯片载体Cytodex I (美国NBS公司)。聚酯片载体Cytodex I是由50%聚酯纤维和50%聚丙烯制备的直径为6mm的小圆盘，比表面积为120mm2/mm3。搅拌和通气在固定床的上方，在搅拌中产生负压，促使培养基不断流经聚酯片载体Cytodex I，以利于营养物质和气体的传递。采用连续灌流方式对杂交瘤细胞进行培养，培养基是Gibco公司的CD杂交瘤细胞培养基。培养条件为:温度37°C，pH7.2，搅拌速度60-80rpm，溶氧40-50%，接种细胞密度2-3X 105/mL,四气混合系统供气(氧气、空气、氮气、二氧化碳)。在培养过程中，杂交瘤细胞产生单克隆抗体并分泌到细胞培养液中，培养21天后收集细胞培养液，应用ContifugeStratos连续流离心机(美国Thermo Fisher公司)进行连续流离心处理,在4°C、12000rpm条件下离心去除细胞及其碎片，流速80mL/min,离心收获的上清液是含有人Endomucin单克隆抗体的细胞培养上清液。[0022]⑤单克隆抗体的纯化:
应用AKTA Explorer 100蛋白纯化系统(美国GE公司)进行人Endomucin单克隆抗体的亲和层析纯化。亲和层析柱的介质为Mabselect Sure (美国GE公司),将人Endomucin单克隆抗体的细胞培养上清液进行亲和层析柱纯化。柱层析纯化的流速是5mL/min,以20mM, pH7.4的磷酸盐缓冲液作为平衡柱缓冲液和上样缓冲液，以4个柱体积(CV)的平衡缓冲液平衡Mabselect Sure柱后,将离心收获的含有人Endomucin单克隆抗体的细胞培养上清液调整为PH7.4后直接上柱，上样量约是10CV，上样结束后以约2CV的平衡缓冲液洗净未结合的杂蛋白。以20mM，pH4.0的柠檬酸缓冲液洗脱并收获Endomucin单克隆抗体,然后以
0.1N NaOH冲洗层析柱4CV，清洗柱中的杂蛋白和再生介质，以20%乙醇冲洗层析柱2CV保存柱子。通过一步亲和层析柱纯化收获纯度超过95%的人Endomucin单克隆抗体。将纯化收获的人Endomucin单克隆抗体溶液应用Centramate Cassette超滤器(美国PALL公司)进行超滤浓缩和溶液置换，采用截留分子量10000道尔顿的膜包，超滤缓冲液为pH7.4，140mMNaCl, 0.5mM EDTA,将 Endomucin 抗体溶液体系置换为 pH7.4，140mM NaCl, 0.5mM EDTA,按照终浓度20mg/mL进行稀释配制,制备人Endomucin单克隆抗体制剂。
[0023]试验例1:
Endomucin单克隆抗体对5_Fu化疗小鼠的保护作用
根据5-Fu注射后小鼠骨髓和外周血的抑制、恢复情况，在注射后第7天骨髓抑制最严重，至第11天之后得到部分恢复；而大部分小鼠的死亡情况也出现在第7天左右，超过第11天即度过危险期。
[0024]对注射亚致死剂量5-Fu (280mg/kg)进行化疗的小鼠做分组，治疗组和对照组各20只小鼠，对照组未做处理，治疗组应用人Endomucin单克隆抗体进行治疗，在小鼠注射5-Fu后连续5天皮下注射0.2mL抗体(10mg/mL)。统计小鼠的死亡情况，对照组的小鼠从5-Fu注射后第7天开始出现死亡情况，至第12天共有17只小鼠死亡，仅有3只小鼠健存，存活率15% ;而治疗组至第十二天只有5只小鼠死亡,有15只小鼠健存,存活率75%,死亡率从85%提高到25% ;治疗组与对照组比较有显著性差异(p < 0.01)。统计分析发现，对照组小鼠的平均生存时间为8.8天，治疗组小鼠的平均生存时间> 12天，与对照组比较有显著性差异(P < 0.01)。实验结果表明,Endomucin单克隆抗体可以提高小鼠对5_Fu化疗药物的耐受剂量，Endomucin抗体对小鼠骨髓造血恢复、再生具有促进作用。
[0025]试验例2:
Endomucin单克隆抗体对5_Fu化疗小鼠的保护作用
根据5-Fu注射后小鼠骨髓和外周血的抑制、恢复情况，在注射后第7天骨髓抑制最严重，至第11天之后得到部分恢复；而大部分小鼠的死亡情况也出现在第7天左右，超过第11天即度过危险期。
[0026]对注射亚致死剂量5-Fu (280mg/kg)进行化疗的小鼠做分组，治疗组和对照组各20只小鼠，对照组未做处理，治疗组应用人Endomucin单克隆抗体进行治疗，在小鼠注射5-Fu后连续5天皮下注射0.4mL抗体(10mg/mL)。统计小鼠的死亡情况,对照组的小鼠从5-Fu注射后第7天开始出现死亡情况，至第12天共有18只小鼠死亡，仅有2只小鼠健存，存活率10% ;而治疗组至第十二天只有3只小鼠死亡，有17只小鼠健存，存活率85%，死亡率从90%提高到15% ;治疗组与对照组比较有显著性差异(p < 0.01)。统计分析发现，对照组小鼠的平均生存时间为8.6天，治疗组小鼠的平均生存时间> 12天，与对照组比较有显著性差异(P <0.01)。实验结果表明,Endomucin单克隆抗体可以提高小鼠对5-Fu化疗药物的耐受剂量，Endomucin抗体对小鼠骨髓造血恢复、再生具有促进作用。
[0027]试验例3:
Endomucin单克隆抗体对5_Fu化疗小鼠的保护作用
根据5-Fu注射后小鼠骨髓和外周血的抑制、恢复情况，在注射后第7天骨髓抑制最严重，至第11天之后得到部分恢复；而大部分小鼠的死亡情况也出现在第7天左右，超过第11天即度过危险期。
[0028]对注射亚致死剂量5-Fu (280mg/kg)进行化疗的小鼠做分组，治疗组和对照组各20只小鼠，对照组未做处理，治疗组应用人Endomucin单克隆抗体进行治疗，在小鼠注射5-Fu后连续5天皮下注射0.6mL抗体(10mg/mL)。统计小鼠的死亡情况,对照组的小鼠从5-Fu注射后第7天开始出现死亡情况，至第12天共有18只小鼠死亡，仅有2只小鼠健存，存活率10% ;而治疗组至第十二天只有4只小鼠死亡,有16只小鼠健存,存活率80%,死亡率从90%提高到20% ;治疗组与对照组比较有显著性差异(p < 0.01)。统计分析发现，对照组小鼠的平均生存时间为8.3天，治疗组小鼠的平均生存时间> 12天，与对照组比较有显著性差异(P <0.01)。实验结果表明,Endomucin单克隆抗体可以提高小鼠对5-Fu化疗药物的耐受剂量，Endomucin抗体对小鼠骨髓造血恢复、再生具有促进作用。
[0029]本发明药物的表征为:无色透明溶液的剂型，每支Endomucin抗体剂量为20mg/mL,含 140mM NaCl, 0.5mM` EDTA, pH7.4。
【权利要求】
1.Endomucin在制备促进骨髓再生的抗体药物中的用途。
2.一种促进骨髓再生的Endomucin抗体药物,其特征在于: 无色透明溶液的剂型，每支Endomucin抗体剂量为20mg/mL,含140mM NaCl, 0.5mMEDTA，pH7.4。
3.一种促进骨髓再生的Endomucin抗体药物的制备方法，包括以下步骤: 1)Endomucin基因的克隆、蛋白表达与纯化 采用基因合成的方法制备人Endomucin基因，将人Endomucin全长基因分别克隆到PGEX-2T载体中，使目的基因接到谷胱苷肽巯基转移酶(GST)基因后面，以GST-Endomucin融合蛋白的形式在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了高效表达；然后应用ant1-GST的亲和层析介质Glutathione-Sepharose对GST-Endomucin融合蛋白进行纯化，采用凝血酶切下GST肽段，获得纯度超过98%的人Endomucin蛋白； 2)Endomucin单克隆抗体的制备与纯化 ①抗原免疫:选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照0、7天、14天、28天的免疫方案,每次将0.5mL, 20mg的人Endomucin蛋白抗原注射免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞； ②细胞融合:在免疫结束后的第14天，采用眼球摘除放血法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备IOmL脾细胞悬液；将准备好的SP20骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按1:2比例混合，并加入10%的促融合剂聚乙二醇；使各种淋巴细胞与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞； ③杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化:在HAT培养基中培养杂交瘤细胞，只有少数是分泌人Endomucin单克隆抗体的细胞能够生长，用有限稀释法在96孔细胞培养板上进行杂交瘤细胞的筛选和克隆化培养，应用ELISA方法筛选出能产生Endomucin单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞；在TlOO细胞培养瓶中进行杂交瘤细胞的克隆扩增，培养条件为37°C，5%C02,然后取IOmL细胞混悬液转入850 mL罗氏瓶中进一步扩增，最后向收获的细胞培养液中加入20% 二甲基亚砜，在液氮中对杂交瘤细胞株进行冻存；④单克隆抗体的大量制备:应用CelliGen Plus生物反应器,工作容积14升罐体中间填装200g的聚酯片载体Cytodex I ；聚酯片载体Cytodex I是由50%聚酯纤维和50%聚丙烯制备的直径为6mm的小圆盘，比表面积为120mm2/mm3 ;搅拌和通气在固定床的上方，在搅拌中产生负压，促使培养基不断流经聚酯片载体Cytodex I，以利于营养物质和气体的传递；采用连续灌流方式对杂交瘤细胞进行培养，培养基是⑶杂交瘤细胞培养基；培养条件为:温度37°C，pH7.2，搅拌速度60-80rpm，溶氧40-50%，接种细胞密度2-3X 105/mL，四气混合系统供气(氧气、空气、氮气、二氧化碳)；在培养过程中，杂交瘤细胞产生单克隆抗体并分泌到细胞培养液中，培养21天后收集细胞培养液，应用Contifuge Stratos连续流离心机进行连续流离心处理,在4°C、12000rpm条件下离心去除细胞及其碎片，流速80mL/min,离心收获的上清液是含有人Endomucin单克隆抗体的细胞培养上清液； ⑤单克隆抗体的纯化: 应用AKTA Explorer 100蛋白纯化系统进行人Endomucin单克隆抗体的亲和层析纯化；亲和层析柱的介质为Mabselect Sure,将人Endomucin单克隆抗体的细胞培养上清液进行亲和层析柱纯化；柱层析纯化的流速是5mL/min,以20mM, pH7.4的磷酸盐缓冲液作为平衡柱缓冲液和上样缓冲液，以4个柱体积(CV)的平衡缓冲液平衡Mabselect Sure柱后，将离心收获的含有人Endomucin单克隆抗体的细胞培养上清液调整为pH7.4后直接上柱，上样量约是10CV，上样结束后以约2CV的平衡缓冲液洗净未结合的杂蛋白；以20mM，pH4.0的柠檬酸缓冲液洗脱并收获Endomucin单克隆抗体，然后以0.1N NaOH冲洗层析柱4CV，清洗柱中的杂蛋白和再生介质，以20%乙醇冲洗层析柱2CV保存柱子；通过一步亲和层析柱纯化收获纯度超过95%的人Endomucin单克隆抗体；将纯化收获的人Endomucin单克隆抗体溶液应用Centramate Cassette超滤器进行超滤浓缩和溶液置换,采用截留分子量10000道尔顿的膜包，超滤缓冲液为pH7.4，140mM NaCl, 0.5mM EDTA,将Endomucin抗体溶液体系置换为PH7.4，140mM NaCl, 0.5mM EDTA,按照终浓度20mg/mL进行稀释配制，制备人Endomucin单克隆 抗体制剂。
【文档编号】C12Q1/68GK103690949SQ201310692787
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月18日 优先权日:2013年12月18日
【发明者】王群, 刘景晔, 高俊芳 申请人:长春长生生物科技股份有限公司