水稻维管束特异表达启动子POsvas 1的分离和应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了水稻维管束特异表达启动子POsvas?1的分离和应用。本发明还提供了含有该启动子的表达盒、植物表达载体、宿主菌和转化子，并且本发明还涉及上述启动子在植物转基因工程中的应用。本发明提供的水稻维管束特异表达启动子可以启动外源基因在植物维管束中特异性表达，适用于具有维管束的植物，尤其能够驱动外源基因在维管束中特异性表达，因此可以用于提高和改善水稻的生长特性，从而培育出理想的水稻品种。
【专利说明】水稻维管束特异表达启动子POsvasI的分离和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术和植物基因工程【技术领域】。具体而言，本发明涉及一种植物维管束基因表达启动子及其应用，该启动子能够在水稻转基因调控体系中驱动目标基因在维管束中表达。
【背景技术】
[0002]水稻是最主要的粮食作物之一，世界上三分之一以上的人口都以稻米为主食。随着经济的发展，全球范围内对稻米产量和品质提出了越来越高的要求。因而利用各种方法来提高水稻单产、改良稻米品质，有着积极重要的意义。
[0003]通过分子生物学以及基因工程的手段去研究和改良作物在农业生产中具有很好的应用前景。而外源基因在细胞中表达是基因工程研究的关键，并且外源基因的表达首先取决于其转录的启动。高等植物基因的表达具有时间和空间性。组织特异性启动子亦称器官特异性启动子，在这类启动子的驱动下，基因的表达往往只限于某些特定的器官或组织部位，并表现发育调节等特性。组织特异性通常以特定的组织细胞结构和化学、物理信号为基础，与诱导性启动子有一定的共同点。组织特异性启动子不仅能使目的基因的表达产物在一定器官或组织部位积累，增加区域表达量，同时也可以避免植物营养的不必要浪费。作为基因工程中最富有前景的调控元件，组织特异性启动子已成为近年研究的热点之一。
[0004]维管束是由初生木质部和初生韧皮部共同组成的束状结构，是植物体输导水分、无机盐及有机物质的通道。而贯穿整个水稻植株体的维管束系统是其主要输导组织，承担着植物体内的长距离运输功能，由导管构成的木质部主要输送水分和溶解在水中的无机盐，由筛管和伴胞组成的韧皮部主要输送溶解状态的同化物，水稻茎杆中的维管束是光合产物、水分、矿质营养等向籽粒运转的通道，在水稻的生长发育中起着重要的作用，在“源、流、库”系统中行使“流”的功能，水稻穗颈维管束性状与穗部生产力有着密切关系。
[0005]在目前农作物生产中，细菌和真菌性维管束病害常造成严重的损失，由于缺乏抗原，常规抗病育种进展缓慢，加之维管束病害难以用药剂防治，至今仍为生产中亟待解决的问题之一。目前已经鉴定的维管束特异启动子较少，研究比较深入的维管束特异表达启动子主要有:菜豆GRP118 (富甘氨酸细胞壁结构蛋白)、拟南芥profilin2基因和菜豆苯丙氨酸氨裂合酶PAL基因的启动子等，但是在水稻的生产实践中，有关维管束特异表达启动子的相关研究甚少，然而，在水稻高产育种实践中，特别是穗颈输导组织的性能在一定程度上影响着籽粒灌浆物质的运转，籽粒充实度差。研究输导组织的维管束性状，将有助于阐明水稻运流的生理机制，为水稻高产奠定生理基础。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种驱动外源基因在植物(尤其是水稻)维管束中特异性表达的启动子、获得含有该启动子序列的转化子以及该启动子的应用。其中，本文中所涉及的“植物”是指单子叶植物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦，优选为水稻。[0007]为了实现上述目的，一方面，本发明提供一种植物维管束特异性表达启动子，所述维管束特异性表达启动子包含SEQ ID No:1所示的DNA序列。序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列为来源于日本晴水稻(Oryzasativa L cv.Nipponbare)的水稻维管束特异表达启动子，本文中称为POsvasl或启动子POsvasI。
[0008]另一方面，本发明提供一种维管束特异性表达启动子，其DNA序列与SEQ ID No:1所示的DNA序列有至少80%同源性；或者，所述维管束特异性表达启动子为在SEQ ID No:1所示的DNA序列中添加、取代、插入或缺失一个或一个以上核苷酸生成的突变体或等位基因或衍生物；或者，所述启动子为与SEQ ID No:1所示的DNA序列杂交后的产物。这些启动子序列的变体与SEQ ID No:1所示的DNA序列具有相同或类似功能，即驱动目标基因在植物维管束中特异性表达，因此也包含在本发明的范围内。
[0009]另一方面，本发明还提供一种包含上述植物维管束特异性表达启动子的表达盒。
[0010]又一方面，本发明还提供一种重组载体，所述重组载体包含根据本发明提供的上述植物维管束特异性表达启动子；
[0011]优选地，所述重组载体为重组表达载体；进一步优选地，在所述重组表达载体中，本发明提供的上述植物 维管束特异性表达启动子连接于载体中待表达的基因序列的上游。
[0012]根据本发明的具体实施方案，所述待表达的基因为Gus基因；所述重组表达载体为将SEQ ID No:1所示的序列即POsvasl或启动子POsvasl构建于pCAMBIA1391中得到的重组表达载体,本文中称为pCAMBIA1391-P0svasl，其中，pCAMBIA1391来自于CAMBIA，是一种公开使用载体，目前在安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存。
[0013]并且，本发明还提供一种宿主菌，所述宿主菌包含本发明提供的上述植物维管束特异性表达启动子、上述表达盒、或上述重组载体；优选地，所述宿主菌为根癌农杆菌。
[0014]另一方面，本发明提供一种转化子，所述转化子包含本发明提供的上述植物维管束特异性表达启动子、上述表达盒、上述重组载体、或上述宿主菌。其中，所述转化子优选为转基因细胞系、愈伤组织或植株。
[0015]再一方面，本发明提供上述植物维管束特异性表达启动子在培育转基因植物中的应用。培育转基因植物的所述应用包括将本发明提供的上述植物维管束特异性表达启动子连接于载体的待表达的基因序列上游(例如，所述启动子与目标基因融合，即将所述启动子序列置于目标基因之前)，从而构建重组表达载体，将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。
[0016]并且优选地，所述应用用于改良植物维管束性状，所述植物为单子叶植物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦，优选为水稻所述重组表达载体为pCAMBIAl391-POsvasI，以用于改良水稻维管束形状。
[0017]本发明中所提供的启动子的DNA序列为(与序列表中SEQ ID No:1中相同):
[0018]TACGACCGATGTCCTATGGCTAATTATACTTTTTTAGTGTCCATCAGCCGTATTATATTTTCGCGGTGTCT CTCAGCCAATTACACGTTTTTTTACGTGTCCTGTGGTAAATTTTGTCTATTATATAACGGGGTAAAACCGATACA ATAAATTATCTCAATTTATAATACTCTGCTCATGCATCGACTCATCCATACGTGTTTCATACGTGTTTCTTTATATCCCGTCAATTTTTAAGTACCACCTACGTGTCAGAGACCAGAGATCTACCTCTTCTGAACGTACCACCTACTACA ATTTTTAAGATTGTCCTTGTAAGTCAAGATTGAAGTCCTTTCATGCCCCGCCAAAAAAATTCCTTTCATGAATGC CATGTTATACTCCCTCCATCCTCGTCTTATTTAAAAAAATTATGCAAATATAAAAATAAAAAGTTGTGCTTAAAA TAATTTGAATAATAAAGTAAGTCAAAATAATAATAATAATAATTTCAAAATTTTTTAAATAAGACGATTGGTCAA ACAGTGCAAACAAAAATTCAAAATCCCTTATATTATGAGACGGAGGGAGTAAAAAACTTGTGGGTTATGCCAGGG CCATGTTATAAAAACTTTTTATTATTGATTCACAATTTGTGTTCGACGATAACCTTTTTTCTTGGGGAATAGTAA CATTTTAGTGTGTATGAGCTGTTGGCGACTAATTTTTACAGGAAATTTAATTTTCATCACTAATAAGTTTGGCAG TTATCCAAATGTCCCTTTAGATTTGCTCTCTTTTTTACCACTCTAAAGAGATGGTTTCTACTTTTGCCCACGTGG CATGTGAATGTGGCAACTGAGCGTGAACAATGGTGTGGGACCCAGTAGTTAGATAGGTGAAGAGAGGAGGGGAAG GGGTCCACGTGGGTCACACGCTGACTCAACTGCCACGTCAGGTAAAACCAAGGATAAAACCGTCTAACGACTTAG AGTGATCTGGTTTTGTAAGTTAAGAGATGCATATATATATATATATCTGTTTTTTTCGGTTTATGAACGATTTTG TAACTCGGCGGTAAGATGAGGGACCTCCGGTATACCTTTTCCCGTCAAGTTGAAGCTCGGCCCACTGCTTGCTTC TTGGCGGCCCATATGCAGAACTAATGGTTTGGTCGTTGTTCGTCAAATCAAAACTACTCCAGGTGGCATGGATTT CGTTGACAACAAGAGAAAACGACAAGGCGCACCAGCTAGCTGGAGACCACCAAATCTAATCATGCAGTACGAGCG CCAGTGGTCAACCAGAGATGAAAAGACACGAGTCCTCAGATCGATTGCCTTCTCTCGAAGCTTCCGTAATCCAAA CTGAAGTGCTCTGCATGGACTCATCTCTGCATGCATTCCATCCTACAGATTTACCTACATTGGCTCACACGCCCC AACATGATCGAATACGTCACACTCGTGCGTTCAATCGATTGGAAGCTAGCTAGCCGTGTTTAGTGGATCGAATGA TCGACGTACGATTGATCGATCGGTACGTACATGGGTTGATCAGCTCGGTCCGGTCTGCCTTACGTACGTGTCGCT CGGATTGCTGAGGAGAGCGCGCCCAAATCTGCGGGACAGGCCGGATTGCTCCACTACGCGACGCCCTCCGCCGGC CGCGGCCACAACCTCGCGACACCGACGCAAATCCCACTAAAACCTTACGACACGACGAGCCGCGCTAGCTACCGC ACGCATGCGTACCACCACAACCGCGCGCGCTCCCTATAAATTTCACCGCTAAATCCCACCACGAACTCATCAATC CATCAAGC
[0019]需要说明的是:上述启动子的DNA序列中，序列开头以斜体并加粗表示的序列“TACGACCGATGTCCTATGGCTA”为获得启动子过程中使用的正向引物的留存序列，共计21bp ；序列末尾以斜体并加粗表示的序列“CGAACTCATCAATCCATCAAGC”为获得启动子过程中使用的反向引物的留存序列(该留存序列与反向引物的相应序列互补)，共计22bp ；该DNA序列中剩余的部分则为获自日本晴水稻中的DNA序列。需要强调的是，本文中所提到的启动子既可以指上述整个DNA序列， 也可以指去除上述引物留存序列后的DNA序列。
[0020]综上,本申请的发明人从日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)中分离克隆得到结构包括转录起始位点在内的1804bp的DNA序列，并将其命名为POsvasU序列表中的SEQ ID No:1)。将该序列经酶切后连接到植物双元表达载体PCAMBIA1391上获得相应的重组质粒(即重组表达载体)，利用该重组质粒转化根癌农杆菌菌株EHA105，然后用农杆菌介导的方法进行水稻的转化，得到转基因水稻植株。对获得的转基因水稻进行组织化学检测发现，转基因植株整体上的Gus基因表达水平相对较低，仅在维管束处显蓝色，从而证明该1804bp的序列具有驱动基因表达的活性，而且该启动子驱动的Gus基因在水稻维管束中特异性表达。
[0021]本发明所述的启动子序列可与植物双元表达载体连接，用于取代组成型启动子。并且，该启动子序列可以与所需的靶标基因链接，构建重组植物表达载体，经转化后可驱动靶标基因在维管束中的特异性表达，从而提高外源靶标基因在植物维管束中的表达量，增加转基因的效果。
[0022]技术效果
[0023]本发明所克隆的水稻启动子POsvasl能够调控基因在维管束中集中表达，在实际应用中具有显著价值。通过该启动子对农作物品种进行基因改造，如通过该启动子调控目标基因在维管束中特异性表达，将有助于阐明水稻运流的生理机制，为水稻高产奠定生理基础。由于其具有在维管束中特异性表达的特征，可用其代替35S等组成型启动子，从而培育出理想的生物安全性高的转基因植物品种。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中:
[0025]图1A-1B为将POsvasl启动子构建于pCAMBIA1391载体质粒中的示意图，其中图1A为pCAMBIA1391示意图，图1B为pCAMBIA1391_P0svasl示意图，其中示出了利用POsvasl启动子驱动位于其下游的GUS基因表达；
[0026]图2为利用POsvasl启动子驱动Gus基因表达的结果不意图，不出了水稻各部位Gus染色结果，其中图中的a表示叶片组织染色30分钟后，GUS在维管束部分表达；b表示茎组织染色30分钟后，⑶S在维管束部分特异表达；c表示胚乳和胚组织经48小时染色，仍没有⑶S染色；d表示根组织经48小时染色，仍没有⑶S染色(标尺=20mm)。
[0027]图3为对POsvasl启动子进行酶切验证的结果示意图。
【具体实施方式】
[0028]以下参照附图来说明本发明的具体实施例。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
[0029]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
[0030]含有酶切位点的POsvasl启动子的获得
[0031]步骤1、引物的设计
[0032]根据NCBI中提供的水稻品种日本晴(Oryza sativa L cv.Nipponbare)全基因组序列，依据水稻POsvasl基因的序列设计扩增引物，并根据选用的载体及靶标基因的特点，设计引物的酶切位点。
[0033]本实施例中以水稻双元表达载体pCAMBIA1391 (图1A，来自于CAMBIA，公开使用载体，安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)为例，靶标基因为Gus基因，具体设计的引物为:正向引物(SEQ ID No:2)5’端带Sail，酶切位点(GTCGAC)，
[0034]反向引物(SEQ ID No: 3) 5，端带E.coRI，酶切位点(GAATTC)，引物序列如下:
[0035]正向引物:GTCGACTACGACCGATGTCCTATGGCTASail
[0036]反向引物:GAATTCGCTTGATGGATTGATGAGTTCGE.coRI
[0037]由深圳华大基因公司合成。
[0038]步骤2、启动子POsvasl的获得
[0039]以水稻品种日本晴DNA为模板，利用正向引物、反向引物扩增启动子POsvasl，按常规PCR体系，采用如下扩增程序:
[0040]95°C 预 变性 5min ;95°C变性 30s，58°C退火 30s，72°C 延伸 2min30s，35 个从 95°C 预变性到72°C延伸的循环；最后72°C延伸lOmin。[0041]回收PCR扩增的目的片段，目的片段长度1804bp，将该片段连接到PGEM-T-Easy载体(购自Promega公司，按载体说明书中的比例混合)上,按照热激法转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞后，使感受态细胞激活，进而将目的片段转入到激活的感受态细胞中，然后，经菌落PCR筛选获得阳性克隆，挑取单克隆摇菌液提质粒，用SalI和E.coRI进行双酶切验证，如图3所示。经过鉴定的阳性克隆送交Invitrogen公司进行测序。验证正确的克隆即为所要获得的启动子POsvasl,其核酸序列如SEQ ID No:l所示。
[0042]植物表达载体的构建和农杆菌的转化
[0043]从上述“启动子POsvasl的获得”过程中获得的阳性克隆中提取质粒，用SalI和E.coRI双酶切，回收启动子POsvasl片段。同时用SalI和E.coRI对pCAMBIA1391进行线性化处理、回收PCAMBIA1391，将上述的两个片段用T4连接酶(购于TaKaRa公司)进行连接，得到启动子POsvasl与Gus基因融合的植物表达载体pCAMBIA1391-P0svasl (图1B)，利用冻融法将表达载体转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105 (安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)，从冻融法所得产物中提取阳性质粒，用SalI和E.coRI进行酶切验证，验证结果如图3中所示。
[0044]利用启动子POsvasl驱动Gus报告基因在水稻中表达
[0045]步骤1:农杆菌介导的水稻遗传转化
[0046]成熟种子去掉颖壳后，用70%酒精浸泡种子lmin，倒掉酒精。用含有I滴Tween20的50%次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4%)溶液浸泡种子40min (150r/min)o倒掉次氯酸钠，无菌水洗5遍至溶液澄清，无次氯酸钠味道。无菌水浸泡种子过夜。用解剖刀种子的沿糊粉层将胚剥下，将胚接种于愈伤诱导培养基上。30°C下暗培养11天后将愈伤与胚乳及胚芽分离，将去芽的状态良好、分裂旺盛的初级愈伤组织进行预培养3~5天后用于农杆菌转化。
[0047]采用上述“植物表达载体的构建和农杆菌的转化”过程中转入了重组表达载体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，该遗传转化、转化子筛选及转基因植株再生等参照 Yongbo Duan (Yongbo Duan, Chenguang Zhai, et al.An efficient andhigh-throughput protocol for Agrobacterium mediated transformation based onphosphomannose isomerase positive selection in Japonica rice (Oryza sativa L.)[J], Plant Cell Report, 2012.D0I10.1007/s00299-012-1275_3.)等提出的方法。
[0048]共获得38 株 P0svasl_pCAMBIA1391 植株(POsvasI::gus 转基因水稻植株)。
[0049]步骤2、⑶S组织化学染色
[0050]参照Jefferson (Jefferson RA 等人.GUS fusion: β -Glucuronidase as asensitive and versatile gene fusion marker in higher plant[J].EMBO J.,1987,6:3901-3907)等提出的方法，将需要染色的组织抽真空，然后浸入染色液中，37°C染色24小时。脱色时在37°C条件下用95%乙醇处理，至阴性对照材料呈白色。
[0051]通过⑶S组织染色，检测启动子POsvasl在水稻转基因植株中对⑶S的启动活性。结果显示，POsvasI::gus转基因 水稻种子的维管束经⑶S染色后呈现蓝色，而其它部分组织无染色。如图2所示，结果说明，启动子POsvasl能够驱动Gus基因在水稻维管束中特异性高水平的表达。
[0052]以上对本发明【具体实施方式】的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变 或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。
【权利要求】
1.一种植物维管束特异性表达启动子，其特征在于，所述植物维管束特异性表达启动子包含SEQ ID No:1所示的DNA序列。
2.根据权利要求1所述的植物维管束特异性表达启动子，其特征在于，所述植物维管束特异性表达启动子的DNA序列为SEQ ID No:1所示的序列。
3.根据权利要求1所述的植物维管束特异性表达启动子，其特征在于，所述植物维管束特异性表达启动子的DNA序列与SEQ ID No:1所示的DNA序列有至少80%同源性； 或者，所述植物维管束特异性表达启动子为在SEQ ID No:1所示的DNA序列中添加、取代、插入或缺失一个或一个以上核苷酸生成的突变体或等位基因或衍生物； 或者，所述植物维管束特异性表达启动子为与SEQ ID No:1所示的DNA序列杂交后的产物。
4.一种包含权利要求1-3中任意一项所述的植物维管束特异性表达启动子的表达盒。
5.—种重组表达载体,其特征在于,所述重组表达载体包含根据权利要求1-3中的一项所述的植物维管束特异性表达启动子。
6.根据权利要求6所述的重组表达载体，其特征在于，在所述重组表达载体中，所述的植物维管束特异性表达启动子连接于植物双元表达载体PCAMBIA1391的待表达的基因序列的上游， 其中，所述待表达的基因为Gus基因； 所述重组表达载体为pCAMBIA1391-POsvasl。
7.—种宿主菌，其特征在于，所述宿主菌包含根据权利要求1-3中任意一项所述的植物维管束特异性表达启动子、根据权利要求4所述的表达盒、或者根据权利要求5或6所述的重组表达载体，优选地，所述宿主菌为根癌农杆菌。
8.一种转化子，其特征在于，所述转化子包含根据权利要求1-3中任意一项所述的植物维管束特异性表达启动子、根据权利要求4所述的表达盒、根据权利要求5或6所述的重组表达载体、或者根据权利要求7所述的宿主菌。
9.一种根据权利要求1-3中的一项所述的植物维管束特异性表达启动子在培育转基因植物中的应用，其特征在于，所述应用包括:将所述的植物维管束特异性表达启动子连接于载体的待表达的基因序列上游，从而构建重组表达载体，并且将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用用于改良植物维管束性状，所述植物为水稻，所述待表达的基因为Gus基因；所述重组表达载体为pCAMBIA1391-POsvasl。
【文档编号】C12R1/01GK103740719SQ201310751853
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年12月30日 优先权日:2013年12月30日
【发明者】魏鹏程, 杨剑波, 秦瑞英, 许蓉芳, 张银萍, 李莉, 李 浩, 杨亚春, 宋丰顺, 马卉, 倪大虎 申请人:安徽省农业科学院水稻研究所