定制油的制作方法

定制油的制作方法
【专利摘要】重组DNA技术被用于制造产油重组细胞，这些细胞产生了具有所希望的脂肪酸谱和区域特异性或立体特异性谱的三酸甘油酯油。所操作的基因包括了编码硬脂酰基-ACP去饱和酶、Δ12脂肪酸去饱和酶、酰基-ACP硫酯酶、酮酰基-ACP合酶及溶血磷脂酸酰基转移酶的那些。所产生的油可以具有增强的氧化或热稳定性，或可以适用作一种油炸油、起酥油、包入起酥油、回火脂肪、可可脂替代品、作为一种润滑剂或作为不同化学工艺的一种原料。该脂肪酸谱可以富集中链谱或该油可以富集饱和-不饱和-饱和型三酸甘油酯。
【专利说明】定制油 相关申请的交叉引用
[0001] 本申请依据35USC119(e)要求以下各案的权益：2012年4月18日提交的美国临 时专利申请号61/635, 285、2012年4月27日提交的美国临时专利申请号61/639, 838、2012 年6月4日提交的美国临时专利申请号61/655,469、2012年7月16日提交的美国临时专 利申请号61/672, 196、2012年8月2日提交的美国临时专利申请号61/679,026、2012年10 月19日提交的美国临时专利申请号61/715, 998、2013年2月26日提交的美国临时专利申 请号61/769,678、2013年3月13日提交的美国临时专利申请号61/778,963及2013年4 月5日提交的美国临时专利申请号61/809, 213,所有这些的相关部分都通过引用结合，条 件是在此术语的定义应当是完整的且控制性的定义。 序列表的引用
[0002] 本申请包括在详细说明的最后所显示的序列表。 发明领域
[0003] 本发明的实施例涉及油/脂肪、燃料、食品及油脂化学品，以及由基因工程改造的 细胞的培养物对其进行的制造。具体实施例涉及具有高三酸甘油酯含量并且在甘油主链上 带有呈特定区域特异性模式的脂肪酰基的油、高度稳定的油、具有高油酸或中链脂肪酸水 平的油以及由这些油制造的产品。 发明背景
[0004] PCT 公开 TO 2008/151149、W0 2010/06032、W0 2011/150410、W0 2011/150411、W0 2012/061647及WO 2012/106560披露了多种油以及在微生物（包括微藻）中制造那些油的 方法。这些公开还描述了这些油用于制备油脂化学品和燃料的用途。
[0005] 回火是通过操作脂肪或含脂肪物质的温度来将该脂肪转化成所希望的多形性形 式的一种方法，常用于巧克力制造中。
[0006] 脂肪酰基-CoA延长路径的某些酶起到了延伸脂肪酰基-CoA分子的长度的作用。 延长酶-复合物酶通过增加2个碳使脂肪酰基-CoA分子延伸，例如肉豆蘧酰基-CoA变为 棕榈酰基-CoA、硬脂酰基-CoA变为花生酰基-CoA，或油酰基-CoA变为二十烷酰基-CoA， 二十烷酰基-CoA变为芥酰基-CoA。此外，延长酶还使酰基链长度以2个碳的增量延伸。 KCS酶使酰基-CoA分子与来自丙二酰基-CoA的两个碳缩合以形成β -酮酰基-CoA。KCS 和延长酶可以对于使具有特定碳长度的酰基底物缩合、修饰（如羟基化）或饱和程度显示 出特异性。举例来说，已经证实，荷荷巴（油蜡树）β-酮酰基-CoA合酶偏好单不饱和及饱 和C18-C 〇A和C20-C〇A底物以提高转基因植物中芥酸的产量（拉丝纳（Lassner)等，《植物 细胞》(Plant Cell)，1996,第8 (2)卷，第281-292页），而布氏锥虫的特定延长酶则对延长 短链和中链饱和CoA底物显示出偏好（李（Lee)等，《细胞》（Cell)，2006,第126(4)卷，第 691-9 页）。
[0007] II型脂肪酸生物合成路径采用了由多种可溶性蛋白质催化的一系列反应，其中间 物在多种酶之间穿梭，如酰基载体蛋白（ACP)的硫酯。相比之下，I型脂肪酸生物合成路径 使用了单一较大的多功能多肽。
[0008] 产油的非光合作用藻类桑椹型无绿藻在营养碳供应过量的条件下储存大量的三 酰基甘油酯，但由于其他必需养分的限制，细胞分裂受到抑制。碳链长度多达C18的脂肪酸 的大量生物合成是在质体中发生；然后，脂肪酸被输出到内质网，相信（如果它发生的话） 在其中发生了延长超过C18以及结合到三酰基甘油酯（TAG)中。脂质被储存在较大的胞质 细胞器中，称为脂质体，直到环境条件变为有利于生长，此时，它们被动员起来以为合成代 谢提供能量和碳分子。 发明概述
[0009] 在一个方面，本发明提供一种产油的微藻细胞，该细胞任选地包含与SEQ ID NO:76具有至少65%核苷酸序列一致性的23S rRNA，任选地为专性异养的，并且任选地包 含一个外源蔗糖转化酶基因，以使得该细胞能够以蔗糖作为唯一碳源进行生长，其中该细 胞包含了编码一种活性LPAAT酶的一个外源基因，并且该细胞产生一种包含三酸甘油酯的 油，其中由于该LPAAT活性，该油：(a)富集了含中链脂肪酸的三酸甘油酯；或（b)富集了饱 和-不饱和-饱和型三酸甘油酯。
[0010] 在一些情形中，该油的三酸甘油酯包含了 40%、50%、60%、70%或80%或更多的 C8:0、C10:0、C12:0、C14:0或C16:0脂肪酸。在一些情形中，该细胞另外包含了编码一种活 性FATB酰基-ACP硫酯酶的一个外源基因。在一些情形中，该油的三酸甘油酯由于该外源 LPAAT和酰基-ACP硫酯酶的表达而使中链脂肪酸富集超过70%。在一些情形中，该细胞另 外包含了可操作以编码一种外源KAS I或KAS IV酶的重组核酸，用以减少一种内源KAS I 酶的活性。在一些情形中，该细胞另外包含多种核酸，这些核酸可操作以任选地经由一个可 调控启动子减少一种Λ 12脂肪酸去饱和酶的表达，由此产生了亚油酸和亚麻酸的面积百 分比总计为5%或更低（通过FAME GC/FID)的一种油。在一些情形中，该油富集该饱和-不 饱和-饱和型三酸甘油酯。在一些情形中，该油富集S0S、P0S和/或POP。在一些情形中， 该油包含了含至少50%的SOS和任选地不到10%的SSS的三酸甘油酯。
[0011] 在一些情形中，该细胞另外包含一种硬脂酰基-ACP去饱和酶基因、FatA基因或两 者的敲除或敲减。在一些情形中，该细胞另外包含了可操作以增加 β-酮酰基CoA合酶活 性的重组核酸。在一些情形中，这些可操作以增加 β-酮酰基活性的核酸包含了编码一种 β -酮酰基CoA合酶的一个外源基因。
[0012] 在一些情形中，油中硬脂酸酯与油酸酯的比率为3:1 ±20%。在一些情形中，该油 中P0P、S0S及POS总计占至少30%。在一些情形中，该油包含至少30%的P0S。在一些情 形中，该油包含16% ±20%的P0P、38% ±20%的POS及23% ±20%的S0S。在一些情形 中，该油的脂肪酸谱包含1%到4%的花生酸。
[0013] 在一些情形中，该细胞另外包含多种核酸，这些核酸可操作以任选地经由一个可 调控启动子减少一种Λ 12脂肪酸去饱和酶的表达，由此产生了亚油酸和亚麻酸的面积百 分比总计为5%或更低的一种油。在一些情形中，该油具有超过65%的S0S、不到45%的不 饱和脂肪酸、不到5%的多不饱和脂肪酸、不到1%的月桂酸及不到2%的反式脂肪酸。
[0014] 在一些情形中，该LPAAT具有SEQ ID NO:78或SEQ ID NO:79的氨基酸序列或与 SEQ ID N0:78或SEQ ID N0:79具有至少95%-致性的一个序列。
[0015] 在另一个方面，本发明提供了一种用于制造油的方法，包括了提供或培养一种如 以上所论述的细胞，并提取该油，其中该细胞任选地进行异养培养。
[0016] 在另一个方面，本发明提供了一种通过以上论述的方法制造的油，该油包含三酸 甘油酯。在一些情形中，该油包含以下各项中的一种或多种：至少10%的麦角固醇；麦角固 醇和b-谷固醇，其中麦角固醇与b-谷固醇的比率超过25:1 ;麦角固醇和菜籽固醇；麦角固 醇、菜籽固醇及多孔固醇，并且该油任选地不含以下各项中的一种或多种：β -谷固醇、菜 油固醇及豆固醇。
[0017] 在一些情形中，该油形成β多形性晶体。在一些情形中，这些晶体具有一种2L的 层状结构。在一些情形中，这些晶体具有一种3L的层状结构。
[0018] 在一些情形中，该油形成β '多形性晶体。在一些情形中，这些晶体具有一种2L 的层状结构。在一些情形中，这些晶体具有一种3L的层状结构。
[0019] 在一些情形中，其中该油的三酸甘油酯具有一种脂肪酸谱，其特征在于，硬脂酸酯 和棕榈酸酯的百分含量的总和等于油酸酯的百分含量乘以2. 0+/-40%。在一些情形中，该 油具有超过65%的SOS三酸甘油酯、不到45%的不饱和脂肪酸、不到5%的不饱和脂肪酸、 不到1 %的月桂酸及不到2%的反式脂肪酸。在一些情形中，该油的脂肪酸谱中硬脂酸酯和 棕榈酸酯的百分比的总和是油酸酯的百分含量的两倍，±20%。在一些情形中，该油的sn-2 谱具有至少40 %的油酸酯。在一些情形中，该油为至少40 %、50 %、60 %、70 %、80 %或90 % 的 S0S。
[0020] 在一些情形中，该油是一种包入（roll-in)起酥油，具有一种介于30°C与40°C之 间的熔融温度。在一些情形中，该油包含β'多形性晶体。在一些情形中，该油在35°C具 有一种不到15%的固体脂肪含量。在一些情形中，该油包含15%到20%的C8到C14脂肪 酸、45% -50%的C16和更高级脂肪酸，和/或30% -25%的不饱和脂肪酸。
[0021] 在另一个方面，本发明提供一种使用以上论述的油制造的食品、燃料或化学产品。
[0022] 在另一个方面，本发明提供了一种天然油或由一种天然制造的RBD油，其中该油 包含3. 5%或更少的饱和脂肪酸，并且任选地包含超过50%的油酸和/或超过1 %的棕榈油 酸。在一些情形中，该油具有介于0.1%与3. 5%之间的饱和脂肪酸。在一些情形中，该油 包含至少90%的油酸。在一些情形中，该油包含至少3 %的多不饱和脂肪酸。
[0023] 在另一个方面，本发明提供一种产油细胞，该细胞任选地包含与SEQ ID NO:76具 有至少65%核苷酸序列一致性的23S rRNA，并且任选地为专性异养的，其中该细胞产生了 一种包含3. 5%或更少饱和脂肪酸的油。
[0024] 在一些情形中，该细胞是一种任选地属于无绿藻属的微藻细胞。在一些情形中，该 细胞另外包含一种FATA的敲除或敲减。在一些情形中，该细胞包含一个外源基因，该基因 编码一种具有使棕榈酰基（Palmitoyl)-CoA去饱和成为棕榈油酰基（Plamitoyl)-CoA的活 性的酶。在一些情形中，该外源基因是一个PAD基因。在一些情形中，该外源基因是一个对 棕榈酰基-ACP具有去饱和酶活性的SAD基因。在一些情形中，该细胞另外包含一种过表达 的KAS II酶。
[0025] 在一些情形中，该细胞另外包含多种核酸，这些核酸可操作以任选地经由一个可 调控启动子减少一种Λ 12脂肪酸去饱和酶的表达，由此产生了亚油酸和亚麻酸的面积百 分比总计为5%或更低的一种油。
[0026] 在另一个方面，本发明提供了一种由以上论述的细胞产生的油，该油任选地进行 精炼、漂白并且除臭，其中该油包含以下各项中的一种或多种：至少10%的麦角固醇；麦角 固醇和b-谷固醇，其中麦角固醇与b-谷固醇的比率超过25:1 ;麦角固醇和菜籽固醇；以 及麦角固醇、菜籽固醇及多孔固醇，并且其中该油任选地不含以下各项中的一种或多种： β -谷固醇、菜油固醇及豆固醇。
[0027] 在另一个方面，本发明提供了一种用于制造具有3. 5%或更少饱和脂肪酸的油的 方法，其中该方法包括了提供或培养一种如以上或在此所论述的细胞，并且从该细胞提取 该油。
[0028] 在另一个方面，本发明提供了一种用于制造食品的方法，其中该方法包括了将由 以上或在此所论述的方法制造的一种油并入该食品中，其中最终的食品具有3. 5%或更少 的饱和脂肪。
[0029] 在另一个方面，本发明提供一种重组产油细胞，该细胞任选地包含与SEQ ID NO: 76具有至少65%核苷酸序列一致性的23S rRNA，并且任选地为专性异养的，其中该细 胞包含了编码一种活性酮酰基-CoA合酶的一个外源基因。
[0030] 在一些情形中，该细胞产生了一种包含超过20%的芥酸的油。在一些情形中，该细 胞产生了一种包含超过60%的芥酸的油。在一些情形中，该油包含至少40%的油。在一些 情形中，该细胞属于无绿藻属，并且任选地属于桑椹型无绿藻种类。在一些情形中，由该细 胞产生的油包含以下各项中的一种或多种：至少10%的麦角固醇；麦角固醇和b-谷固醇， 其中麦角固醇与b-谷固醇的比率超过25:1 ;麦角固醇和菜籽固醇；及麦角固醇、菜籽固醇 及多孔固醇，并且该油任选地不含以下各项中的一种或多种：β -谷固醇、菜油固醇及豆固 醇。
[0031] 在另一个方面，本发明提供了一种由以上论述的油制造的化学品。
[0032] 在另一个方面，本发明提供了一种用于制造油的方法，其中该方法包括了提供或 培养一种如以上所论述的细胞，并且从该细胞提取一种油。
[0033] 在另一个方面，本发明提供了一种重组产油细胞，该细胞包含多种重组核酸，这些 核酸可操作以抑制一种△ 12脂肪酸去饱和酶基因产物的活性，以使得该细胞产生了具有 不到5%亚油酸的一种三酰基甘油谱的一种油。在一些情形中，该细胞产生了具有不到3% 亚油酸的一种三酰基甘油谱的一种油。在一些情形中，该细胞产生了具有不到2%亚油酸的 一种三酰基甘油谱的一种油。
[0034] 在一些情形中，该细胞为一种亚油酸营养缺陷体或该Λ 12脂肪酸去饱和酶的活 性可以经由环境条件进行抑制，由此产生该油。在一些情形中，归因于与该△ 12脂肪酸去 饱和酶基因可操作连接的一个可调控启动子，该△ 12脂肪酸去饱和酶是经由环境条件可 调控的。在一些情形中，该可调控启动子是通过培养基PH或氮水平的改变可调控的。
[0035] 在一些情形中，该细胞另外包含了可操作以表达一种外源KAS II、LPAAT或FATB 酶的重组核酸。在一些情形中，该细胞另外包含了可操作以使一种硬脂酰基ACP去饱和酶 的表达敲除或敲减的重组核酸。在一些情形中，该细胞另外包含了可操作以使一种内源 FatA编码的酰基-ACP硫酯酶的表达敲除或敲减的重组核酸。
[0036] 在一些情形中，该油在IKTC下是稳定的，以使得在AOCS Cdl2b_92兰奇马特测试 (Rancimat test)的条件下，到20小时的时候仍未到达电导率的拐点。在一些情形中，该油 在IKTC下是稳定的，以使得当向该油中添加 1050ppm的生育酚和500pm的抗坏血酸棕榈酸 酯时，在该AOCS Cdl2b-92兰奇马特测试条件下，到5天时仍未到达电导率的拐点。
[0037] 在另一个方面，本发明提供了一种方法，包括：(a)提供一种重组产油细胞，该细 胞任选地包含与SEQ ID NO:76具有至少65%的核苷酸序列一致性的23S rRNA，任选地为 专性异养的，其中该细胞包含了多种重组核酸，这些核酸可操作以响应于一种环境条件的 一种变化而改变由该细胞产生的一种脂肪酸的量；(b)在容许该脂肪酸的合成的一种第一 环境条件下培养该细胞，由此允许细胞分裂并增加细胞数量；（c)在一种第二环境条件下 培养该细胞，由于这些重组核酸，该条件使该脂肪酸合成减少并由此使由该细胞产生的一 种油中脂肪酸的量减少；并且（d)从该细胞提取该油。
[0038] 在一些情形中，该细胞包含多种外源核酸，这些核酸可操作以降低一种Λ 12脂肪 酸去饱和酶的活性，由此减少该油中亚油酸的量。在一些情形中，该油中亚油酸减少至少 50%、60%、70%、80% 或 90%。
[0039] 在一些情形中，该细胞是异养地培养的。在一些情形中，这种细胞是一种微藻细 胞。在一些情形中，该细胞产生了以干细胞重量计至少40 %、50 %、60 %、70 %、80 %或90 % 的油。
[0040] 在一些情形中，该第一环境条件是一种第一 pH的培养用培养基并且该第二环境 条件是一种第二pH的培养用培养基。
[0041] 在一些情形中，当从该细胞提取时，该油在IKTC下是稳定的，以使得在AOCS Cdl2b-92兰奇马特测试的条件下，到20小时的时候仍未到达电导率的拐点。在一些情形 中，当从该细胞提取时，该油在IKTC下是稳定的，以使得当向该油中添加1050ppm的生育 酚和500pm的抗坏血酸棕榈酸酯时，在该AOCS Cdl2b-92兰奇马特测试条件下，到5天时仍 未到达电导率的拐点。
[0042] 在一些情形中，该细胞包含了编码一种KAS II酶的一种外源基因并且任选地具有 一个FatA基因的敲除或敲减。在一些情形中，可操作以改变该细胞所产生的一种脂肪酸的 量的这些重组核酸包含了靶向一个FAD基因的一种抑制性RNA，该抑制性RNA的产生是处于 一个可调控启动子的控制下。
[0043] 在一些情形中，该油以具有超过60%的油酸和不到3%的多不饱和物的一种脂肪 酸谱为特征。在一些情形中，该油以具有超过70%的油酸和不到2%的多不饱和物的一种 脂肪酸谱为特征。在一些情形中，该油以具有超过80%的油酸和不到1 %的多不饱和物的 一种脂肪酸谱为特征。
[0044] 在另一个方面，本发明提供了一种通过以上论述的方法制造的油。在一些情形中， 该油包含0.01 %到2%的亚油酸以及（i)80%到95%的油酸或（ii)超过40%的C8、C10、 C12、C14或C16脂肪酸。在一些情形中，该油另外包含以下各项中的一种或多种：至少10% 的麦角固醇；麦角固醇和β-谷固醇，其中麦角固醇与β-谷固醇的比率超过25:1 ;麦角固 醇和菜籽固醇；以及麦角固醇、菜籽固醇及多孔固醇。
[0045] 在另一个方面，本发明提供了一种由以上论述的油制造的产品。在一些情形中，该 产品为一种食品、燃料或化学品。在一些情形中，该产品是一种油炸油、润滑油、清洁溶剂、 表面活性剂、泡沫材料或润滑剂。在一些情形中，该产品是一种油酸二聚物。
[0046] 在另一个方面，本发明提供了一种构建体、载体、染色体或宿主细胞，包含了编码 与SEQ ID Ν0:77到79具有至少90%-致性的一种蛋白质的核酸。在一些情形中，这些核酸 编码与SEQ ID N0:77到79具有至少95%-致性的一种蛋白质。在一些情形中，这些核酸 编码与SEQ ID N0:77到79具有至少98%-致性的一种蛋白质。在一些情形中，这些核酸 由于遗传密码的简并性而与SEQ ID N0:80-85或等效序列具有至少80%、90%、95%、96%、 97%、98 %或99 %序列一致性。
[0047] 本发明的这些以及其他方面与实施例于附图（简要说明紧随其后）、本发明的详 细描述以及实例中进行了描述和/或举例说明。上文讨论和贯穿本申请的任何或所有特征 可以在本发明的多种实施例中组合。 附图简述
[0048] 图1-14示出了经过精炼、漂白并且除臭的由经过遗传工程改造的桑椹型无绿藻 品系产生的油的脂肪酸谱和熔融曲线，如实例4中所论述；
[0049] 图15示出了不同油的稳定性随抗氧化剂浓度的变化，如实例5中所论述；
[0050] 图16示出了根据本发明一个实施例，具有极低多不饱和脂肪酸水平的天然油的 不同特性；并且
[0051] 图17示出了如下所示的不同油的固体脂肪含量％的曲线：(a)未进行脂质路径 工程改造的桑椹型无绿藻RBD油；(b)巴西可可脂+25%乳脂；（c)由表达发夹核酸的品系 得到的桑椹型无绿藻RBD油的三个重复试样，这些核酸使SAD等位基因水平降低，由此减 少TAG谱中的油酸并增加硬脂酸；（d)由过表达内源OTE(油酰基酰基-ACP硫酯酶，参看 实例45)的品系得到的桑椹型无绿藻RBD油；（e)马拉西亚可可脂+25%乳脂；及（f)马拉 西亚可可脂。该可可脂和可可脂乳脂值是文献值（《贝雷工业油与脂肪产品》（Bailey' s Industrial Oils and Fat Products),第 6 版）。
[0052] 图18示出了与大豆甲基酯对照样品相比较，针对由异养地生长的产油微藻制备 的高油酸（HO)和高稳定性高油酸（HSAO)三酸甘油酯油所制备的甲基化油进行的热稳定性 测试的结果。
[0053] 图19示出了高油酸和高稳定性高油酸藻类油的不同特性。
[0054] 图20示出了来自烧瓶和发酵罐生物质的S4495、S5665及S5675油的TAG组成。 1^=月桂酸酯（(：12 :0)^=肉豆蘧酸酯（(：14:0)，？=棕榈酸酯（(：16:0)，？ 〇=棕榈油酸酯 (〇16:1)，3=硬脂酸酯（(：18:0)，0=油酸酯（(：18 :1)，1^=亚油酸酯（(：18:2)，1^=1亚 麻酸酯（C18:3)，A =花生酸酯（C20:0)，B =山嵛酸酯（C22:0)，Lg =木蜡酸酯（C24:0)，Hx =二十六烷酸酯（C26:0)，S-S-S是指全部三个脂肪酸都饱和的TAG的总和。在条形的每个 区块中，这些品系是以该图底部处所说明的次序示出。
[0055] 图21示出了来自摇瓶生物质的S5774、S5775及S5776油的TAG组成。La =月桂酸 酯（(：12:0)肩=肉豆蘧酸酯（(：14:0)』=棕榈酸酯（(：16:0)，？ 〇=棕榈油酸酯（(：16:1)，5 = 硬脂酸酯（C18:0)，0=油酸酯（C18:1)，L=亚油酸酯（C18:2)，Ln= α-亚麻酸酯（C18:3)， A=花生酸酯（C20:0)，B=山嵛酸酯（C22:0)，Lg=木蜡酸酯（C24:0)，Hx=二十六烷酸酯 (C26:0)。S-S-S是指全部三个脂肪酸都饱和的TAG的总和。在条形的每个区块中，这些品 系是以该图底部处所说明的次序示出。
[0056] 图22示出了经过精炼、漂白并且除臭的由遗传工程改造的桑椹型无绿藻品系产 生的富含肉豆蘧酸酯的脂肪酸谱和固体脂肪含量，如实例52中所论述。
[0057] 图23示出了在Z品系中表达的异源FAE蛋白的成对比对。 发明的详细说明 I.定义
[0058] "等位基因"是与一种性状或特征相关的基因的一种或多种替代形式中的任一种。
[0059] "天然油"或"天然脂肪"应当是指从有机体获得的主要含三酸甘油酯的油，其中该 油未经历与另一种天然油或合成油掺混，或分馏以实质上改变该三酸甘油酯的脂肪酸谱。 结合一种包含了具有特定区域特异性的三酸甘油酯的油，该天然油或天然脂肪未经历酯交 换或其他合成工艺以致未获得该区域特异性三酸甘油酯谱，而是由一个细胞或细胞群天然 地产生区域特异性。结合天然油或天然脂肪，并且如本披露通篇总体上所使用，术语油和脂 肪可互换地使用，除非另作注释。因此，"油"或"脂肪"取决于该物质的组成和其他条件，在 室温下可以是液体、固体或部分固体的。在此，术语"分馏"表示以相对于由有机体所产生 的谱而改变其脂肪酸谱的方式来从该油去除物质，不管用何种方法完成。术语"天然油"和 "天然脂肪"包括如从有机体获得的油，其中该油已经历最低限度的不实质上改变其三酸甘 油酯谱的加工，包括精炼、漂白和/或脱胶。天然油还可以是"非酯交换的天然油"，表示该 天然油未经历这样一种加工，其中脂肪酸与甘油的酰基连接被重新分布且基本上保持了与 从有机体中回收时相同的构型。
[0060] "外源基因"应当是指已经被引入到细胞中（例如通过转化/转染）的编码RNA和 /或蛋白质的表达的一种核酸，并且还被称为"转基因"。包含外源基因的细胞可以被称为重 组细胞，可以向其中引入另外的外源基因。相对于正在转化的细胞，外源基因可以来自不同 的物种（并因此是异源的），或来自相同的物种（并因此是同源的）。因此，外源基因相对 于该基因的内源副本，可以包括占据了细胞基因组中不同位置或处于不同控制下的同源基 因。外源基因可以在细胞中以多于一个副本存在。外源基因可以在细胞中作为基因组（核 或质体）中的插入序列或作为游离型分子来维持。
[0061] "脂肪酸"应当是指甘油脂中的游离脂肪酸、脂肪酸盐或脂肪酰基部分。应了解 的是，甘油脂的脂肪酰基可以根据三酸甘油酯水解或皂化时产生的羧酸或羧酸阴离子来描 述。
[0062] "固定碳源"是在环境温度和压力下以固体或液体形式存在于培养基中的含碳分 子，典型地是有机分子，它可以被该培养基中所培养的微生物利用。因此，二氧化碳不是固 定碳源。
[0063] "处于可操作连接"是在两个核酸序列（如控制序列（典型地是启动子）和连接的 序列（典型地是编码蛋白质的序列，也称作编码序列））之间的功能性连接。如果一个启动 子可以介导外源基因的转录，则该启动子与这个基因处于可操作连接。
[0064] "微藻"是含有叶绿体或其他质体并且任选地能够进行光合作用的微生物有机体， 或能够进行光合作用的原核微生物有机体。微藻包括不能代谢固定碳源作为能量的专性 光能自养生物，以及能够仅以固定碳源为生的异养生物。微藻包括在细胞分裂后不久与姊 妹细胞分开的单细胞有机体，如衣藻属，以及微生物，如例如，团藻属，它是由两种不同细胞 类型构成的简单多细胞光合微生物。微藻包括细胞例如小球藻属、杜氏藻属以及无绿藻 属。微藻还包括了展现出细胞-细胞粘附的其他微生物光合有机体，例如阿格门氏藻属 (Agmenellum)、鱼腥藻属、以及桑椹藻属（Pyrobotrys)。微藻还包括专性异养微生物，它们 已经丧失进行光合作用的能力，如某些双鞭甲藻属（dinof Iagellate)藻类和无绿藻属种 类。
[0065] 与重组细胞相关的术语敲减是指就基因所编码的蛋白质的产生或活性来说，该基 因已部分地受抑制（例如，约1 % -95% )。
[0066] 另外，与重组细胞相关的术语敲除是指就基因所编码的蛋白质的产生或活性来 说，该基因已完全或几乎完全地（例如，>95% )受抑制。敲除物可以通过将非编码序列同 源重组于编码序列中、基因缺失、突变或其他方法来制备。
[0067] "产油"细胞是能够天然地或通过重组或经典品系改良而产生以干细胞重量计 至少20 %的脂质的一种细胞。"产油微生物（oleaginous microbe)"或"产油微生物 (oleaginous microorganism)"是一种微生物，包括产油的微藻。产油细胞还涵盖已经去除 其一部分或全部脂质或其他内含物的细胞，并且涵盖活细胞和死细胞。
[0068] "订制油"或"订制脂肪"是形成的晶体主要具有指定的多形性结构的油或脂肪。举 例来说，订制油或订制脂肪可以具有超过50%、60%、70%、80%或90%的β或β '多形性 形式的晶体。
[0069] 与天然油有关的"谱"是在该油内特定种类或三酸甘油酯或脂肪酰基的分布。"脂 肪酸谱"是在不参考与甘油主链的连接的情况下，该油的三酸甘油酯中脂肪酰基的分布。脂 肪酸谱典型地是通过转化成脂肪酸甲酯（FAME)，随后进行气相色谱（GC)分析与火焰离子 化检测（FID)来确定。脂肪酸谱可以表示为由一种脂肪酸的曲线下面积测定的总脂肪酸 信号中该脂肪酸的一个或多个百分比。FAME-GC-FID测量值近似为这些脂肪酸的重量百分 含量。"sn-2谱"是在油中三酰基甘油酯的sn-2位置处所见的脂肪酸的分布。"区域特异 性谱"是在参考酰基连接到甘油主链的位置而不参考立体特异性的情况下三酸甘油酯的分 布。换句话说，区域特异性谱描述了在sn-1/3处相对于在sn-2处的酰基连接。因此，在区 域特异性谱中，POS (棕榈酸酯-油酸酯-硬脂酸酯）和SOP (硬脂酸酯-油酸酯-棕榈酸 酯）是进行相同地处理。"立体特异性谱"描述了在sn-1、sn-2及sn-3处酰基的连接。除 非另作指示，否则三酸甘油酯（如SOP和P0S)应被视为等效的。"TAG谱"是在参考与甘油 主链的连接，但不参考这些连接的区域特异性的性质的情况下在三酸甘油酯中所见的脂肪 酸的分布。因此，在TAG谱中，该油中的SSO百分比是SSO与SOS的总和，而在区域特异性 谱中，SSO的百分比是在不包括该油中的SOS种类的情况下计算。与FAME-GC-FID分析的 重量百分比相比，三酸甘油酯的百分含量典型地以摩尔百分含量给出；也就是在TAG混合 物中给定TAG分子的百分比。
[0070] "重组体"是因引入外源核酸或改变天然核酸而已经被修饰的细胞、核酸、蛋白质 或载体。因此，例如，重组细胞可以表达在天然（非重组）形式的细胞内没有发现的基因， 或以与非重组细胞表达这些基因不同的方式表达天然基因。重组细胞可以但不限于包括 编码基因产物或抑制元件（如降低细胞中的活性基因产物的水平的突变、敲除、反义、干扰 RNA(RNAi)或dsRNA)的重组核酸。"重组核酸"是最初在体外形成（总体来说，通过操作核 酸，例如使用聚合酶、连接酶、核酸外切酶及核酸内切酶）、使用化学合成的核酸，或另外地 呈通常未见于自然界中的形式。可以产生重组核酸，例如，以使两个或更多个核酸处于可 操作连接。因此，出于本发明的目的，分离的核酸或通过连接通常在自然界中不接合的DNA 分子在体外形成的表达载体均被认为是重组体。出于本发明的目的，一旦产生重组核酸并 将其引入宿主细胞或有机体中，这种核酸即可以使用宿主细胞的体内细胞机器（cellular machinery)进行复制；然而，这样的核酸一旦以重组的方式产生，虽然随后在细胞内复制， 但其仍被认为是重组体。类似地，"重组蛋白"是使用重组技术，即，通过表达重组核酸所产 生的蛋白质。
[0071] 如本领域中所知，术语"三酸甘油酯"、"三酰基甘油酯"及"TAG"可互换地使用。 II.综述
[0072] 本发明的说明性实施例的特征在于产油细胞，这些细胞产生改变的脂肪酸谱和/ 或甘油脂中改变的脂肪酸区域特异性分布；以及由这些细胞产生的产物。产油细胞的实 例包括了具有II型脂肪酸生物合成路径的微生物细胞，包括质体产油细胞，如产油藻类 的那些。细胞的具体实例包括绿藻门，四胞藻纲，小球藻目或小球藻科的异养或专性异养 微藻。产油微藻的实例还提供于公开的PCT专利申请WO 2008/151149、WO 2010/06032、 W02011/150410及WO 2011/150411中，包括了小球藻属和无绿藻属（一种包含专性异养生 物的属）的种类。产油细胞可以例如能够产生以细胞重量计25%、30%、40%、50%、60%、 70 %、80 %、85 %或约90 %的油，± 5 %。任选地，所产生的这些油可以具有较少的高度不饱 和脂肪酸，如DHA或EPA脂肪酸。举例来说，这些油可以包含不到5%、2%或1 %的DHA和/ 或EPA。以上提到的公开案还披露了用于培养这些细胞并提取油（尤其是从微藻细胞提取） 的方法；这些方法适用于在此披露的细胞并且有关这些传授内容通过引用结合。当使用微 藻细胞时，它们可以自养地（如果不是专性异养生物的话）或使用糖（例如葡萄糖、果糖和 /或蔗糖）在暗处培养。在此描述的任何实施例中，这些细胞可以是包含外源转化酶基因 的异养细胞，由此使这些细胞能够由蔗糖原料产生油。作为替代方案，或此外，这些细胞可 以由纤维素原料代谢木糖。举例来说，这些细胞可以被遗传工程改造成表达一个或多个木 糖代谢基因，如编码活性木糖转运蛋白、木酮糖-5-磷酸转运蛋白、木糖异构酶、木酮糖激 酶、木糖醇脱氢酶及木糖还原酶的那些。参看2012年11月15日公开的WO 2012/154626， "经过遗传工程改造的代谢木糖的微生物（GENETICALLY ENGINEERED MICROORGANISMS THAT METABOLIZE XYLOSE)"。
[0073] 产油细胞表达一个或多个编码脂肪酸生物合酶的外源基因。因此，一些实施例的 特征在于从非植物或非种子油无法获得或根本无法获得的天然油。
[0074] 产油细胞产生一种储存油，该油主要是三酰基甘油酯并且可以被储存在细胞 的储存体中。可以由细胞，通过破坏细胞并分离出油来获得粗油。WO 2008/151149、WO 2010/06032、WO 2011/150410及WO 2011/1504披露了异养培养和油分离技术。举例来 说，可以通过提供或培养这些细胞，进行干燥并压榨来获得油。如本领域中所知或如WO 2010/120939中所描述，所产生的油可以进行精炼、漂白并除臭（RBD)。粗油或RBD油可以 被用于多种食品、化学品、以及工业产品或工艺中。在回收油之后，有价值的残留生物质保 留下来。该残留生物质的用途包括了制造纸、塑料、吸收剂、吸附剂、钻井液、作为动物饲料、 用于人类营养或用于肥料。
[0075] 在此处给出三酸甘油酯（又称为"三酰基甘油酯"或"TAG"）细胞油的脂肪酸谱的 情况下，应了解的是，这是指从细胞提取的储存油的未分馏样品，该样品在已经去除磷脂的 条件下或用实质上对磷脂的脂肪酸不敏感的分析方法（例如，使用色谱法和质谱法）进行 分析。该油可以经历RBD工艺以去除磷脂，游离脂肪酸和气味对于该油中三酸甘油酯的脂 肪酸谱仅具有微小或可忽略的改变。由于这些细胞是产油的，故在一些情形中，储存油将构 成该细胞中全部TAG的大部分。以下实例1、2及8给出了用于测定TAG脂肪酸组成和区域 特异性结构的分析方法。
[0076] 从广义上分类，本发明的某些实施例包括（i)特定脂肪酸的营养缺陷体；（ii)产 生了具有较低多不饱和脂肪酸浓度的油的细胞，包括不饱和脂肪酸营养缺陷型细胞；（iii) 由于编码将脂肪酸转移到甘油或甘油酯的酶的一个或多个外源基因的表达而产生了具有 较高特定脂肪酸浓度的细胞；（iv)产生区域特异性油的细胞；及（V)对从正萼距花PSR23 新发现的编码LPAAT酶的基因进行编码的基因构建体或细胞（参看实例43)。这些实施例 还涵盖由这些细胞产生的油；在提取油之后来自这些细胞的残留生物质；由这些油制造的 油脂化学品、燃料及食品；以及培养这些细胞的方法。
[0077] 在以下任何实施例中，所用细胞任选地为具有II型脂肪酸生物合成路径的细胞， 如微藻细胞，包括异养或专性异养微藻细胞，包括归类为绿藻门，四胞藻纲，小球藻目，小 球藻科或绿藻纲的细胞，或使用合成生物学工具工程改造成具有II脂肪酸生物合成路径 (即，将II型脂肪酸生物合成的遗传机器移植到缺乏此类路径的有机体中）的细胞。在具 体实施例中，该细胞属于桑椹型无绿藻、克鲁加尼无绿藻（Prototheca krugani)、斯塔格诺 拉无绿藻（Prototheca stagnora)或饶氏无绿藻，或具有与SEQ ID N0:76具有至少65%、 70%、75%、80%、85%、90%或95%核苷酸一致性的23SrRNA序列。通过在暗处或使用专 性异养生物培养，所产生的天然油可以具有较少叶绿素或其他着色剂。举例来说，该天然油 在未实质上纯化的情况下可以具有不到100、50、10、5、1、0. 0. 5ppm的叶绿素。
[0078] 稳定碳同位素值δ 13C是相对于标准品（例如TOB，来自美国南卡罗来纳州皮迪 组（Peedee formation)的箭石的化石骨架的天然焦）的13C/12C的比率的一种表示。油的 稳定碳同位素值Sl3C(0/00)可以与所用原料的S13C值相关。在一些实施例中，这些油 衍生自异养地生长于衍生自C4植物（如玉米或甘蔗）的糖上的产油有机体。在一些实施 例中，油的 S 13C(0/00)是从-10 到-170/00 或从-13 到-160/00。
[0079] 在以下论述的具体实施例和实例中，一个或多个脂肪酸合成基因（例如，编码酰 基ACP硫酯酶、酮酰基ACP合酶、LPAAT、硬脂酰基ACP去饱和酶或在此描述的其他酶）被 合并到微藻中。已经发现，对于某些微藻来说，植物脂肪酸合成基因产物是在相应植物酰基 载体蛋白（ACP)不存在下起作用，甚至当该基因产物是需要结合ACP来起作用的酶（如酰 基-ACP硫酯酶）时。因此，任选地，微藻细胞可以利用这些基因来制备所希望的油，而不共 表达植物ACP基因。 III.脂肪酸营养缺陷体/在产油阶段期间降低脂肪酸水平至生长抑制性条件
[0080] 在一个实施例中，对细胞进行遗传工程改造以使得脂质路径基因的所有等位基因 都被敲除。作为替代方案，这些等位基因的基因产物的量或活性被敲减，由此需要补充脂肪 酸。可以产生一种带有与该基因的一个或多个等位基因同源的供体序列的第一转化构建 体。可以引入这种第一转化构建体并且随后进行选择方法，以获得以一个或多个等位基因 破坏为特征的分离品系。作为替代方案，可以产生一种第一品系，该品系被工程改造成通过 插入第一等位基因中来表达可选择标记物，由此使该第一等位基因失活。这一品系可以用 作宿主以进一步进行遗传工程改造以使脂质路径基因的其余等位基因敲除或敲减。可以通 过带有最初除去了活性的内源基因的另外的转化构建体的工程改造的表达，或通过适合异 源基因的表达，来实现内源基因的补充。补充基因的表达可以组成性地调控或通过可调控 的控制进行调控，藉此允许将表达调谐到所希望的水平，从而容许生长或产生任意营养缺 陷型条件。在一个实施例中，使用了脂肪酸营养缺陷型细胞群来筛选或选择补充基因；例 如，通过用外源脂肪合成中的酶的特定基因候选物，或相信含有这些候选物的核酸库进行 转化。
[0081] 所希望的基因的所有等位基因的敲除以及敲除的基因的补充无需依序进行。所关 注内源基因的破坏以及通过适合补充基因的组成性或可诱导表达进行的其补充可以按若 干方式进行。在一种方法中，这可以通过多种适合构建体的共转化来实现，一种破坏所关注 基因，并且另一种在适合的替代性基因座处提供补充。在另一种方法中，靶基因的除去可以 通过在可诱导启动子控制下用适合基因直接代替该靶基因来实现。以这种方式，被靶向的 基因的表达现处于可调控启动子的控制下。一种另外的方法是用外源的可诱导基因表达系 统代替一个基因的内源调控元件。依据这样一种方案，现可以取决于特定需要而开启或关 闭所关注基因。又另一种方法是产生第一品系以表达能够补充所关注基因的外源基因，然 后对这种第一品系中的所关注基因的所有等位基因进行敲除或敲减。多等位基因敲减或 敲除方法以及用外源基因补充可以用于改变工程改造的细胞的脂肪酸谱、区域特异性谱、 sn-2谱或TAG谱。
[0082] 在一个具体实施例中，重组细胞包含多种核酸，这些核酸可操作以降低内源酰 基-ACP硫酯酶的活性；例如，优先水解长度C18(例如硬脂酸酯（C18:0)或油酸酯（C18:l)) 或C8:0-C16:0脂肪酸的脂肪酰基-ACP链的FatA或FatB酰基-ACP硫酯酶。可以通过敲 除或敲减法来降低内源酰基-ACP硫酯酶的活性。敲减可以通过使用一个或多个RNA发夹 构建体、通过启动子劫持（用更低活性或可诱导启动子取代内源基因的天然启动子）或通 过基因敲除与在可诱导启动子控制下类似或相同基因的引入相结合来实现。实例34描述 了已经敲除内源脂肪酰基-ACP硫酯酶（FATAl)的两个等位基因的无绿藻属品系的工程改 造。通过外源硫酯酶的表达来补充桑椹型无绿藻FATAl的活性。实例36详述了 RNA发夹 构建体在减少无绿藻属中FATAl的表达方面的用途。
[0083] 因此，产油细胞，包括具有II型脂肪酸生物合成路径的有机体的那些，可以具有 编码酰基-ACP-硫酯酶的等位基因敲除或敲减达到如在脂肪酸补充或基因补充不存在下 消除或严重限制这些细胞的活力的程度。这些品系可以用于对表达酰基-ACP-硫酯酶转 基因的转化子进行选择。作为替代方案，或此外，这些品系可以用于完全地移植外源酰 基-ACP-硫酯酶，以得到由这些细胞产生的明显不同的脂肪酸谱。举例来说，可以完全或几 乎完全地消除FATA表达并且用产生中链脂肪酸的FATB基因代替。在具体实施例中，这些 转化子产生了具有超过50 %、60 %、70 %、80 %或90 %的辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蘧酸或棕 榈酸，或具有链长度不超过18个碳的总脂肪酸的天然油。这些细胞可能需要用更长链的脂 肪酸（如硬脂酸或油酸）进行补充，或在调控FatA基因的可诱导启动子情形中在容许生长 与限制性状态之间的环境条件转变。
[0084] 在一个实施例中，对产油细胞进行培养。这些细胞关于一种或多种类型的脂肪酸 是完全或部分营养缺陷型的（即，致命性或合成疾病的）。在补充脂肪酸情况下培养这些细 胞，由此增加细胞数量，然后使细胞能积累油（例如，以干细胞重量计达到至少40%)。作 为替代方案，细胞包含一个可调控脂肪酸合成基因，该基因可以基于环境条件以及在第一、 细胞分裂、有利于产生脂肪酸阶段期间的环境条件和在第二、油积累、不利于产生脂肪酸阶 段期间的环境条件来转变活性。在可诱导基因的情形中，可以（不限于）经由环境pH(例 如，通过使用AMT3启动子，如实例中所描述）来介导可诱导基因的调控。
[0085] 由于应用了这些补充或调控方法，可以从具有较少量的最佳细胞繁殖必需的一种 或多种脂肪酸的细胞获得细胞油。可以获得的油的具体实例包括较少硬脂酸、亚油酸和/ 或亚麻酸的那些。
[0086] 这些细胞和方法是结合以下紧接着的部分中的较低的多不饱和油以及在结合 具有较低多不饱和脂肪酸的油的实例6 (脂肪酸去饱和酶营养缺陷型）中和实例34 (酰 基-ACP硫酯酶营养缺陷型）中说明。
[0087] 同样，脂肪酸营养缺陷型可以在其他脂肪酸合成基因中制造，包括了编码SAD、 FAD、KASIII、KASI、KASII、KCS、延长酶、GPAT、LPAAT、DGAT 或 AGPAT 或 PAP 的那些。这些营 养缺陷型可以用于选择补充基因或消除这些基因的天然表达以利于所希望的外源基因，以 便改变由产油细胞产生的天然油的脂肪酸谱、区域特异性谱或TAG谱。
[0088] 因此，在本发明的一个实施例中，存在一种用于制造油/脂肪的方法。该方法包括 在生长阶段中，在容许细胞分裂的第一组条件下培养重组产油细胞，由此因脂肪酸的存在 而增加细胞数量；在油产生阶段中，在限制细胞分裂但容许耗尽脂肪酸的油产生的第二组 条件下培养该细胞；并且从该细胞提取该油，其中该细胞具有突变或外源核酸，这些核酸可 操作以抑制脂肪酸合成中的酶的活性，该酶任选地为硬脂酰基-ACP去饱和酶、△ 12脂肪酸 去饱和酶或酮酰基-ACP合酶。由该细胞产生的油可以使脂肪酸减少至少50 %、60 %、70 %、 80%或90%。该细胞可以异养地培养。该细胞可以是异养地或自养地培养的微藻细胞，并 且可以产生以干细胞重量计至少40%、50%、60%、70%、80%或90%的油。 IV.低多不饱和天然油
[0089] 在本发明的一个实施例中，由该细胞产生的天然油具有极低的多不饱和脂肪酸水 平。因此，该天然油可以具有改良的稳定性，包括氧化稳定性。该天然油在室温下可以为液 体或固体，或液体与固体油的掺混物，包括区域特异性或立体特异性油、高硬脂酸酯油，或 以下所描述的高中链油。氧化稳定性可以在确定的温度下，使用AOCS Cdl2b-92标准测试通 过兰奇马特方法测量。举例来说，OSI (氧化稳定性指数）测试可以在介于IKTC与140°C之 间的温度下执行。通过对遗传工程改造成降低一种或多种脂肪酸去饱和酶的活性的细胞进 行培养（例如，以上或在此别处所提到的任何质体微生物细胞）来产生油。举例来说，可以 对细胞进行遗传工程改造，以降低一种或多种负责将油酸（18:1)转化成亚油酸（18:2)的 脂肪酰基Λ 12去饱和酶和/或一种或多种负责将亚油酸（18:2)转化成亚麻酸（18:3)的 脂肪酰基△ 15去饱和酶的活性。可以使用不同方法来抑制该去饱和酶，包括在编码或调控 区中编码该去饱和酶的基因的一个或多个等位基因的敲除或突变；该酶的RNA转录或翻译 的抑制，包括RNAi、siRNA、miRNA、dsRNA、反义及发夹RNA技术。也可以使用本领域中已知 的其他技术，包括了引入一种产生抑制性蛋白质或对该去饱和酶具有特异性的其他物质的 外源基因。
[0090] 在一个具体实施例中，使细胞中脂肪酸去饱和酶（例如Λ 12脂肪酸去饱和酶）活 性降低到一定程度，该程度使得该细胞不能进行培养或难以培养（例如，细胞分裂率降低 超过10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%或99%)。实现这些条 件可能涉及该去饱和酶的多个基因副本（例如2、3、4或更多）或其基因产物的敲除或其活 性有效抑制。一个具体实施例包括在补充有脂肪酸或脂肪酸混合物的完全或部分脂肪酸营 养缺陷体的细胞培养物中进行培养，由此增加细胞数量，然后使细胞积累油（例如，达到以 细胞重量计至少40% )。作为替代方案，这些细胞包含一种可调控的脂肪酸合成基因，该基 因的活性可以转变。举例来说，该调控可以基于环境条件以及在第一、细胞分裂、有利于产 生脂肪酸的阶段期间的环境条件和在第二、油积累、不利于产生油的阶段期间的环境条件。 举例来说，可以使用培养基PH作为一种环境控制以将脂质路径基因的表达转变成产生具 有高或低合酶活性的状态。这些细胞的实例描述于实例7中。
[0091] 在一个具体实施例中，使用细胞内亚油酸水平的调节来培养细胞。确切地说，通 过在由于亚油酸的存在而容许细胞数量增加的第一条件下培养细胞，并且然后在以亚油酸 饥饿并由此抑制细胞分裂，但仍容许油积累为特征的第二条件下培养这些细胞，来产生天 然油。举例来说，这些细胞的种子培养物可以在培养基中添加的亚油酸存在下产生。举例 来说，在由于除去脂肪酰基△ 12去饱和酶的两个等位基因而缺乏亚油酸产生的无绿藻属 品系（即，亚油酸营养缺陷体）的种子培养物中添加〇.25g/L亚油酸足以支持细胞分裂至 与野生型细胞分裂相当的水平。任选地，然后，该亚油酸可以被细胞消耗，或以其他方式去 除或稀释。然后，将这些细胞转变至产油阶段（例如，如WO 2010/063032中所描述，在氮限 制性条件下供应糖）。意外的是，已经发现，油产生甚至在不存在亚油酸产生或补充的情况 下也可发生，如在专性异养产油微藻无绿藻属中所证实，而且总体上适用于其他产油微藻、 微生物或甚至是多细胞有机体（例如，培养的植物细胞）。在这些条件下，细胞的油含量 可以增加到以干细胞重量计为约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更 高，而所产生的油可以具有占该油中总三酰基甘油脂肪酸百分比为 0. 5%、0. 3%、0. 2%、0. 1%、0. 05%或更低的多不饱和脂肪酸（例如亚油酸+亚麻酸）谱。 举例来说，该细胞的油含量以干细胞重量计可以为50%或更高，并且该油的三酸甘油酯产 生不到3%的多不饱和脂肪酸。
[0092] 通过使用产生亚油酸的细胞机器，但主要或仅在细胞分裂阶段期间使用，这些油 的制造也无需向培养物补充亚油酸（或需求减少）。产亚油酸细胞机器可以是可调控的，由 此在产油阶段期间产生实质上更少的亚油酸。该调控可以经由去饱和酶基因的转录调节进 行。举例来说，脂肪酸△ 12去饱和酶活性的大部分并且优选全部可以处于一个可调控启动 子控制下，该启动子被调控以在细胞分裂阶段中表达去饱和酶，但在油积累阶段期间减少 或关闭。该调控可以与细胞培养条件相关联，如pH和/或氮水平（如在此实例中所描述）， 或其他环境条件。实际上，可以通过添加或去除物质（例如，质子，经由添加酸或碱实现） 或通过允许细胞消耗物质（例如，供应氮的养分）来调节该条件，从而在去饱和酶活性调控 中实现所希望的转变。
[0093] 用于调控去饱和酶活性的其他遗传或非遗传方法也可以使用。举例来说，可以按 一定方式将去饱和酶抑制剂添加到培养基中，该方式有效地抑制在产油阶段期间产生多不 饱和脂肪酸。
[0094] 因此，在本发明的一个具体实施例中，存在一种方法，包括了提供一种重组细胞， 该细胞具有一个可调控的△ 12脂肪酸去饱和酶基因，该基因处于经由一种环境条件进行 的重组调控元件的控制下。在有利于细胞倍增的条件下培养细胞。在达到给定的细胞密度 之后，改变细胞培养基，通过养分限制（例如减少可用氮）使细胞转变到产脂质模式。在产 脂质阶段期间，环境条件应使得Λ12脂肪酸去饱和酶的活性下调。然后，收集细胞并且任 选地提取油。由于在产脂质阶段期间△ 12脂肪酸去饱和酶的水平较低，故该油具有更少的 多不饱和脂肪酸并且具有改良的氧化稳定性。任选地，对这些细胞进行异养地培养并且这 些细胞任选地为微藻细胞。
[0095] 使用这些去饱和酶调控方法中的一种或多种，有可能获得一种天然油，据信该天 然油是先前无法获得的，尤其是在生物反应器中进行大规模培养（例如，超过1000L)时。该 油具有的多不饱和脂肪酸水平可以占该油中总三酰基甘油脂肪酸百分比的 2%、1%、0· 5%、0· 3%、0· 2%或更少。
[0096] 具有如此低的多不饱和物水平的一个后果是油对于氧化特别地稳定。事实上，在 一些情形中，这些油可以比任何先前已知的天然细胞油更稳定。在具体实施例中，该油在 IKTC下稳定，无需添加抗氧化剂，以使得在AOCS Cdl2b-92条件下，到10小时、15小时、20 小时、30小时、40小时、50小时、60小时或70小时的时候仍未达到电导率的拐点。就兰奇马 特测试来说，考虑到对于非常稳定的油，由于在如此长的测试时间段内发生的蒸发，可能需 要在此类测试中补给水（参看实例5)。举例来说，该油在IKTC下在不添加抗氧化剂情况 下可以具有并且40-50小时或41-46小时的OSI值。当添加抗氧化剂（适于食品或其他） 时，所测量的OSI值可以进一步增加。举例来说，如通过兰奇马特测试所测量，在添加生育 酚（IOOppm)和抗坏血酸棕榈酸酯（500ppm)或PANA和抗坏血酸棕榈酸酯情况下，此类油在 IKTC下可以具有超过100或200小时的氧化稳定性指数（0SI值）。在另一个实例中，将 1050ppm的混合生育酚和500pm的抗坏血酸棕榈酸酯添加到包含了不到1 %的亚油酸或不 到1%的亚油酸+亚麻酸的油中；因此，该油在IKTC下稳定1、2、3、4、5、6、7、8或9、10、11、 12、13、14、15或16、20、30、40或50天，5到15天、6到14天、7到13天、8到12天、9到11 天、约10天或约20天。该油还可以在130°C下稳定1、2、3、4、5、6、7、8或9、10、11、12、13、 14、15或16、20、30、40或50天，5到15天、6到14天、7到13天、8到12天、9到11天、约 10天或约20天。在一个具体实例中，发现此类油可稳定超过100小时（如所观察的，约128 小时）。在另一个实施例中，在不添加抗氧化剂情况下该天然油在120°C下的OSI值超过15 小时或20小时，或在10-15、15-20、20-25或25-50小时，或50-100小时范围内。
[0097] 在一个实例中，使用这些方法，微藻细胞的油含量以干细胞重量计介于40%与约 85%之间，并且该油的脂肪酸谱中的多不饱和脂肪酸在该油的脂肪酸谱的介于0.001%与 3%之间，并且任选地在不添加抗氧化剂情况下在IKTC下得到OSI诱导时间为至少20小时 的天然油。在又另一个实例中，存在一种通过对来自产油细胞的天然油进行RBD处理所制 造的天然油，该油包含介于0.001%与2%之间的多不饱和脂肪酸并且在不添加抗氧化剂 情况下在ll〇°C下具有超过30小时的OSI诱导时间。在又另一个实例中，存在一种通过对 来自产油细胞的天然油进行RBD处理所制造的天然油，该油包含介于0. 001 %与1 %之间的 多不饱和脂肪酸并且在不添加抗氧化剂情况下在IKTC下具有超过30小时的OSI诱导时 间。
[0098] 在另一个具体实施例中，存在一种由以上描述的方法制造的具有降低的多不饱和 物水平的油。将该油与如PANA和抗坏血酸棕榈酸酯等抗氧化剂组合。举例来说，发现当将 此类油与〇. 5% PANA和500ppm抗坏血酸棕榈酸酯组合时，该油具有的OSI值在130°C下为 约5天或在IKTC下为21天。这些值得注意的结果表明，不仅该油特别地稳定，而且这两种 抗氧化剂是三酸甘油酯油的特别有效的稳定剂，并且这些抗氧化剂的组合可以具有普遍的 适用性，包括制造稳定的生物可降解润滑剂（例如喷气式发动机润滑剂）。在具体实施例 中，脂肪酸△ 12去饱和酶的基因操作使得OSI (例如，在IKTC下）相对于在无该操作情况 下的品系增加2到30,或5到25,或10到20倍。可以通过抑制细胞中去饱和酶活性（包 括如以上所描述）来产生油。
[0099] 适用于本发明的油的抗氧化剂包括α、δ及Y生育酚（维生素 E)、生育三烯 酚、抗坏血酸（维生素 C)、谷胱甘肽、硫辛酸、尿酸、β-胡萝卜素、番茄红素、叶黄素、视 黄醇（维生素 Α)、泛醌（辅酶Q)、褪黑激素、白藜芦醇、类黄酮、迷迭香提取物、没食子 酸丙酯（PG)、叔丁基氢醌（TBHQ)、丁基化羟基苯甲醚（BHA)及丁基化羟基甲苯（ΒΗΤ)、 Ν，Ν' -二-2- 丁基-1，4-亚苯基二胺、2, 6-二-叔丁基-4-甲基苯酚、2, 4-二甲基-6-叔丁 基苯酚、2, 4-二甲基-6-叔丁基苯酚、2, 4-二甲基-6-叔丁基苯酚、2, 6-二-叔丁基-4-甲 基苯酚、2, 6-二-叔丁基苯酚及苯基-α -萘胺（PANA)。
[0100] 除去饱和酶修饰外，在相关实施例中，可以进行其他基因修饰以进一步订制该油 的特性（如通篇所描述），包括了具有改变的链长度特异性的酰基-ACP硫酯酶的引入或取 代和/或编码KAS、SAD、LPAAT或DGAT基因的内源或外源基因的过表达。举例来说，产生升 高的油酸水平的品系还可以产生低水平多不饱和物。这些基因修饰可以包括通过引入外源 SAD基因来增加硬脂酰基-ACP去饱和酶（SAD)的活性；通过引入外源KASII基因来增加延 长酶活性，和/或对FATA基因进行敲减或敲除。
[0101] 在一个具体实施例中，可以产生具有较少的多不饱和物的高油酸天然油。举例来 说，该油可以具有一种含超过60%、70%、80%、90%或95%的油酸和不到5%、4%、3%、 2%或1%的多不饱和物的脂肪酸谱。在相关实施例中，通过一种具有重组核酸的细胞来产 生天然油，这些重组核酸可操作以降低脂肪酸△ 12去饱和酶活性并且任选地减少脂肪酸 Δ 15去饱和酶，由此产生了具有低于或等于3%的多不饱和脂肪酸并且超过60%的油酸、 低于2%的多不饱和脂肪酸和超过70%的油酸、低于1 %的多不饱和脂肪酸和超过80 %的 油酸，或低于〇. 5 %的多不饱和脂肪酸和超过90 %的油酸的油。已经发现，增加油酸的一种 方式是使用重组核酸，这些重组核酸可操作以减少FATA酰基-ACP硫酯酶的表达并且任选 地过表达KAS II基因；此类细胞可以产生一种具有大于或等于75%的油酸的油。作为替 代方案，可以使用KASII的过表达，而不对FATA进行敲除或敲减。通过使用以上方法降低 Λ 12脂肪酸去饱和酶活性，由此减少被转化成不饱和亚油酸和亚麻酸的油酸的量，来进一 步增加油酸水平。因此，所产生的油可以具有一种含至少75%的油酸和至多3%、2%、1 % 或0. 5%的亚油酸的脂肪酸谱。在一个相关实例中，该油具有介于80%与95%之间的油酸 和约0. 001 %到2%的亚油酸、0. 01 %到2%的亚油酸或0. 1 %到2%的亚油酸。这些油将 具有较低凝固点和优良的稳定性并且可用于食品、用于油炸、燃料或化学应用中。另外，这 些油可以随时间展现出降低的变色倾向。在一种说明性化学应用中，使用了高油酸油来制 造化学品。该油中三酸甘油酯的油酸基团的油酸双键可以被环氧化或羟基化以制备多元 醇。该环氧化或羟基化的油可以被用于多种应用中。一种此类应用是经由该羟基化三酸甘 油酯与异氰酸酯的缩合反应来制造聚氨基甲酸酯（包括聚氨基甲酸酯泡沫），如已经用羟 基化大豆油或蓖麻油所实践的。有关羟基化和聚氨基甲酸酯缩合反应化学的实例，参见例 如 US 2005/0239915、US2009/0176904、US 2005/0176839、US 2009/0270520 及美国专利号 4, 264, 743,以及泽拉坦克（Zlatanic)等，《生物大分子》（Biomacromolecules) 2002, 3, 104 8-1056 (2002)。适合的羟基形成反应包括脂肪酸的一个或多个双键的环氧化，随后在水（用 以形成二醇）、醇（用以形成羟基醚）或酸（用以形成羟基酯）存在下进行的酸催化的环氧 化物开环反应。在制造生物基聚氨基甲酸酯中使用高油酸/低多不饱和的油有许多益处： (1)可以改良聚氨基甲酸酯泡沫的保存期限、颜色或气味；（2)由于没有由多不饱和物引起 的不想要的副反应，使得可以改良产物的再现性；（3)由于没有多不饱和物，可以发生更高 程度的羟基化反应，并且聚氨基甲酸酯产物的结构特征可以相应地得到改良。
[0102] 在此描述的低多不饱和或高油酸/低多不饱和的油适宜被用于不希望发黄的化 学应用中。举例来说，在由衍生自三酸甘油酯的三酸甘油酯脂肪酸制造的油漆或涂料中，发 黄将是不希望的。发黄可以由涉及多不饱和脂肪酸和生育三烯酚和/或生育酚的反应所引 起。因此，在具有较低生育三烯酚水平的产油微生物中产生高稳定性油对于提高使用该油 制造的化学组合物的高颜色稳定性可为有益的。与常用的植物油相比，通过适当选择产油 微生物，这些实施例的天然油可以具有lg/L或更低水平的生育酚和生育三烯酚。在一个具 体实施例中，天然油具有一种含不到2%的多不饱和脂肪酸的脂肪酸谱和不到lg/L的生育 酚、生育三烯酚或生育酚与生育三烯酚的总和。在另一个具体实施例中，天然油具有一种含 不到1%的多不饱和脂肪酸的脂肪酸谱和不到0. 5g/L的生育酚、生育三烯酚或生育酚与生 育三烯酚的总和。
[0103] 任何高稳定性（低多不饱和物）天然油或其衍生物都可以用于配制食品、药物、维 生素、营养医学食品、个人护理或其他产品，并且尤其适用于氧化敏感性产品。举例来说，可 以使用高稳定性天然油（例如低于或等于3%、2%或1%的多不饱和物）来配制防晒面霜 (例如具有阿伏苯宗、胡莫柳酯、水杨酸辛酯、奥克立林或二苯甲酮中的一种或多种的组合 物）或类维生素 A面霜，该面霜因不存在与多不饱和脂肪酸相关的自由基反应而具有增加 的保存期限。举例来说，就颜色、气味、感官特性或在54°C下加速降解4周之后保留的活性 化合物％来说，可以增加保存期限。高稳定性油还可以被用作具有优良高温稳定性的润滑 齐U。除稳定性外，这些油可以是生物可降解的，这是多种特性的一个罕见组合。
[0104] 在另一个相关实施例中，通过另外的基因修饰，例如通过短链到中链偏好的酰 基-ACP硫酯酶或此处描述的其他修饰使天然油的脂肪酸谱中的C8到C16脂肪酸升高。根 据这些实施例的低多不饱和油可以被用于不同工业产品、食品或消费品，包括需要改良的 氧化稳定性的那些。在食品应用中，这些油可以用于在高温下油炸而具有延长的寿命，或具 有延长的保存期。
[0105] 在使用该油进行油炸的情况下，该油的高稳定性可以允许在不添加抗氧化剂和/ 或消泡剂（例如硅酮）情况下进行油炸。作为省去消泡剂的结果，油炸的食品可以吸收更 少的油。在用于燃料应用的情况下，作为三酸甘油酯或被加工成生物柴油或可再生的柴油 (参看例如，WO 2008/151149、WO 2010/063032 及 WO 2011/150410)，高稳定性可以促进长 期储存，或允许在升高的温度下使用。举例来说，由高稳定性油制造的燃料可以被储存用于 后备发电机中超过一年或超过5年。油炸用油可以具有超过200°C的发烟点和低于0. 1% 的游离脂肪酸。
[0106] 低多不饱和油可以与食用油掺混，包括结构化脂肪，如形成β或β '晶体的那些， 包括如以下所描述制造的那些。这些油还可以与液体油掺混。如果与具有亚油酸的油（如 玉米油）混合，那么该掺混物的亚油酸水平可以接近如高油酸向日葵油等高油酸植物油的 亚油酸水平（例如约80%油酸和8%亚油酸）。
[0107] 低多不饱和天然油的掺混物可以与其他油发生酯交换。举例来说，该油可以进行 化学或酶促酯交换。在一个具体实施例中，根据本发明的一个实施例的低多不饱和油在其 脂肪酸谱中具有至少10%的油酸和不到5%的多不饱和物，并且使用对sn-Ι和sn-2三酰 基甘油位置具有特异性的一种酶使其与一种高饱和度油（例如氢化大豆油或具有高硬脂 酸酯水平的其他油）进行酶促酯交换。结果是包括一种硬脂酸酯-油酸酯-硬脂酸酯（SOS) 的油。用于酯交换的方法是本领域中已知的；参看例如，"《脂质交换中的酶》（Enzymes in Lipid Modification)，" 尤维 Τ·博恩斯彻（Uwe T.Bornschuer)编，威立出版社（Wiley_ VCH)，2000, ISBN 3-527-30176-3。
[0108] 高稳定性油可以被用作喷雾用油。举例来说,可以用一种具有不到5%、4%、3%、 2%或1%多不饱和物的高稳定性油喷洒干燥的水果，如葡萄干。结果是，所使用的喷嘴将因 喷嘴中可能另外由于多不饱和物的存在所引起的聚合或氧化产物累积而变得不太频繁地 堵塞。
[0109] 在另一个实施例中，可以通过Λ 12脂肪酸去饱和酶的敲减或调控来改良高SOS的 油（如以下所描述的那些）的稳定性。 V.具有外源酰基转移酶的细胞
[0110] 在本发明的不同实施例中，可以将一个或多个编码酰基转移酶（负责使一种脂肪 酸与甘油或甘油衍生物缩合形成酰基甘油的一种酶）的基因引入产油细胞（例如，质体微 藻细胞）中，由此改变由该细胞产生的天然油的脂肪酸组成。这些基因可以编码以下各项 中的一种或多种：甘油-3-磷酸酰基转移酶（GPAT);溶血磷脂酸酰基转移酶（LPAAT)，又称 为1-酰基甘油-3-磷酸酰基转移酶（AGPAT);磷脂酸磷酸酶（PAP);或二酰基甘油酰基转移 酶（DGAT)，它将一个酰基转移到DAG的sn-3位置，藉此产生TAG。
[0111] 重组核酸可以整合到一个质粒或细胞的染色体中。作为替代方案，该基因编码脂 质路径中通过与以上分开的不依赖于脂肪酰基-CoA的途径产生TAG前体分子的一种酶。酰 基-ACP可以作为质体GPAT和LPAAT酶和/或线粒体GPAT和LPAAT酶的底物。在能够并入 酰基（例如来自膜磷脂）以产生TAG的另外的酶中有磷脂二酰基甘油酰基转移酶（PDAT)。 磷脂合成以及可能影响三酸甘油酯组成的重建中涉及又另外的酰基转移酶，包括溶血磷脂 酰胆碱酰基转移酶（LPCAT)、溶血磷脂酰丝氨酸酰基转移酶（LPSAT)、溶血磷脂酰乙醇胺酰 基转移酶（LPEAT)及溶血磷脂酰肌醇酰基转移酶（LPIAT)。
[0112] 外源基因可以编码对于转移包含特定数量碳原子和/或特定饱和度的酰基底物 具有优先特异性的酰基转移酶，将该基因引入产油细胞中，由此产生富含指定区域特异性 三酸甘油酯的油。举例来说，已经证实椰子（椰）溶血磷脂酸酰基转移酶对于C12:0-C 〇A 底物的偏好高于其他酰基-CoA底物（克努顿（Knutzon)等，《植物生理学》（Plant Physiology)，第120卷，1999,第739-746页），而成熟红花种子的1-酰基-sn-3-甘 油-3-磷酸酯酰基转移酶显示对于亚油酰基-CoA和油酰基-CoA底物的偏好高于其他酰 基-CoA底物，包括硬脂酰基-CoA(市原（Ichihara)等，《欧洲生物化学杂志》（European Journal of Biochemistry),第167卷，1989,第339-347页）。另外，酰基转移酶蛋白质可以 对一种或多种短链、中链或长链酰基-CoA或酰基-ACP底物展现优先特异性，但该优先选择 只能在溶血磷脂酸供体底物的sn-1或sn-3位置中存在特定（例如中链）酰基的情况下碰 至IJ。作为外源基因的结果，可以由在sn-2位置处发现的特定脂肪酸超过20% 50%、60%、70%、90%或90%为了46分子的细胞来产生了46油。
[0113] 在本发明的一些实施例中，细胞制造出富含饱和-不饱和-饱和（sat-unsat-sat) TAG的油。Sat-unsat-sat TAG包括1，3_二-十六烧醜基-2_(9Z_十八烧醜基）-甘油 (称为1-棕榈酰基-2-油酰基-甘油-3-棕榈酰基）、1，3-二-十八烷酰基-2- (9Z-十八 烷酰基）_甘油（称为1-硬脂酰基-2-油酰基-甘油-3-硬脂酰基）及1-十六烷酰 基-2- (9Z-十八烷酰基）-3-十八烷酰基-甘油（称为1-棕榈酰基-2-油酰基-甘油-3-硬 脂酰基）。这些分子对应地更常称为POP、SOS及POS，其中'P'表示棕榈酸，'S'表示硬脂 酸并且'0'表示油酸。饱和-不饱和-饱和TAG的另外的实例包括MOM、LOL、MOL、COC及 C0L，其中'M'表示肉豆蘧酸、'L'表示月桂酸，并且'C'表示癸酸（C8:0)。三饱和物，即具 有三个饱和脂肪酰基的三酸甘油酯，常常因其结晶速率高于其他类型三酸甘油酯而被探索 用于食品应用。三饱和物的实例包括PPM、PPP、LLL、SSS、CCC、PPS、PPL、PPM、LLP及LLS。 此外，TAG中脂肪酸的区域特异性分布是在消化和吸收期间膳食脂肪代谢命运的一个重要 决定因素。
[0114] 根据本发明的某些实施例，用重组核酸转化产油细胞，作为引入了重组核酸的结 果，由此产生了包含升高的量的指定区域特异性三酸甘油酯（例如，1-酰基-2-油酰基-甘 油-3-酰基或1-酰基-2-月桂酰基-甘油-3-酰基，其中油酸或月桂酸对应地在sn-2位 置）的天然油。作为替代方案，辛酸、癸酸、肉豆蘧酸或棕榈酸可以在sn-2位置处。相较于 由不含重组核酸的微生物所产生的天然油，该天然油中存在的指定区域特异性三酸甘油酯 的量可以增加超过5%、超过10%、超过15%、超过20%、超过25%、超过30%、超过35%、 超过40%、超过50%、超过60%、超过70%、超过80%、超过90%、超过100% -500%，或超 过500%。因此，该细胞三酸甘油酯的sn-2谱可以具有超过10%、20%、30%、40%、50%、 60%、70%、80%或90%的特定脂肪酸。
[0115] 在甘油脂中位于截然不同的立体特异性或区域特异性位置处的酰基链的身份可 以通过本领域中已知的一种或多种分析方法（参看鲁迪（Luddy)等，《美国油类化学家协 会》（J. Am. Oil Chem. Soc.)，41，693_696(1964);布罗克霍夫（Brockerhoff)，《脂质研究杂 志》(J. Lipid Res. ),6,10-15(1965);安格斯（Angers)和艾瑞（Aryl),《美国油类化学家协 会》，第76:4卷，（1999);布奇格博（Buchgraber)等，《欧洲类脂物科学与技术杂志》（Eur. J. Lipid Sci. Technol. )，106, 621-648 (2004))，或根据以下给出的实例1、2及8进行评价。
[0116] 三酸甘油酯分子中脂肪酸的位置分布会受到酰基转移酶的底物特异性以及可用 酰基部分的浓度和类型影响。适于改变重组微生物中产生的三酸甘油酯的区域特异性的酶 的非限制性实例列于表1-4中。本领域普通技术人员可以鉴别出另外的适合蛋白质。
[0117] 表1.甘油-3-膦酸酰基转移酶和基因库（GenBank)登记号。
【权利要求】
1. 一种产油微藻细胞，任选地包含与SEQ ID N0:76具有至少65%核苷酸序列一致性 的23S rRNA，任选地为专性异养的并且任选地包含一个外源蔗糖转化酶基因，以使得该细 胞能够以蔗糖作为一种唯一碳源进行生长，该细胞包含了编码一种活性LPAAT酶的一个外 源基因，该细胞产生一种包含三酸甘油酯的油，其中由于该LPAAT活性，该油： (a) 富集含中链脂肪酸的三酸甘油酯；或 (b) 富集饱和-不饱和-饱和型三酸甘油酯。
2. 如权利要求1所述的细胞，其中该油的三酸甘油酯包含了 40%、50%、60%、70%或 80%或更多的 C8:0、C10:0、C12:0、C14:0 或 C16:0 脂肪酸。
3. 如权利要求1或2所述的细胞，其中该细胞另外包含了编码一种活性FATB酰基-ACP 硫酯酶的一个外源基因。
4. 如权利要求3所述的细胞，其中该油的三酸甘油酯由于该外源LPAAT和酰基-ACP硫 酯酶的表达而使中链脂肪酸富集超过70%。
5. 如权利要求1到4中任一项所述的细胞，其中该细胞另外包含了可操作以编码一种 外源KAS I或KAS IV酶或减少一种内源KAS I酶的活性的重组核酸。
6. 如权利要求1到5中任一项所述的细胞，其中该细胞另外包含多种核酸，这些核酸可 操作以任选地经由一个可调控启动子减少一种△ 12脂肪酸去饱和酶的表达，由此产生了 通过FAME GC/FID测量的亚油酸和亚麻酸的面积百分比总计为5%或更低的一种油。
7. 如权利要求1所述的细胞，其中该油富集该饱和-不饱和-饱和型三酸甘油酯。
8. 如权利要求7所述的细胞，其中该油富集SOS、POS和/或POP。
9. 如权利要求8所述的细胞，其中该油包含了含至少50%的SOS和任选地不到10%的 SSS的三酸甘油酯。
10. 如权利要求8或9所述的细胞，另外包含一个硬脂酰基-ACP去饱和酶基因 、FatA 基因或两者的一种敲除或敲减。
11. 如权利要求7到9中任一项所述的细胞，另外包含了可操作以增加￠-酮酰基CoA 合酶活性的重组核酸。
12. 如权利要求11所述的细胞，其中这些可操作以增加￠-酮酰基合酶活性的核酸包 含了编码一种￠-酮酰基CoA合酶的一个外源基因。
13. 如权利要求7到12中任一项所述的细胞，其中油中硬脂酸酯与油酸酯的比率为 3:1±20%。
14. 如权利要求7到13中任一项所述的细胞，其中该油中P0P、S0S及P0S总计占至少 30%。
15. 如权利要求7到14中任一项所述的细胞，其中该油包含至少30%的P0S。
16. 如权利要求7到15中任一项所述的细胞，其中该油包含16% ±20%的P0P、38% ±20%的 POS 及 23% ±20%的 SOS。
17. 如权利要求7到16中任一项所述的细胞，其中该油的脂肪酸谱包含1 %到4%的花 生酸。
18. 如权利要求7到17中任一项所述的细胞，其中该细胞另外包含多种核酸，这些核酸 可操作以任选地经由一个可调控启动子减少一种△ 12脂肪酸去饱和酶的表达，由此产生 了亚油酸和亚麻酸的面积百分比总计为5%或更低的一种油。
19. 如权利要求7到17中任一项所述的细胞，其中该油具有超过65%的SOS、不到45% 的不饱和脂肪酸、不到5%的多不饱和脂肪酸、不到1%的月桂酸及不到2%的反式脂肪酸。
20. 如权利要求1到19中任一项所述的细胞，其中该LPAAT具有SEQ ID N0:78或SEQ ID N0:79的氨基酸序列或与SEQ ID N0:78或SEQ ID N0:79具有至少95%-致性的一个 序列。
21. -种用于制造油的方法，包括了提供或培养一种根据权利要求1到20中任一项所 述的细胞，并提取该油，该细胞任选地为异养地培养的。
22. -种根据权利要求21制造的油，该油包含三酸甘油酯。
23. 如权利要求22所述的油，包含以下各项中的一种或多种： 至少10 %的麦角固醇； 麦角固醇和￠-谷固醇，其中麦角固醇与￠-谷固醇的比率超过25:1; 麦角固醇和菜籽固醇； 麦角固醇、菜籽固醇及多孔固醇； 并且其中该油任选地不含以下各项中的一种或多种：0 -谷固醇、菜油固醇及豆固醇。
24. 如权利要求22所述的油，其中该油形成0多形性晶体。
25. 如权利要求24所述的油，其中这些晶体具有一种2L的层状结构。
26. 如权利要求24所述的油，其中这些晶体具有一种3L的层状结构。
27. 如权利要求22所述的油，其中该油形成0 '多形性晶体。
28. 如权利要求24所述的油，其中这些晶体具有一种2L的层状结构。
29. 如权利要求24所述的油，其中这些晶体具有一种3L的层状结构。
30. 如权利要求22到29中任一项所述的油，其中这些三酸甘油酯具有一种脂肪酸 谱，其特征在于，硬脂酸酯和棕榈酸酯的百分含量的总和等于油酸酯的百分含量乘以2. 0% +/_40 %。
31. 如权利要求22到30中任一项所述的油，其中该油具有超过65%的SOS三酸甘油 酯、不到45%的不饱和脂肪酸、不到5%的不饱和脂肪酸、不到1 %的月桂酸及不到2%的反 式脂肪酸。
32. 如权利要求22到31中任一项所述的油，其中该脂肪酸谱中硬脂酸酯和棕榈酸酯的 百分比的总和是油酸酯百分含量的两倍±20%。
33. 如权利要求32所述的油，其中该sn-2谱具有至少40%的油酸酯。
34. 如权利要求22到33中任一项所述的油，其中该油为至少40%、50%、60%、70%、 80%或 90% 的 SOS。
35. 如权利要求22到33中任一项所述的油，其中该油是具有介于30°C与40°C之间的 一种熔融温度的一种包入起酥油。
36. 如权利要求35所述的油，包含0 '多形性晶体。
37. 如权利要求35或36所述的油，该油在35°C下具有一种小于15%的固体脂肪含量。
38. 如权利要求35到37中任一项所述的油，该油包含15 %到20%的C8到C14脂肪 酸、45% -50%的C16和更高级脂肪酸，和/或30% -25%的不饱和脂肪酸。
39. -种使用如权利要求22到38中任一项所述的油制造的食品、燃料或化学产品。
40. -种天然油或由天然油制造的RBD油，该油包含3. 5%或更少的饱和脂肪酸，并且 任选地包含超过50%的油酸和/或超过1 %的棕榈油酸。
41. 如权利要求40所述的油，该油具有介于0. 1%与3. 5%之间的饱和脂肪酸。
42. 如权利要求40或41所述的油，该油包含至少90%的油酸。
43. 如权利要求42所述的油，该油包含至少3%的多不饱和脂肪酸。
44. 一种产油细胞，任选地包含与SEQ ID NO:76具有至少65%核苷酸序列一致性的 23S rRNA并且任选地为专性异养的，该细胞产生一种包含3. 5 %或更少饱和脂肪酸的油。
45. 如权利要求44所述的细胞，其中该细胞属于无绿藻属。
46. 如权利要求44所述的细胞，该细胞另外包含一种FATA敲除或敲减。
47. 如权利要求44到46中任一项所述的细胞，该细胞包含一个外源基因，该基因编码 一种具有使棕榈酰基（palmitoyl)-CoA去饱和成为棕榈油酰基（plamitoyl)-CoA的活性的 酶。
48. 如权利要求47所述的细胞，其中该外源基因为一个PAD基因。
49. 如权利要求47所述的细胞，其中该外源基因是一个对棕榈酰基-ACP具有去饱和酶 活性的SAD基因。
50. 如权利要求44到49中任一项所述的细胞，该细胞另外包含一种过表达的KASII 酶。
51. 如权利要求44到50中任一项所述的细胞，该细胞另外包含多种核酸，这些核酸可 操作以任选地经由一个可调控启动子减少一种△ 12脂肪酸去饱和酶的表达，由此产生了 亚油酸和亚麻酸的面积百分比总计为5%或更低的一种油。
52. -种由如权利要求44到51中任一项所述的细胞产生的油，该油任选地被精炼，漂 白并除臭，该油包含以下各项中的一种或多种： 至少10 %的麦角固醇； 麦角固醇和b-谷固醇，其中麦角固醇与b-谷固醇的比率超过25:1 ; 麦角固醇和菜籽固醇；以及 麦角固醇、菜籽固醇及多孔固醇； 其中该油任选地不含以下各项中的一种或多种：_谷固醇、菜油固醇及豆固醇。
53. -种用于产生具有3. 5%或更少饱和脂肪酸的油的方法，该方法包括：提供或培养 一种如权利要求5到12中任一项所述的细胞，并且从该细胞提取该油。
54. -种用于制造食品的方法，该方法包括将一种通过如权利要求53所述的方法制造 的油并入该食品中，其中该最终的食品具有3. 5%或更少的饱和脂肪。
55. -种重组产油细胞，任选地包含与SEQ ID NO: 76具有至少65%核苷酸序列一致性 的23S rRNA并且任选地为专性异养的，该细胞包含了编码一种活性酮酰基-CoA合酶的一 个外源基因。
56. 如权利要求55所述的细胞，其中该细胞产生一种包含超过20%的芥酸的油。
57. 根据权利要求56所述的细胞，其中该细胞产生一种包含超过60%的芥酸的油。
58. 如权利要求55到57中任一项所述的细胞，其中该细胞包含至少40%的油。
59. 如权利要求55到58中任一项所述的细胞，其中该细胞属于无绿藻属，并且任选地 属于桑椹型无绿藻种类。
60. -种由如权利要求55到59中任一项所述的细胞产生的油，该油包含以下各项中的 一种或多种： 至少10 %的麦角固醇； 麦角固醇和￠-谷固醇，其中麦角固醇与￠-谷固醇的比率超过25:1 ; 麦角固醇和菜籽固醇；以及 麦角固醇、菜籽固醇及多孔固醇； 其中该油任选地不含以下各项中的一种或多种：￠-谷固醇、菜油固醇及豆固醇。
61. -种由如权利要求60所述的油制造的化学品。
62. -种用于制造油的方法，包括：提供或培养一种根据权利要求55到59中任一项所 述的细胞，并从该细胞提取一种油。
63. -种重组产油细胞，该细胞包含多种重组核酸，这些核酸可操作以抑制一种A 12 脂肪酸去饱和酶基因产物的活性，以使得该细胞产生了具有含不到5%亚油酸的一种三酰 基甘油谱的一种油。
64. 如权利要求63所述的细胞，其中该细胞产生了具有含不到3%亚油酸的一种三酰 基甘油谱的一种油。
65. 如权利要求64所述的细胞，其中该细胞产生了具有含不到2%亚油酸的一种三酰 基甘油谱的一种油。
66. 如权利要求63所述的细胞，其中该细胞为一种亚油酸营养缺陷体或该△ 12脂肪酸 去饱和酶的活性可以经由环境条件进行抑制，由此产生该油。
67. 如权利要求66所述的细胞，其中归因于与该A 12脂肪酸去饱和酶基因可操作连接 的一个可调控启动子，该△ 12脂肪酸去饱和酶是经由环境条件可调控的。
68. 如权利要求67所述的细胞，其中该可调控启动子是通过培养基pH或氮水平的改变 可调控的。
69. 如权利要求64到68中任一项所述的细胞，该细胞另外包含多种重组核酸，这些核 酸可操作以表达一种外源KASII、LPAAT或FATB酶。
70. 如权利要求64到69中任一项所述的细胞，该细胞另外包含多种重组核酸，这些核 酸可操作以敲除或敲减一种硬脂酰基ACP去饱和酶的表达。
71. 如权利要求64到70中任一项所述的细胞，该细胞另外包含多种重组核酸，这些核 酸可操作以敲除或敲减一种内源FatA编码的酰基-ACP硫酯酶的表达。
72. 如权利要求64到71中任一项所述的细胞，其中该油在110°C下是稳定的，以使得 在AOCS Cd 12b-92兰奇马特测试的条件下，到20小时的时候仍未到达电导率的拐点。
73. 如权利要求64到71中任一项所述的细胞，其中该油在110°C下是稳定的，以使得 当向该油中添加1050ppm的生育酚和500pm的抗坏血酸棕榈酸酯时，在该AOCS Cd 12b-92 兰奇马特测试条件下，到5天时仍未到达电导率的拐点。
74. -种方法，包括： (a) 提供一种重组产油细胞，该细胞任选地包含与SEQ ID NO:76具有至少65%核苷酸 序列一致性的23S rRNA，任选地为专性异养的，该细胞包含多种重组核酸，这些核酸可操作 以响应于一种环境条件的一种变化而改变由该细胞产生的一种脂肪酸的量； (b) 在容许该脂肪酸合成的一种第一环境条件下培养该细胞，由此允许细胞分裂并且 增加细胞数量； (C)在一种第二环境条件下培养该细胞，归因于这些重组核酸，该条件使该脂肪酸的合 成减少并由此使由该细胞产生的一种油中该脂肪酸的量减少；并且 (d)从该细胞提取该油。
75. 如权利要求74所述的方法，其中该细胞包含多种外源核酸，这些核酸可操作以降 低一种A 12脂肪酸去饱和酶的活性，由此减少该油中亚油酸的量。
76. 如权利要求74或75所述的方法，其中该油中该亚油酸减少至少50%、60%、70%、 80%或 90%。
77. 如权利要求74到76中任一项所述的方法，其中对该细胞进行异养地培养。
78. 如权利要求74到77中任一项所述的方法，其中该细胞是一种微藻细胞。
79. 如权利要求74到78中任一项所述的方法，其中该细胞产生以干细胞重量计至少 40%、50%、60%、70%、80%或 90% 的油。
80. 如权利要求74到79中任一项所述的方法，其中该第一环境条件是一种第一 pH的 培养用培养基并且该第二环境条件是一种第二pH的培养用培养基。
81. 如权利要求74到80中任一项所述的方法，其中当从该细胞提取时，该油在110°C 下是稳定的，以使得在AOCS Cd 12b-92兰奇马特测试的条件下，到20小时的时候仍未到达 电导率的拐点。
82. 如权利要求74到81中任一项所述的方法，其中当从该细胞提取时，该油在110°C 下是稳定的，以使得当向该油中添加1050ppm的生育酚和500pm的抗坏血酸棕榈酸酯时，在 该AOCS Cd 12b-92兰奇马特测试条件下，到5天时仍未到达电导率的拐点。
83. 如权利要求74到82中任一项所述的方法，其中该细胞包含了编码一种KAS II酶 的一个外源基因以及任选地一个FatA基因的一种敲除或敲减。
84. 如权利要求74到83中任一项所述的方法，其中可操作以改变由该细胞所产生的 一种脂肪酸的量的这些重组核酸包含了靶向一个FAD基因的一种抑制性RNA，该抑制性RNA 的产生是处于一个可调控启动子的控制下。
85. 如权利要求83或84所述的方法，其中该油以具有超过60%的油酸和不到3%的多 不饱和物的一种脂肪酸谱为特征。
86. 如权利要求85所述的方法，其中该油以具有超过70%的油酸和不到2%的多不饱 和物的一种脂肪酸谱为特征。
87. 如权利要求86所述的方法，其中该油以具有超过80%的油酸和不到1 %的多不饱 和物的一种脂肪酸谱为特征。
88. -种通过如权利要求74到87中任一项所述的方法制造的油。
89. 如权利要求88所述的油，该油包含0.01%到2%的亚油酸以及（i)80%到95%的 油酸或（ii)超过40%的08、(：10、(：12、(：14或(：16脂肪酸。
90. 如权利要求88或89所述的油，另外包含以下各项中的一种或多种： 至少10 %的麦角固醇； 麦角固醇和b-谷固醇，其中麦角固醇与b-谷固醇的比率超过25:1 ; 麦角固醇和菜籽固醇；以及 麦角固醇、菜籽固醇及多孔固醇。
91. 一种由如权利要求88到90中任一项所述的油制造的产品。
92. 如权利要求91所述的产品，其中该产品是一种食品、燃料或化学品。
93. 如权利要求91所述的产品，其中该产品是一种油炸油、润滑油、清洁溶剂、表面活 性剂、泡沫材料或润滑剂。
94. 如权利要求91所述的产品，其中该产品是一种油酸二聚物。
95. -种构建体、载体、染色体或宿主细胞，包含了编码与SEQ ID NO: 77到79具有至少 90 % -致性的一种蛋白质的核酸。
96. 如权利要求95所述的构建体、载体、染色体或宿主细胞，编码与SEQ ID NO: 77到 79具有至少95% -致性的一种蛋白质。
97. 如权利要求95所述的构建体、载体、染色体或宿主细胞，编码与SEQ ID NO:77到 79具有至少98% -致性的一种蛋白质。
98. 如权利要求95到97中任一项所述的构建体、载体、染色体或宿主细胞，包含多种 核酸，这些核酸由于遗传密码的简并性而与SEQ ID N0:80-85或等效序列具有至少80%、 90%、95%、96%、97%、98%或 99%序列一致性。
【文档编号】C12P7/64GK104364386SQ201380031877
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2013年4月18日 优先权日:2012年4月18日
【发明者】S·富兰克林, A·索曼奇, G·鲁登科, R·巴特, X·赵, R·邦德, W·莱基特斯基, A·马兰戈尼, D·布拉克斯梅耶 申请人:索拉兹米公司