多组分核酸酶及其使用方法
【专利摘要】本发明涉及多组分核酸酶(MNAzyme)及其使用方法。MNAzyme包含两种或更多种寡核苷酸组分，所述组分在一种或多种MNAzyme组装易化子分子的存在下自组装形成催化活性结构。本发明提供制备MNAzyme的组合物以及MNAzyme集。本发明还提供使用MNAzyme检测、鉴定和/或定量一种或多种靶的方法。所述方法能够在以溶液为基础的分析或将一种或多种反应组分附着到载体结构上的分析中实践。该方法允许使MNAzyme检测复合以便在单一反应中检测多种靶。还提供制备所述组合物以及实践在此提供的方法的试剂盒。
【专利说明】多组分核酸酶及其使用方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求分别于2005年10月13日提交的第60/726，291号和于2005年10月7日提交的第60/724，567号美国临时专利申请的权益，其各自整体在此通过引用并入本申请。
【技术领域】 [0003]本发明涉及多组分催化核酸及其使用方法。更具体地，本发明涉及包含自组装的多组分核酸酶的组合物，所述组合物的制备方法，和所述组合物的使用方法，包括通过检测所述多组分核酸酶对底物的催化修饰来检测、鉴定和/或定量诸如组装易化子和其它实体的靶。
[0004]发明背景
[0005]整个本说明书在括号中引用了各种出版物，包括专利、公开的申请、技术文献和学术文献，在本说明书的结尾处可以找到每一完整引用文献。这些引用的出版物每一篇都整体在此通过引用并入本申请。
[0006]核酸分子能够采用可赋予酶促或催化活性的二级结构构型。体外演化技术已经促进了这种催化核酸的发现和开发，这种催化核酸通常被称为“DNA酶”或“核酶”，能够催化大范围的反应，包括核酸酶切(Carmi et al., 1996; Raillard andJoyce,1996;Breaker, 1997;Santoro and Joyce, 1998)> 核酸的连接(Cuenoud andSzostak, 1995)、B卜琳金属化(Li and Sen, 1996),以及形成碳碳键(Tarasow etal., 1997)、酷键(IIlangasekare et al., 1995)或酸胺键(Lohse and Szostak, 1996)。
[0007]具体地，已经表征出在通过Watson Crick碱基配对杂交之后特异性酶切不同核酸序列的 DNA 酶和核酶。DNA 酶能够酶切 RNA (Breaker and Joyce, 1994; Santoro andJoyce, 1997)或DNA (Carmi et al.，1996)分子。催化RNA分子(核酶)也能够酶切RNA(Haseloff and Gerlach, 1988)和 DNA(Raillard and Joyce, 1996)两种序列。大多数核酸酶的催化酶切速率取决于二价金属离子如Ba2+、Sr2+、Mg2+、Ca2+、Ni2+、Co2+、Mn2+、Zn2+和Pb2+ (Santoro and Joyce, 1998;Brown et al., 2003)的存在和浓度。
[0008]催化核酸如锤头核酶和10:23和8:17DNA酶具有多个结构结构域。它们具有保守的催化结构域(催化核)，其侧邻有两个非保守的底物结合结构域(“杂交臂”)，即与所述底物特异结合的序列区域。HaselofT和Gerlach工程化了锤头核酶，其以将两个保守结构域合在一起形成催化核的莖环结构而命名(Haseloffhe and Gerlach, 1988)。所述“ 10:23”和“8:17"DNA酶能够在特定的磷酸二酯键处酶切核酸底物(Santoro and Joyce, 1997)。所述10:23DNA酶具有15个脱氧核苷酸的催化结构域，所述结构域侧邻两个底物识别臂。所述8:17DNA酶具有14个脱氧核苷酸的催化结构域，所述结构域也侧邻两个底物识别臂。
[0009]催化核酸能够酶切具有满足最低要求的靶序列的核酸底物。所述底物序列必须与所述催化核酸的所述杂交臂基本上互补，并且所述底物在酶切位点必须含有特定序列。酶切位点处特定的序列要求包括，例如由所述10:23DNA酶酶切的嘌呤:嘧啶核苷酸序列(Santoro and Joyce, 1997)以及由所述锤头核酶切的序列尿苷:X(Perriman etal.，1992)，其中X能够是A、C、或U，但不能是G0
[0010]已经证实催化核酸在形成所述催化核的区域仅容许某些修饰(Perreaultet al?，1990;Perreault et al.，1991;Zaborowska et al., 2002;Cruz etal.，2004; Silverman, 2004)。负责DNA酶催化活性的序列的实例列于表1中。
[0011]表1:某些活性DNA酶及其底物的代表性序列
【权利要求】
1.产生多组分核酸酶(MNAzyme)并测定MNAzyme是否具有催化活性的方法,所述方法包括: 选择分裂核酸酶催化核核苷酸序列的点，以在该点的相对侧上形成第一和第二部分催化核部分； 在允许MNAzyme自组装和MNAzyme潜在催化活性的条件下，接触包括位于底物臂部分和感应臂部分之间的所述第一部分催化核部分的第一组分寡核苷酸，包括位于底物臂部分和感应臂部分之间的所述第二部分催化核部分的第二组分寡核苷酸，MNAzyme组装易化子，以及潜在的能够由MNAzyme催化修饰的第一底物， 其中所述组装易化子与所述第一和第二组分寡核苷酸的所述感应臂部分杂交时，所述第一组分寡核苷酸和所述第二组分寡核苷酸自组装形成MNAzyme，由此维持所述第一和第二寡核苷酸组分的邻近使得它们各自的部分催化核部分缔合形成所述MNAzyme的所述催化核，并且允许所述第一和第二组分寡核苷酸的底物臂部分各自与所述底物的通过所述催化核易化潜在修饰的底物杂交；以及 测定MNAzyme是否催化修饰底物， 其中底物的催化修饰指示MNAzyme是催化活性的,底物缺乏催化修饰指示MNAzyme无催化活性。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述选择步骤选择多个点，所述接触步骤进行多个第一组分寡核苷酸和多个第二组分寡核苷酸，由此多个MNAzymes自组装,所述MNAzymes的分裂点不同，以及所述测定步骤测定了多个MNAzymes中的哪一个催化修饰底物。
3.如权利要 求1所述的方法，其还包括合成分别包括已测定活性的MNAzyme的催化部分核的第一和第二寡核苷酸组分。
4.如权利要求3所述的方法，其还包括形成包括合成的第一和第二寡核苷酸组分的试剂盒。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述核酸酶催化核核苷酸序列来自DNAzyme或核酶。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述核酸酶催化核核苷酸序列来自8:17DNAzyme或10:23DNAzyme。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述核酸酶催化核核苷酸序列来自8:17DNAzyme，并且为 NTNNNAGCNNNWCGKN。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述点在核酸酶催化核核苷酸序列的核苷酸5,6, 7,8,9, 10 或 11 之后。
9.如权利要求6所述的方法，其中所述核酸酶催化核核苷酸序列来自10:23DNAzyme，并且为 NGGMTMGHNDNNNM⑶N。
10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述点在核酸酶催化核核苷酸序列的核苷酸5，6，7,8,9, 10或11之后。
11.如权利要求1所述的方法，其还包括用不同的核苷酸取代核酸酶催化核核苷酸序列的一个或多个核苷酸。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述不同的核苷酸是核糖核苷酸。
13.如权利要求11所述的方法，其中所述不同的核苷酸是脱氧核糖核苷酸。
14.如权利要求11所述的方法，其包括用不同的核苷酸取代核酸酶催化核核苷酸序列的两个或多个核苷酸。
15.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述组装易化子和/或底物包括任意一个或多个脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸以及多组分。
16.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述通过MNAzyme修饰底物是酶切底 物。
17.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其还包括提供能够与所述感应臂的至少一个杂交的第二底物，其中所述通过MNAzyme修饰第一底物是与所述第二底物连接。
18.如权利要求1至9中任一项所述的方法,其中所述通过MNAzyme修饰底物选自:口卜啉金属化，形成碳碳键、酯键或酰胺键，或其任意组合。
19.如权利要求1至9中任一项所述的方法,其还包括测定对照MNAzyme的催化活性，用于比较所述MNAzyme的催化活性或其缺乏。
20.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其还包括提供能够结合适体部分的分子，其中 所述第一组分寡核苷酸和/或第二组分寡核苷酸包括所述适体； 当所述适体部分与所述第一组分寡核苷酸和/或第二组分寡核苷酸杂交时，所述MNAzyme不能或基本不能对底物发挥催化活性； 所述接触包括将分子与所述第一和第二组分寡核苷酸接触；以及 所述条件允许所述分子与所述适体部分结合。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述第一和第二组分寡核苷酸、MNAzyme组装易化子和底物在与所述分子接触之前接触。
22.如权利要求20所述的方法，其中所述第一和/或第二组分寡核苷酸的一个或多个感应臂包括所述适体。
23.如权利要求20至22中任一项所述的方法，其中所述分子和/或所述适体是核酸、肽、多肽、蛋白、或其衍生物或组合物。
24.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述底物包括可检测部分和猝灭基因部分，并且所述通过所述MNAzyme修饰所述第一底物将可检测部分和猝灭基因部分分离，以由此提供可检测作用。
【文档编号】C12Q1/68GK103789311SQ201310751941
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2006年10月6日 优先权日:2005年10月7日
【发明者】伊丽莎·莫卡尼, 唐纳德·约翰·伯基特, 艾莉森·威尔彦·托德, 崔姆·比奇·多恩 申请人:强生研究有限公司