植物调控元件及其用途

植物调控元件及其用途
【专利摘要】本发明提供可用于调节植物中的基因表达的DNA分子和构建体及其核苷酸序列。还提供包含与异源可转录多核苷酸可操作地连接的DNA分子的转基因植物、植物细胞、植物部分和种子以及它们的使用方法。
【专利说明】植物调控元件及其用途
[0001] 相关申请的引用
[0002] 本申请要求2012年4月20日提交的美国临时申请No. 61/635, 945和2013年3 月14日提交的美国非临时申请No. 13/830,403的权益，其通过引用全文合并到本文中。
[0003] 序列表的并入
[0004] 包含在2013年4月10日建立的22千字节（如在Microsoft Windows?中测 量的）的名称为"M0NS326W0_ST25. txt"的文件中的序列表通过电子提交与本申请一起提 交并通过引用合并到本文中。 发明领域
[0005] 本发明涉及植物分子生物学和植物遗传工程领域。更特别地，本发明涉及可用于 调节植物中的基因表达的DNA分子。
[0006] 发明背景
[0007] 调控元件是通过调节与可操作地连接的可转录多核苷酸分子的转录而调节基因 活性的遗传元件。这样的元件包括启动子、前导序列、内含子和3'非翻译区且可用于植物 分子生物学和植物遗传工程领域中。
[0008] 表达赋予植物在冷和湿应激条件下萌发过程中的优势的转基因的转基因作物需 要具有在最有利于表达这样的转基因的组织中的表达模式的调控元件。这样的调控元件应 当在发育的种子中充分地表达以使得能够储存可以在种子于冷和/或湿条件下萌发时快 速发挥作用的转基因产物以及提供在萌发和出苗的早期阶段中的表达。因此，本发明提供 在发育和萌发的种子中表现出较高表达水平且可用于驱动在冷和/或湿萌发条件下提供 益处的转基因表达的新型调控元件。


【发明内容】

[0009] 本发明提供用于植物中的新型基因调控元件。本发明还提供包含该调控元件的 DNA构建体。本发明还提供包含该调控元件的转基因植物细胞、植物和种子。可以提供与可 转录多核苷酸分子可操作地连接的序列。在一个实施方案中，可转录多核苷酸分子相对于 本文中提供的调控序列可以是异源的。在特定的实施方案中，本发明提供的调控元件序列 因此可以定义为与异源可转录多核苷酸分子可操作地连接。本发明还提供制备和使用该调 控元件、包含该调控元件的DNA构建体及包含与可转录多核苷酸分子可操作地连接的该调 控元件的转基因植物细胞、植物和种子的方法。
[0010] 在一个方面中，本发明提供包含选自下组的DNA序列的DNA分子：(a)与SEQ ID N0:l、2、3、4、6或8中任一具有至少85%序列同一性的序列；(b)包含SEQIDN0 :l、2、3、4、 6或8中任一的序列；和（C)SEQ ID NO: 1、2、3、4、6或8中任一的片段，其中所述片段具有 基因调控活性，其中所述序列与异源可转录多核苷酸分子可操作地连接。在一个实施方案 中，DNA分子与SEQ ID N0:l、2、3、4、6或8中任一的DNA序列具有至少约90%序列同一性。 在另一个实施方案中，DNA分子与SEQ ID NO: 1、2、3、4、6或8中任一的DNA序列具有至少 95%序列同一性。在另一个实施方案中，DNA序列包含基因调控活性。在又另一个实施方 案中，异源可转录多核苷酸分子包含具有农学意义的基因。在其它实施方案中，具有农学意 义的基因赋予植物的除草剂耐受性或害虫抗性。
[0011] 在另一个方面中，本发明提供包含异源DNA分子的转基因植物细胞，该异源DNA分 子包含选自下组的序列：（a)与SEQ ID NO: 1、2、3、4、6或8中任一具有至少约85%序列同 一性的序列；(b)包含 SEQ ID N0:l、2、3、4、6 或 8 中任一的序列；和（c)SEQ ID N0:l、2、3、 4、6或8中任一的片段，其中所述片段具有基因调控活性，其中所述序列与异源可转录多核 苷酸分子可操作地连接。在多个实施方案中，转基因植物细胞可以是单子叶植物细胞或双 子叶植物细胞。
[0012] 在其它实施方案中，本发明提供转基因植物或其部分，其包含选自下组的DNA分 子：（a)与SEQ ID N0:l、2、3、4、6或8中任一具有至少约85%序列同一性的序列；(b)包 含 SEQ ID N0:l、2、3、4、6 或 8 中任一的序列；和（c)SEQ ID N0:l、2、3、4、6 或 8 中任一的片 段，其中所述片段具有基因调控活性，其中所述序列与异源可转录多核苷酸分子可操作地 连接。在另一个实施方案中，本发明提供这种转基因植物的任何代的后代植物或其部分， 其中所述后代植物或部分包含如上所述的DNA分子。在又另一个实施方案中，本发明提供 转基因种子，其中所述种子包含如上所述的DNA分子。
[0013] 在另一个方面中，本发明提供包含选自SEQ ID NO: 1、6和8的转录调控表达元件 组的转基因盒，其中所述转录调控表达元件组与异源编码序列可操作地连接，该异源编码 序列与选自SEQ ID N0:10、ll、12和13的3'UTR可操作地连接。在一个实施方案中，转基因 盒包含如SEQ ID NO: 1所示的转录调控表达元件组,其中所述转录调控表达元件组与异源 编码序列可操作地连接，该异源编码序列与如SEQ ID NO: 10所示的3' UTR可操作地连接。 在另一个实施方案中，转基因盒包含如SEQ ID N0:6所示的转录调控表达元件组，其中所述 转录调控表达元件组与异源编码序列可操作地连接，该异源编码序列与选自SEQ ID NO: 11 和12的3'UTR可操作地连接。在又另一个实施方案中，转基因盒包含如SEQ ID NO: 8所示 的转录调控表达元件组，其中所述转录调控表达元件组与异源编码序列可操作地连接，该 异源编码序列与选自SEQ ID N0:12和13的3'UTR可操作地连接。在另一个实施方案中，本 发明提供生产商品的方法，包括获得包含选自下组的DNA序列的转基因植物或其部分：(a) 与SEQ ID NO: 1、2、3、4、6或8中任一具有至少约85%序列同一性的序列；(b)包含SEQ ID N0:l、2、3、4、6或8中任一的序列；和（c)SEQIDN0:l、2、3、4、6或8中任一的片段，其中所 述片段具有基因调控活性，其中所述序列与异源可转录多核苷酸分子可操作地连接；和从 该转基因植物或其部分生产商品。在一个实施方案中，所述商品是蛋白质浓缩物、蛋白质分 离物、籽粒、淀粉、种子、粗粉、面粉、生物质或种子油。
[0014] 在另一个方面中，本发明提供表达可转录多核苷酸分子的方法，包括获得包含选 自下组的DNA序列的转基因植物：（a)与SEQ ID NO: 1、2、3、4、6或8中任一具有至少约85% 序列同一性的序列；(b)包含SEQ ID NO: 1、2、3、4、6或8中任一的序列；和（c)SEQ ID NO: 1、 2、3、4、6或8中任一的片段，其中所述片段具有基因调控活性，其中所述序列与异源可转录 多核苷酸分子可操作地连接；和栽培植物，其中所述可转录多核苷酸被表达。
[0015] 附图简要说明
[0016] 图1 -显示通过不同转基因盒结构赋予的转基因发育玉米胚和胚乳组织中的 β-葡萄糖醛酸苷酶（⑶s)表达。各转基因盒结构由与转录调控表达元件组EXP-Zm. Nac+Os. FBA:I:I(SEQ ID NO:6)和 EXP-Zm. Nac+Os. Cab-1:1:1(SEQ ID NO:8)及 3' UTR T-〇s.CLUS33428J-l:l:l(SEQ ID N0:ll)、T-0s.Mth-l:l:l(SEQ ID N0:12)和！^^· Ara5-1:1:1 (SEQ ID NO: 13)可操作地连接的⑶S编码序列组成，如实施例3的表3中所示。
[0017] 图2-显示通过不同转基因盒结构赋予的所选择转基因玉米组织中的β-葡 萄糖醛酸苷酶（⑶S)表达。各转基因盒结构由与转录调控表达元件组EXP-Zm. Nac+Os. FBA:1:1(SEQ ID NO:6)和 EXP-Zm. Nac+Os. Cab-1:1:1(SEQ ID NO:8) &3'UTRT-〇s. CLUS33428j-l:l:l(SEQ ID N0:ll)、T-0s.Mth_l:l:l(SEQ ID N0:12)和1'-〇8· Ara5-1:1:1 (SEQ ID NO: 13)可操作地连接的⑶S编码序列组成，如实施例3的表3中所示。
[0018] 序列的简要说明
[0019] SEQ ID NO: 1-转录调控表达元件组或 EXP(EXP-Zm. Nac+Zm. DnaK: 1:1)的序 列，其由与前导序列L-Zm.Nac-l:l:l(SEQ ID N0:4)可操作地5'连接的启动子P-Zm. Nac-1:1:2(SEQ ID N0:3)组成，该前导序列与内含子I-Zm. DnaK-1:1:1 (SEQ ID N0:5)可操 作地连接。
[0020] SEQ ID NO:2-由与前导序列 L-Zm. Nac-1:1:1 (SEQ ID NO:4)可操作地 5' 连接的 启动子 P-Zm. Nac-1:1:2 (SEQ ID NO:3)组成的序列。
[0021] SEQ ID NO:3-启动子 P-Zm. Nac-1:1:2 的序列。
[0022] SEQ ID NO:4-前导序列 L-Zm. Nac-1:1:1 的序列。
[0023] SEQ ID NO:5-内含子 I-Zm. DnaK-1:1:1 的序列。
[0024] SEQ ID N0:6-转录调控表达元件组或 EXP(EXP-Zm.Nac+0s.FBA:l:l)的序 列，其由与前导序列L-Zm.Nac-l:l:l(SEQ ID N0:4)可操作地5'连接的启动子P-Zm. Nac-1:1:2(SEQ ID N0:3)组成，该前导序列与内含子 Ι-Os. FBA-1-1:1:1(SEQ ID N0:7)可 操作地连接。
[0025] SEQ ID NO:7-内含子 Ι-Os. FBA-1-1:1:1 的序列。
[0026] SEQ ID NO:8_ 转录调控表达元件组或 EXP(EXP-Zm. Nac+0s. Cab-1:1:1)的序 列，其由与前导序列L-Zm.Nac-l:l:l(SEQ ID N0:4)可操作地5'连接的启动子P-Zm. Nac-1:1:2(SEQ ID N0:3)组成，该前导序列与内含子 I-〇s.Cab-l-l:l:l(SEQ ID N0:9)可 操作地连接。
[0027] SEQ ID NO:9-内含子 Ι-Os. Cab-1-1:1:1 的序列。
[0028] SEQ ID NO: 10-3，UTR T-AGRtu. nos-1:1:13 的序列。
[0029] SEQ ID N0:ll-3，UTR T-Os. CLUS33428_1-1:1:1 的序列。
[0030] SEQ ID NO: 12-3，UTR T-Os. Mth-1:1:1 的序列。
[0031] SEQ ID NO: 13-3, UTR T-Os. Ara5-1:1:1 的序列。
[0032] SEQ ID NO: 14-β-葡萄糖醛酸苷酶标记基因的编码序列。
[0033] SEQ ID NO: 15-转录调控表达元件组或EXP(EXP-CaMV. 35S: 1:1)的序列，其包含花 椰菜花叶病毒（CaMV) 35S启动子和前导序列。
[0034] SEQ ID NO: 16-转录调控表达元件组或EXP(EXP-Os. Actl: 1:1)的序列，其包含水 稻肌动蛋白1启动子、前导序列和内含子。
[0035] 本发明的详细说明
[0036] 本发明提供来自植物物种的具有有益的基因调控活性的新型多核苷酸分子。本发 明还提供包含调控元件的DNA构建体以及包含调控元件的转基因植物细胞、植物和种子。 这些多核苷酸分子的核苷酸序列提供为SEQ ID NO: 1、2、3、4、6和8。本发明提供了这些多 核苷酸分子的设计、构建和用途。这些多核苷酸分子能够例如影响植物组织中可操作地连 接的可转录多核苷酸分子的表达，并因此选择性地调节转基因植物中编码的基因产物的基 因表达或活性。本发明还提供制备和使用该调控元件的方法、包含启动子和/或其它公开 的核苷酸序列的DNA构建体及制备和使用该DNA构建体的方法。本发明还提供包含与可转 录多核苷酸分子可操作地连接的调控元件的转基因植物细胞、植物和种子以及转化的宿主 细胞。
[0037] 可以提供与可转录多核苷酸分子可操作地连接的根据本发明的DNA序列。在一个 实施方案中，可转录多核苷酸分子相对于本文中提供的调控序列可以是异源的。在特定实 施方案中，本发明提供的调控元件序列因此可以定义为与异源可转录多核苷酸分子可操作 地连接。
[0038] 以下定义和方法提供用于更好地限定本发明和指导本领域普通技术人员实施本 发明。除非另外注明，术语按照相关领域的普通技术人员的常规用法来理解。
[0039] DNA 分子
[0040] 如本文中使用的，术语"DNA"或"DNA分子"是指基因组或合成来源的双链DNA分 子，即脱氧核糖核苷酸碱基的聚合物或多核苷酸分子，其从5'（上游）末端至3'（下游）末 端阅读。如本文中使用的，术语"DNA序列"是指DNA分子的核苷酸序列。本文中使用的专门 术语对应于美国联邦管理法规§ 1. 822的法令37的专门术语，且在WIPO标准ST. 25 (1998) 附件2,表1和3的表格中给出。
[0041] 如本文中使用的，术语"分离的DNA分子"是指至少部分地与在其原始或天然状态 中正常相关的其它分子分离的DNA分子。在一个实施方案中，术语"分离的"是指至少部分 地与在其原始或天然状态中正常侧邻DNA分子的部分核酸分离的DNA分子。因此，与通常 不相关的调控或编码序列融合（例如，作为重组技术的结果）的DNA分子在本文中被认为 是分离的。这样的分子在整合到宿主细胞的染色体中或存在于具有其它DNA分子的核酸溶 液中时被认为是分离的，因为它们不是处于其原始状态。
[0042] 本领域技术人员公知的多种方法可用于分离和操作DNA分子或其片段，如本发明 中公开的。例如，聚合酶链反应（PCR)技术可用于扩增特定起始DNA分子和/或产生原始 分子的变体。DNA分子或其片段也可以通过其它技术获得，如通过化学手段直接合成片段， 如通常通过使用自动寡核苷酸合成仪实施的。
[0043] 如本文中使用的，术语"序列同一性"是指两个最佳比对的多核苷酸序列或两个最 佳比对的多肽序列相同的程度。最佳序列比对通过人工比对两个序列（例如，参比序列和 另一序列）以最大化具有适宜内部核苷酸插入、删除或空位的序列比对中核苷酸匹配的数 目而产生。如本文中使用的，术语"参比序列"是指如SEQ ID NO: 1、2、3、4、6和8的多核苷 酸序列提供的序列。
[0044] 如本文中使用的，术语"百分序列同一性"或"百分同一性"或" ％同一性"是同一 性分数乘以1〇〇。与参比序列最佳比对的序列的"同一性分数"是最佳比对中核苷酸匹配的 数目除以参比序列中核苷酸的总数，例如整个参比序列的全长中核苷酸的总数。因此，在一 个实施方案中，本发明提供包含与参比序列（本文中提供为SEQ ID NO: 1、2、3、4、6和8)最 佳比对时具有与参比序列的至少约85 %同一性、至少约90 %同一性、至少约95 %同一性、 至少约96%同一性、至少约97%同一性、至少约98%同一性或至少约99%同一性的序列。 在特定实施方案中，这样的序列可以定义为具有基因调控活性。
[0045] 调控元件
[0046] 调控元件是具有基因调控活性的DNA分子，即具有影响可操作地连接的可转录多 核苷酸分子的转录和/或翻译的能力的DNA分子。术语"基因调控活性"因此指的是通过影 响可操作地连接的可转录多核苷酸分子的转录和/或翻译来影响可操作地连接的可转录 多核苷酸分子的表达模式的能力。如本文中使用的，转录调控表达元件组（EXP)可以由可 操作地连接的表达元件如增强子、启动子、前导序列和内含子组成。因此，转录调控表达元 件组可以由例如与前导序列可操作地5'连接的启动子连接，而前导序列依次可操作地5' 连接内含子序列。内含子序列可以由在原始序列的第一内含子/外显子剪接结合点处开始 的序列组成并可以进一步由包含第二内含子/外显子剪接结合的小前导序列片段组成，从 而提供正确的内含子/外显子加工以有助于所得转录物的转录和正确加工。前导序列和内 含子可以正向影响可操作地连接的可转录多核苷酸分子的转录以及所得的转录RNA的翻 译。预加工的RNA分子包含前导序列和内含子，其可以影响转录RNA的转录后加工和/或 转录RNA分子从细胞核到细胞质的输出。在转录RNA分子的转录后加工后，前导序列可以 保留作为最终信使RNA的部分且可以正向影响信使RNA分子的翻译。
[0047] 调控元件如启动子、前导序列、内含子和转录终止区是具有基因调控活性并在活 细胞中基因的总体表达中发挥总体部分的DNA分子。术语"调控元件"是指具有基因调控 活性的DNA分子，即具有影响可操作地连接的可转录多核苷酸分子的转录和/或翻译的能 力的DNA分子。在植物中具有功能的分离的调控元件如启动子和前导序列因此可用于通过 遗传工程的方法改变植物表型。
[0048] 调控元件可以特征在于其表达模式效应（定性地和/或定量地），例如，正或负效 应和/或组成型或其它效应，如特征在于其时间、空间、发育、组织、环境、生理、病理、细胞 周期和/或化学反应表达模式及其任何组合，以及特征在于定量或定性指示。启动子可以 用作用于调节可操作地连接的可转录多核苷酸分子的表达的调控元件。
[0049] 如本文中使用的，"基因表达模式"是可操作地连接的DNA分子转录成转录RNA分 子的任何转录模式。转录RNA分子可以被翻译以产生蛋白质分子或可以提供反义或其它调 控 RNA 分子，如 mRNA、dsRNA、tRNA、rRNA、miRNA 等等。
[0050] 如本文中使用的，术语"蛋白质表达"是转录RNA分子翻译成蛋白质分子的任何翻 译模式。蛋白质表达可以特征在于其时间、空间、发育或形态特性，以及特征在于定量或定 性指示。
[0051] 如本文中使用的，术语"启动子" 一般是指参与RNA聚合酶II和其它蛋白质（反 式作用转录因子）的识别和结合以启动转录的DNA分子。启动子最初可以从基因的基因组 拷贝的5'非翻译区（5'UTR)分离。或者，启动子可以是合成产生或操作的DNA分子。启动 子也可以是嵌合的，即通过两个或更多个异源DNA分子的融合产生的启动子。用于实施本 发明的启动子可以包括SEQ ID N0:3或其片段或变体。在本发明的特定实施方案中，如本 文中描述的这样的分子及其任何变体或衍生物进一步定义为包含启动子活性，即能够在宿 主细胞中（如在转基因植物中）作为启动子发挥作用。在再进一步的特定实施方案中，片 段可以定义为表现出其所来源的起始启动子分子所具有的启动子活性，或者片段可以包含 提供基础转录水平且由TATA盒或用于RNA聚合酶II的识别和结合以启动转录的等同序列 组成的"最小启动子"。
[0052] 在一个实施方案中，本发明提供如本文中公开的启动子序列的片段。启动子片段 可以包含如上所述的启动子活性，且可以单独地或与其它启动子和启动子片段结合使用， 如用于构建嵌合启动子。在特定实施方案中，提供了包含本文中公开的具有启动子活性的 多核苷酸分子的至少约50、95、150、250、500、750或至少约1000个连续核苷酸或更长的启 动子片段。
[0053] 例如，由如SEQ ID N0:3所示的启动子衍生的组合物如内部或5'删除可以使用本 领域中已知的方法产生以改善或改变表达，包括通过移除对表达具有正或负效应的元件、 重复对表达具有正或负效应的元件和/或重复或移除对表达具有组织或细胞特异性效应 的元件。由如SEQ ID NO: 3所示的启动子衍生的、由其中TATA盒元件或其等同序列及下游 序列被移除的3'删除组成的组合物可以例如用于形成增强子元件。可以进行进一步的删 除以移除对表达具有正或负、组织特异性、细胞特异性或时间特异性（例如，但不限于昼夜 节律）效应的任何元件。如SEQ ID N0:3所示的启动子及由该启动子衍生的片段或增强子 可以用于形成包含与其它增强子和启动子可操作地连接的如SEQ ID N0:3所示的启动子及 由该启动子衍生的片段或增强子的嵌合转录调控元件组合物。本文中描述的修饰、重复或 删除对于特定转基因的所需表达特征的效率可以在稳定和瞬时植物分析（如本文中工作 实施例中描述的那些）中经验地测试以验证结果，其可以根据所进行的变化和起始分子中 变化的目标而改变。
[0054] 如本文中使用的，术语"前导序列"是指从基因的基因组拷贝的5'非翻译区 (5'UTR)分离并一般定义为转录起始位点（TSS)和蛋白质编码序列起始位点之间的核苷酸 片段的DNA分子。或者，前导序列可以是合成产生或操作的DNA元件。前导序列可以用作用 于调节可操作地连接的可转录多核苷酸分子的表达的5'调控元件。前导序列分子可以与 异源启动子或与其原始启动子一起使用。本发明的启动子分子因此可以与其原始前导序列 可操作地连接或可以与异源前导序列可操作地连接。可用于实施本发明的前导序列如SEQ ID N0:4或其片段或变体所示。在特定实施方案中，可以提供定义为能够在宿主细胞（包 括，例如转基因植物细胞）中作为前导序列发挥作用的这样的序列。在一个实施方案中，这 样的序列解码为包含前导序列活性。
[0055] 如SEQ ID N0:4所示的前导序列（5'UTR)可以由调控元件组成或可以采取可具有 对转基因的转录或翻译的效应的二级结构。这一前导序列可以按照本发明用于形成影响转 基因的转录或翻译的嵌合调控元件。另外，如SEQ ID N0:4所示的前导序列可以用于形成 影响转基因的转录或翻译的嵌合前导序列。
[0056] 外源基因引入新的植物宿主中不总是导致引入基因的高表达。此外，如果处理复 杂性状，有时有必要调节具有空间或时间上不同的表达模式的几个基因。内含子可以主要 地提供这种调节。但是，在一个植物中相同内含子的多重使用已经证明表现出不利。在这 些情况中，有必要具有用于构建适宜重组DNA元件的基础控制元件的集合。本领域中已知 具有表达增强性质的内含子数目是有限的，且因此替代物是需要的。
[0057] 由如SEQ ID N0:5、7和9所示的任何内含子衍生的组合物可以由顺式调控元件的 内部删除或重复组成。另外地，包含内含子/外显子剪接接合的5'和3'序列的改变可以 在与启动子+前导序列或嵌合启动子+前导序列和编码序列可操作地连接时用于改善表达 或表达特异性。包含内含子/外显子剪接接合的5'和3'区域的改变也可以形成以降低在 信使RNA加工和剪接后所得转录物中引入产生的错误起始和终止密码子的可能性。内含子 可以如工作实施例中所述经验地测试以确定内含子对转基因的表达的效应。
[0058] 按照本发明，启动子或启动子片段可以分析已知启动子元件的存在，即DNA序列 特征，如TATA-盒和其它已知转录因子结合位点基序。这样的已知启动子元件的鉴定可以 被本领域技术人员用于设计具有与原始启动子相似的表达模式的启动子变体。
[0059] 如本文中使用的，术语"增强子"或"增强子元件"是指顺式作用转录调控元件（顺 式元件），其赋予总体表达模式的方面，但其通常不足以单独地驱动可操作地连接的多核苷 酸序列的转录。与启动子不同，增强子元件通常不包括转录起始位点（TSS)或者TATA盒或 等同序列。启动子可以天然地包含影响可操作地连接的多核苷酸序列的转录的一个或多个 增强子元件。分离的增强子元件也可以与启动子融合以产生嵌合启动子顺式元件，其赋予 基因表达的总体调节的方面。启动子或启动子片段可以包含影响可操作地连接的基因的转 录的一个或多个增强子元件。许多启动子增强子元件据信结合DNA结合蛋白质和/或影 响DNA拓扑结构，从而产生选择性地允许或限制RNA聚合酶访问DNA模板或者帮助选择性 开放转录起始位点处的双链的局部构象。增强子元件可以起到结合调节转录的转录因子的 功能。一些增强子元件结合超过一个转录因子，且转录因子可以以不同亲和力与超过一个 增强子域相互作用。增强子元件可以通过多种技术鉴定，包括删除分析（即从启动子的5' 末端或内部删除一个或多个核苷酸）、使用DNA酶I足迹的DNA结合蛋白质分析、甲基化干 扰、电泳迁移率变换分析、通过连接介导的PCR的体内基因组足迹和其它常规分析；或者通 过利用常规DNA序列比较方法如BLAST的使用已知顺式元件基序或增强子元件作为靶序列 或靶序列的DNA序列相似性分析。增强子域的精细结构可以进一步通过一个或多个核苷酸 的诱变（或取代）或通过其它常规方法研究。增强子元件可以通过化学合成或通过从包括 这样的元件的调控元件分离获得，且它们可以与包含可用的限制性酶位点的附加侧翼核苷 酸一起合成以帮助后续操作。因此，根据本文中公开的方法设计、构建和使用用于调节可操 作地连接的可转录多核苷酸分子的表达的增强子元件包括在本发明范围内。
[0060] 在植物中，在基因构建体中包括一些内含子导致相对于缺乏内含子的构建 体提高的mRNA和蛋白质累积。这一效应称为基因表达的"内含子介导的增强"（IME) (Mascarenhas 等，（1990)Plant Mol. Biol. 15:913-920)。已知刺激植物中的表 达的内含子已经在玉米基因中（例如，tubAl、Adhl、Shi、Ubil) (Jeon等，Plant Physiol. 123:1005-1014, 2000 ;Callis等，Genes Dev. 1:1183-1200, 1987 ;Vasil 等，Plant Physiol. 91:1575-1579, 1989 !Christiansen 等，Plant Mol.Biol. 18:675-689, 1992)和 在水稻基因中（例如，salt, tpi:McElroy 等，Plant Cell 2:163-171, 1990 ;Xu 等，Plant Physiol. 106:459-467, 1994)鉴定。类似地，来自双子叶植物基因如矮牵牛（例如，rbcS)、 土豆（例如，st-1 si)和拟南芥（例如，ubq3和pat 1)的内含子已发现提高基因表达 率（Dean 等，Plant Cell 1:201-208, 1989 ;Leon 等，Plant Physiol. 95:968-972, 1991; Norris 等，Plant Mol Biol 21:895-906, 1993 ;Rose 和 Last, Plant J. 11:455-464, 1997)。 已证明内含子的剪接位点内的删除或突变降低基因表达，表明剪接可能是ME需要 的（Mascarenhas 等，Plant Mol Biol. 15:913-920,1990 ;Clancy 和 Hannah, Plant Physiol. 130:918-929,2002)。但是，这样的剪接不是双子叶植物中特定ME需要的， 如来自拟南芥的pat 1基因的剪接位点内的点突变证明的（Rose和Beliakoff，Plant Physiol. 122:535-542, 2000)。
[0061] 基因表达通过内含子增强不是普遍的现象，因为一些内含子插入到重组表达盒 中不能增强表达（例如，来自双子叶植物基因（如来自豌豆的rbcS基因、来自大豆的 云扁豆蛋白（phaseolin)基因和来自马铃薯（Solanum tuberosum)的stls-1基因）的 内含子）和来自玉米基因的内含子（adhl基因的第九内含子和hsp81基因的第一内含 子）（Chee 等，Gene41:47-57, 1986 ;Kuhlemeier 等，Mol Gen Genet 212:405-411,1988; Mascarenhas 等，Plant Mol.Biol.15:913-920， 1990 ;Sinibaldi 和 Mettler， In WE Cohn,K Moldave, eds, Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology，Vol 42. Academic Press，New York, pp 229-257, 1992 ;Vancanneyt 等，Mol. Gen. Genet. 220:245-250, 1990)。因此，不是每个内含子可以用于操作转基因植物中非内源基因 或内源基因的基因表达水平。什么特性或特定序列特征必须存在于内含子序列中以增强给 定基因的表达率是现有技术中未知的，且因此不可能预测给定植物内含子在异源使用时是 否引起ME。
[0062] 如本文中使用的，术语"嵌合的"是指通过融合第一 DNA分子与第二DNA分子产生 的单一 DNA分子，其中第一 DNA分子和第二DNA分子正常情况下都不以该构型（即与另一 DNA分子融合）存在。因此嵌合DNA分子是另外通常不在自然界中存在的新DNA分子。如 本文中使用的，术语"嵌合启动子"是指通过DNA分子的这种操作产生的启动子。嵌合启动 子可以结合两个或更多个DNA片段，例如启动子与增强子元件的融合。因此，根据本文中公 开的方法设计、构建和使用嵌合启动子用于调节可操作地连接的可转录多核苷酸分子的表 达包括在本发明范围内。
[0063] 如本文中使用的，术语"变体"是指组成上与第一 DNA分子相似但与第一 DNA分子 不同的第二DNA分子，然而第二DNA分子仍保持第一 DNA分子的总体功能性，即相同或相似 的表达模式。变体可以是第一 DNA分子的更短或截短形式和/或第一 DNA分子的序列的改 变形式，如具有不同限制性酶位点和/或内部删除、取代和/或插入的变体。"变体"也可 以包括具有含有参比序列的一个或多个核苷酸的取代、删除和/或插入的核苷酸序列的调 控元件，其中衍生的调控元件具有与对应的母体调控分子相比更高或更低的或等同的转录 或翻译活性。调控元件"变体"也包括由天然存在于细菌和植物细胞转化中的突变产生的 变体。在本发明中，如SEQ ID N0:l、2、3、4、6和8提供的多核苷酸序列可以用于形成组成 上与原始调控元件的多核苷酸序列相似但与原始调控元件的多核苷酸序列不同的而仍保 持原始调控元件的总体功能性（即相同或相似的表达模式）的变体。本发明的这种变体的 产生根据本公开在本领域技术人员的技能范围内且包括在本发明的范围内。嵌合调控元件 "变体"包含与参比序列相同的组成元件，但构成嵌合调控元件的组成元件可以通过本领域 中已知的各种方法可操作地连接，如限制性酶消化和连接、非连接依赖性的克隆、扩增期间 PCR产物的模块化组装或调控元件的直接化学合成，以及本领域中已知的其它方法。所得的 嵌合调控元件"变体"可以由参比序列的相同组成元件或相同组成元件的变体组成但包含 允许组成部分可操作地连接的一个或多个连接序列的一个或多个序列不同。在本发明中， 如SEQ ID NO: 1、2、3、4、6和8提供的多核苷酸序列提供了参比序列，其中包含参比序列的 组成元件可以通过本领域中已知的方法接合且可以包含天然存在于细菌和植物细胞转化 中一个或多个核苷酸的取代、删除和/或插入或者突变。
[0064] 构建体
[0065] 如本文中使用的，术语"构建体"意思是源自任何来源的能够基因组整合或自主复 制的任何重组多核苷酸分子如质粒、粘粒、病毒、自主复制的多核苷酸分子、噬菌体或者线 性或环状单链或双链DNA或RNA多核苷酸分子，其包含多核苷酸分子，其中一个或多个多核 苷酸分子以功能上操作的方式连接（即可操作地连接）。如本文中使用的，术语"载体"意思 是可以用于转化目的（即将异源DNA引入宿主细胞中）的任何重组多核苷酸构建体。按照 本发明的载体可以包括从任何前述分子分离的表达盒或转基因盒。可用于实施本发明的表 达盒或转基因盒由与异源编码序列可操作地连接的如SEQ ID N0:l、6或8所示的转录调控 表达元件组（"EXP"）组成，该异源编码序列与如SEQ ID NO: 10、11、12或13所示的3' UTR 可操作地连接。
[0066] 如本文中使用的，术语"可操作地连接的"是指与第二分子接合的第一分子，其中 所述分子如此排列以使得第一分子影响第二分子的功能。两个分子可以是或不是单一连续 分子的部分且可以是或不是相邻的。例如，如果启动子调节细胞中目标可转录多核苷酸分 子的转录，则启动子与可转录多核苷酸分子可操作地连接。例如，当前导序列能够用作编码 序列编码的多肽的前导序列时，该前导序列与编码序列可操作地连接。
[0067] 在一个实施方案中，本发明的构建体可以提供为具有包含T-DNA的从根癌农杆菌 分离的右边界（RB或AGRtu. RB)和左边界（LB或AGRtu. LB)区域的双Ti质粒边界DNA构 建体，其连同根癌农杆菌细胞提供的转移分子一起允许T-DNA整合到植物细胞的基因组中 (参见，例如，U.S.专利No. 6, 603, 061)。构建体也可以包含在细菌细胞中提供复制功能和 抗生素选择的质粒骨架DNA片段，例如大肠杆菌复制起点如ori322、广谱宿主范围复制起 点如oriV或oriRi和选择标记的编码区域如Spec/Strp (其编码赋予对壮观霉素或链霉素 的抗性的Tn7氨基糖苷腺苷酰基转移酶）（aadA)或者庆大霉素（Gm，Gent)选择标记基因。 为了植物转化，宿主细菌菌株通常是根癌农杆菌ABI、C58或LBA4404 ;但是，植物转化领域 的技术人员已知的其它菌株可以在本发明中发挥功能。
[0068] 本领域中已知以可转录多核苷酸分子转录成功能性mRNA分子的方式用于将构建 体组装和引入到细胞中的方法，该功能性mRNA分子翻译和表达为蛋白质产物。对于本发明 的实施，用于制备和使用构建体和宿主细胞的常规组合物和方法是本领域技术人员公知的 (参见，例如，Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 3rd edition Volumes I, 2, and 3, J.Sambrook, D. W. Russell 和 N. Irwin, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2000)。 用于制备特别适合于植物转化的重组载体的方法包括，但不限于U. S.专利No. 4, 971，908、 4, 940, 835、4, 769, 061和4, 757, 011中整体描述的那些。这些类型的载体也在科技文献 中综述（参见，例如 Rodriguez 等，Vectors:A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston, 1988 和 Glick 等，Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology，CRC Press，Boca Raton, FL·，1993)。可用于在高等植物中表 达核酸的典型载体是本领域中公知的且包括来源于根瘤农杆菌的肿瘤诱导（Ti)质粒的载 体（Rogers 等，Methods in Enzymology 153:253-277, 1987)。可用于植物转化的其它重组 载体，包括PCaMVCN转移控制载体，也已经描述在科技文献中（参见，例如Fromm等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5824-5828, 1985)。
[0069] 各种调控元件可以包括在构建体中，包括本文中提供的那些的任一种。任何这类 调控元件可以与其它调控元件组合提供。这样的组合可以设计或改变以产生所需的调控特 征。在一个实施方案中，本发明的构建体包含与可转录多核苷酸分子可操作地连接的至少 一个调控元件，该可转录多核苷酸分子可操作地连接3'转录终止分子。
[0070] 本发明的构建体可以包括本文中提供的或本领域中已知的任何启动子或前导序 列。例如，本发明的启动子可以可操作地连接异源非翻译5'前导序列如源自热休克蛋白基 因的前导序列（参见，例如U.S.专利No. 5, 659, 122和5, 362, 865)。或者，本发明的前导序 列可以可操作地连接异源启动子如花椰菜花叶病毒（CaMV) 35S转录启动子（参见，U.S.专 利 No. 5, 352, 605)。
[0071] 如本文中使用的，术语"内含子"是指可以从基因的基因组拷贝分离或鉴定的且可 以一般地定义为在翻译前的mRNA加工过程中剪接出来的DNA分子。或者，内含子可以是合 成地产生或操作的DNA元件。内含子可以包含影响可操作地连接的基因的转录的增强子元 件。内含子可以用作用于调节可操作地连接的可转录多核苷酸分子的表达的调控元件。DNA 构建体可以包含内含子，且内含子相对于可转录多核苷酸分子序列可以是或不是异源的。 本领域中内含子的实例包括水稻肌动蛋白内含子（U. S.专利No. 5, 641，876)和玉米HSP70 内含子（U.S.专利No. 5, 859, 347)。可用于实施本发明的内含子包括SEQ ID NO: 5、7和9。 另外，当修饰内含子/外显子边界序列时，可能优选的是避免使用核苷酸序列AT或者恰在 剪接位点（GT)的5'末端之前的核苷酸A及紧接剪接位点（AG)的3'末端之后的分别核苷 酸G或核苷酸序列TG以消除在信使RNA加工成最终转录物的过程中形成不需要的起始密 码子的可能性。因此内含子的5'或3'末端剪接接合位点周围的序列可以以这种方式修饰。
[0072] 如本文中使用的，术语"3'转录终止分子"或"3' UTR"是指在转录过程中使用以 产生mRNA分子的3'非翻译区（3'UTR)的DNA分子。mRNA分子的3'非翻译区可以通过特 定的切割和3'聚腺苷酸化（polyA尾）生成。3'UTR可以可操作地连接可转录多核苷酸分 子和位于其下游且可以包括提供聚腺苷酸化信号和能够影响转录、mRNA加工或基因表达的 其它调控信号的多核苷酸。PolyA尾被认为发挥mRNA稳定性和翻译起始方面的功能。本 领域中3'转录终止分子的实例是胭脂氨酸合成酶3'区域（参见，Fraley等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，80:4803-4807, 1983)、小麦hspl73'区域、豌豆核酮糖二磷酸羧化酶-加氧 酶（rubisco)小亚基 3' 区域、棉花 E63' 区域（U.S.专利 No.6,096,950)、W0/0011200A2 中 公开的 3' 区域和薏苡辛（coixin) 3'UTR(U.S.专利 No. 6,635,806)。
[0073] 3'UTR通常具有用于特定基因的重组表达的有益用途。在动物系统中， 3' UTR 的机制已很好地定义（例如，Zhao 等，Microbiol Mol Biol Rev 63:405 -445，1999;Proudfoot，Nature 322:562-565, 1986 ;Kim 等，Biotechnology Progress 19:1620-1622,2003 ;Yonaha 和 Proudfoot，EMBO J. 19:3770-3777,2000 ;Cramer 等，FEBS Letters 498:179-182, 2001 ;Kuerstem 和 Goodwin, Nature Reviews Genetics 4:626-637,2003)。RNA转录的有效终止是防止不需要的性状不相关（下游）序列的转录 (其可能干扰性状性能）所需要的。多个基因表达盒彼此接近（例如在一个T-DNA内）的 排列可以引起所述构建体中一个或多个基因的基因表达与独立插入相比的抑制（Padidam 和Cao, BioTechniques 31:328-334, 2001)。这可以妨碍获得足够的表达水平，例如在其中 希望所有盒的强基因表达的情况中。
[0074] 在植物中，明确定义的聚腺苷酸化信号序列是未知的。Hasegawa等（Plant J. 33:1063-1072,2003)未能在Nicotiana sylvestris的体外和体内系统中确认保守的 聚腺苷酸化信号序列和确定原始（非聚腺苷酸化的）转录物的实际长度。弱3'UTR可以 产生通读，其可以影响位于相邻表达盒中的基因的表达（Padidam和Cao, BioTechniques 31:328-334, 2001)。转录终止的适当控制可以防止通读到位于下游的序列（例如，其它表 达盒）中且可以进一步允许RNA聚合酶的高效循环以改善基因表达。转录的有效终止（RNA 聚合酶II从DNA释放）是转录重新起始的必要条件且因此直接影响总体转录水平。在转 录终止后，成熟mRNA从合成位点和模板释放到胞质中。真核mRNA在体内以poly (A)形式 累积，使得难以通过常规方法检测转录终止。但是，通过生物信息学方法预测功能性的和有 效的3' UTR是困难的，因为不存在保守的序列以使得能够容易地预测有效的3' UTR。
[0075] 从实践的观点，可能有益的是用于转基因盒中的3'UTR具有特定特征。例如，根据 本发明可用的3'UTR可以高效地和有效地终止转基因的转录和防止转录物通读到任何相 邻DNA序列中，其可以由另一转基因盒（如在存在于一个T-DNA中的多个盒的情况中）或 T-DNA插入其中的相邻染色体DNA组成。最佳情况下，3' UTR不应受到用于驱动转基因的表 达的启动子、前导序列和内含子影响而引起转录活性的降低。在植物生物技术中，3'UTR通 常用于启动从转化的植物提取的反转录RNA的扩增反应且可以用于（1)在转基因盒一旦整 合到植物染色体中时评价转基因盒的转录活性或表达；（2)评价植物DNA内插入序列的拷 贝数；和（3)评价在育种后所得种子的接合性。3'UTR也可以用于从转化的植物提取的DNA 的扩增反应中以表征插入的盒的完整性。
[0076] 可用于在植物中提供转基因表达的3' UTR可以基于从信使RNA形成的cDNA文库 中已表达序列标签（EST)的表达来鉴定，该信使RNA从来源于例如大须芒草（Andropogon gerardii)> 鹿茅[Saccharum ravennae (Erianthus ravennae)]> 狗尾草(Setaria viridis)、墨西哥玉蜀黍（Zea mays 亚种 mexicana)、粟（Setaria italica)或薏该（Coix lacryma-jobi)的种子、花或任何其它组织分离。使用本领域技术人员已知的方法，cDNA 文库可以使用花组织、种子、叶、根或其它植物组织从分离自植物物种的组织制备。所得 的cDNA使用本领域中已知的各种测序方法测序。所得的EST使用生物信息学软件如 clc_ref_assemble_complete 版本 2. OL 37139 (CLC bio USA, Cambridge, Massachusetts 02142)组装成簇。各簇的转录物丰度通过计数各簇的cDNA阅读片段的数目确定。所鉴 定的3'UTR可以由源自cDNA序列的序列以及源自基因组DNA的序列组成。cDNA序列可 以用于设计引物，其然后可以用于按照制造商的方案构建的GenomeWalker?(Clontech Laboratories, Inc, Mountain View, CA)文库以克隆相应基因组DNA序列的3'区域而提供 更长的终止序列。相对转录物丰度通过直接计数或对于各组织文库的观察序列阅读片段的 标准化计数进行分析可以用于推断关于表达模式的性质。例如，一些3' UTR可以在根组织 中而不是在叶组织中更丰富的转录物中发现。这表明转录物在根中高度地表达且根表达的 性质可能归因于启动子、前导序列、内含子或3' UTR的转录调控。通过特定器官、组织或 细胞类型中的表达性质鉴定的3' UTR的经验测试可以导致增强这些特定器官、组织或细胞 类型中的表达的3'UTR的鉴定。可用于实施本发明的3'UTR提供为SEQ ID N0:9、10、ll和 12〇
[0077] 构建体和载体也可以包括转运肽编码序列，其表达可用于将蛋白质产物靶向于特 别是叶绿体、白色体或其它质体细胞器；线粒体；过氧化物酶体；液泡或细胞外位置的连接 肽。对于叶绿体转运肽的应用的描述，参见u. S.专利No. 5, 188, 642和5, 728, 925。许多 叶绿体定位的蛋白质作为前体由核基因表达并通过叶绿体转运肽（CTP)靶向于叶绿体。 这样的分离叶绿体蛋白质的实例包括，但不限于与核酮糖-1，5,-二磷酸羧化酶的小亚基 (SSU)、铁氧还蛋白、铁氧还蛋白氧化还原酶、获光复合物蛋白I和蛋白II、硫氧还蛋白F、 烯醇丙酮酸莽草酸磷酸合成酶（EPSPS)以及描述于U. S.专利No. 7, 193, 133的转运肽类 相关的那些。已在体内和体外证明，通过与异源CTP的蛋白质融合可将非-叶绿体蛋白质 靶向于叶绿体，并且CTP足以将蛋白质靶向于叶绿体。适合的叶绿体转运肽（例如拟南芥 EPSPS CTP (CTP2)(参见，Klee 等人，Mol. Gen. Genet.，210:437-442 (1987))或矮牵牛 EPSPS CTP (CTP4)(参见，della-Cioppa 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:6873-6877 (1986))) 的引入已显示在转基因植物中将异源EPSPS蛋白质序列靶向于叶绿体（参见，U. S.专 利 No. 5, 627, 061、5, 633, 435 和 5, 312, 910 及 EP 0218571、EP 189707、EP 508909 和 EP 924299)。
[0078] 可转录多核苷酸分子
[0079] 如本文中使用的，术语"可转录多核苷酸分子"是指任何能够被转录为RNA分子的 DNA分子，包括但不局限于具有蛋白质编码序列的那些以及产生具有用于基因抑制的序列 的RNA分子的那些。"转基因"是指与至少相对于其基因组中的位置对于宿主细胞异源的可 转录多核苷酸分子和/或人工并入当前或任何前代细胞的宿主细胞基因组中的可转录多 核苷酸分子。
[0080] 本发明的启动子可以可操作地连接相对于启动子分子为异源的可转录多核苷酸 分子。如本文中使用的，术语"异源的"是指当两个或更多个多核苷酸分子的组合通常不存 在于自然界中时的这种组合。例如，两个分子可来源于不同物种和/或两个分子可源自不 同基因，例如，来自相同物种的不同基因，或来自不同物种的相同基因。因此，如果这种组合 通常不存在于自然界中，则启动子相对于可操作地连接的可转录多核苷酸分子为异源的， 即与该启动子分子组合的该可转录多核苷酸分子不是天然发生地可操作地连接的。
[0081] 可转录多核苷酸分子通常可为其RNA转录体的表达为所需的任何DNA分子。RNA 转录体的这种表达可导致所得到的mRNA分子的翻译以及因此蛋白质的表达。可选地，例 如，可转录多核苷酸分子可设计为最终导致特定基因或蛋白质的表达降低。在一个实施方 案中，这可通过使用以反义方向定向的可转录多核苷酸分子来实现。本领域的普通技术人 员熟悉这种反义技术的使用。简而言之，当反义可转录多核苷酸分子被转录时，RNA产物在 细胞中与互补RNA分子杂交并且隔绝（sequester)互补RNA分子。这一双链RNA分子不能 通过细胞的翻译机制翻译为蛋白质，并且在细胞中降解。任何基因可以这种方式反向调控。
[0082] 因此，在本发明的一个实施方案中，调控元件（提供为SEQ ID NO: 1、2、3、4、6和8) 可操作地连接可转录多核苷酸分子，从而当将构建体整合到植物细胞的基因组中时以需要 的水平或以需要的模式调节可转录多核苷酸分子的转录。在一个实施方案中，可转录多核 苷酸分子包含基因的蛋白质编码区域，并且启动子影响被翻译和表达为蛋白质产物的RNA 分子的转录。在另一个实施方案中，可转录多核苷酸分子包含基因的反义区域，并且启动子 影响反义RNA分子、双链RNA或其他相似抑制性RNA分子的转录以抑制靶宿主细胞中特定 目的RNA分子的表达。
[0083] 具有农学意义的基因
[0084] 根据本发明的可转录多核苷酸分子可以是具有农学意义的基因。如本文中使用 的，术语"具有农学意义的基因"是指当在特定的植物组织、细胞或细胞类型中表达时赋予 所需特征例如与植物形态学、生理学、生长、发育、产量、产物、营养分布、疾病或害虫抗性和 /或环境或化学耐受性相关的特征的可转录多核苷酸分子。具有农学意义的基因包括，但 不限于编码产量蛋白、应激抗性蛋白、发育控制蛋白、组织分化蛋白、分生组织蛋白、环境响 应蛋白、衰老蛋白、激素响应蛋白、脱落蛋白（abscission protein)、源蛋白、SINK蛋白、花 调控蛋白、种子蛋白、除草剂抗性蛋白、疾病抗性蛋白、脂肪酸生物合成酶、生育酚生物合成 酶、氨基酸生物合成酶、杀虫蛋白或任何其他试剂例如用于抑制的靶向特定基因的反义或 RNAi分子的基因。具有农学意义的基因的产物可在植物中起作用以引起对植物生理学或代 谢的作用，或可在以植物为食的害虫的食物中作为杀虫剂起作用。
[0085] 在本发明的一个实施方案中，启动子被并入构建体中，以使启动子可操作地连接 作为具有农学意义的基因的可转录多核苷酸分子。为了获得农学有益性状，具有农学意义 的基因的表达是需要的。有益农学性状可以特别地包括，但不限于，例如除草剂耐受性、昆 虫控制、改良的产量、真菌疾病抗性、病毒抗性、线虫抗性、细菌疾病抗性、植物生长和发育、 淀粉产生、改良的油产生、高油产量、改良的脂肪酸含量、高蛋白质产量、果实成熟、提高的 动物和人类营养、生物聚合物、环境应激抗性、药用肽和可分泌肽、改善的加工性状、改善的 消化性、酶产生、味道、固氮、杂交种子产生、纤维产生和生物燃料产生。本领域已知的农学 意义的基因的实例包括具有除草剂抗性（U. S.专利No. 6, 803, 501、6, 448, 476、6, 248, 876、 6, 225, 114、6, 107, 549、5, 866, 775、5, 804, 425、5, 633, 435 和 5, 463, 175)、提高的产量 (U.S.专利 N〇.USRE38,446、6,716,474、6,663,906、6,476,295、6,441，277、6,423,828、 6,399,330、6,372,211、6,235,971、6,222,098 和 5,716,837)、昆虫控制（仄5.专利 No. 6, 809, 078、6, 713, 063、6, 686, 452、6, 657, 046、6, 645, 497、6, 642, 030、6, 639, 054、 6, 620, 988、6, 593, 293、6, 555, 655、6, 538, 109、6, 537, 756、6, 521，442、6, 501，009、 6, 468, 523、6, 326, 351、6, 313, 378、6, 284, 949、6, 281，016、6, 248, 536、6, 242, 241、 6, 221，649、6, 177, 615、6, 156, 573、6, 153, 814、6, 110, 464、6, 093, 695、6, 063, 756、 6, 063, 597、6, 023, 013、5, 959, 091、5, 942, 664、5, 942, 658、5, 880, 275、5, 763, 245 和 5, 763, 241)、真菌疾病抗性（U. S.专利 No. 6, 653, 280、6, 573, 361、6, 506, 962、6, 316, 407、 6,215,048、5,516,671、5,773,696、6，121，436、6,316,407 和 6,506,962)、病毒抗性 (U. S.专利 No. 6, 617, 496、6, 608, 241、6, 015, 940、6, 013, 864、5, 850, 023 和 5, 304, 730)、 线虫抗性（U.S.专利No. 6, 228, 992)、细菌疾病抗性（U.S.专利No. 5, 516, 671)、植物生 长和发育（U. S.专利 No. 6, 723, 897 和 6, 518, 488)、淀粉生产（U. S.专利 No. 6, 538, 181、 6, 538, 179、6, 538, 178、5, 750, 876和 6, 476, 295)、改良的油生产（U. S.专利No. 6, 444, 876、 6, 426, 447 和 6, 380, 462)、高油产量（U. S.专利 No. 6, 495, 739、5, 608, 149、6, 483, 008 和 6, 476, 295)、改良的脂肪酸含量（U. S.专利 No. 6, 828, 475、6, 822, 141、6, 770, 465、 6, 706, 950、6, 660, 849、6, 596, 538、6, 589, 767、6, 537, 750、6, 489, 461 和 6, 459, 018)、高蛋 白质产量（u. S.专利No. 6, 380, 466)、果实成熟（U. S.专利No. 5, 512, 466)、提高的动物和 人类营养（U. S.专利 No. 6, 723, 837、6, 653, 530、6, 5412, 59、5, 985, 605 和 6, 171，640)、生 物聚合物（U. S.专利 No. USRE37, 543、6, 228, 623、5, 958, 745 和 6, 946, 588)、环境应激抗 性（U. S.专利 No. 6, 072, 103)、药用肽和可分泌肽（U. S.专利 No. 6, 812, 379、6, 774, 283、 6, 140, 075和6, 080, 560)、改善的加工性状（U. S.专利No. 6, 476, 295)、改善的消化性 (U. S.专利No. 6, 531，648)、低棉子糖（U. S.专利No. 6, 166, 292)、工业酶产生（U. S.专利 No. 5, 543, 576)、改良的味道（U. S.专利 No. 6, 011，199)、固氮（U. S.专利 No. 5, 229, 114)、 杂交种子产生（U. S.专利 No. 5, 689, 041)、纤维产生（U. S.专利 No. 6, 576, 818、6, 271，443、 5, 981，834 和 5, 869, 720)和生物燃料产生（U. S.专利 No. 5, 998, 700)。
[0086] 可选地，具有农学意义的基因可以通过编码引起内源基因的基因表达的靶向调 节的RNA分子而影响以上所述的植物特征或表型，例如通过反义物（参见，例如，U.S.专 利5, 107, 065)、抑制性RNA ( "RNAi "，包括通过miRNA、siRNA、反式作用siRNA和相 控sRNA介导的机理的基因表达调节，例如，如描述于公开的申请US2006/0200878和US 2008/0066206及U. S.专利申请No. 11/974, 469中），或共抑制介导的机理。RNA也可以为 催化的RNA分子（例如，核酶或核开关；参见例如，US 2006/0200878)，其经工程化以切割 所希望的内源性mRNA产物。因此，编码影响农学重要表型或目的形态学变化的转录RNA分 子的任何可转录多核苷酸分子可用于实施本发明。用于构建构建体和将构建体引入细胞 内从而将可转录多核苷酸分子转录至能够引起基因抑制的分子中的方法在本领域中是已 知的。例如，在植物中使用具有反义定向的可转录多核苷酸分子的构建体进行转录后基因 抑制以调控基因表达公开于U. S.专利No. 5, 107, 065和5, 759, 829中，并且在植物中使用 具有正义定向的可转录多核苷酸分子的构建体进行转录后基因抑制以调控基因表达公开 于U.S.专利No. 5, 283, 184和5, 231，020中。在植物细胞中表达可转录多核苷酸也可用 于抑制以该植物细胞为食的植物害虫，例如，从鞘翅目害虫分离的组合物（U.S.专利公开 No. US2007/0124836)和从线虫害虫分离的组合物（U. S.专利公开No. US2007/0250947)。植 物害虫包括，但不限于节肢类害虫、线虫害虫和真菌或微生物害虫。用于并入本发明的构建 体中的示例性可转录多核苷酸分子包括，例如，来自于不同于目标物种之外物种的DNA分 子或基因，或起源于或存在于相同物种但通过遗传工程方法而不是经典繁殖或育种技术并 入受体细胞中的基因。多核苷酸分子的类型可以包括，但不限于已经存在于植物细胞中的 多核苷酸分子、来自另一植物的多核苷酸分子、来自不同生物体的多核苷酸分子或外部产 生的多核苷酸分子（例如含有基因的反义信息的多核苷酸分子，或编码人工的、合成的或 另外修饰形式的转基因的多核苷酸分子）。
[0087] 选择标记
[0088] 如本文中使用的术语"标记"是指任何可转录多核苷酸分子，其表达或其缺乏可 以某种方式筛选或评分。用于实施本发明的标记基因包括，但不限于编码葡萄糖醛酸 酶0^3，描述于。5.专利5,599,670中）、绿色荧光蛋白及其变体（6--，描述于。5.专 利5, 491，084和6, 146, 826中）、赋予抗生素抗性的蛋白质或赋予除草剂耐受性的蛋白质 的可转录多核苷酸分子。可用的抗生素耐药性标记，包括编码赋予卡那霉素（nptll)、潮霉 素 B(aph IV)、链霉素或壮观霉素（aad，spec/strep)和庆大霉素（aac3和aacC4)耐药性 的蛋白质的那些标记是本领域公知的。已证实转基因植物的耐受性并且本发明方法可应 用的除草剂可以包括，但不限于：氨基-甲基-膦酸、草甘膦、草丁膦、磺酰脲类、咪唑啉酮、 溴草腈、茅草枯、麦草畏、环己二酮、原卟啉原氧化酶抑制剂和异卩惡唑草酮（isoxasfIutole) 除草剂。编码参与除草剂耐受性的蛋白质的可转录多核苷酸分子在本领域是已知的，并且 可以包括，但不局限于编码5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶（用于草甘膦耐受性的 EPSPS，描述于 U. S.专利 5, 627, 061、5, 633, 435、6, 040, 497 和 5, 094, 945 中）的可转录多 核苷酸分子；编码草甘膦氧化还原酶和草甘膦-N-乙酰基转移酶（G0X，描述于U. S.专利 5,463, 175中、GAT，描述于美国专利公开No. 2003/0083480中）以及麦草畏单加氧酶（描述 于U. S.专利公开No. 2003/0135879中）的可转录多核苷酸分子；编码溴草腈腈水解酶（用 于溴草腈耐受性的Bxn，描述于U. S.专利4, 810, 648中）的可转录多核苷酸分子；编码用 于达草灭耐受性的八氢番茄红素去饱和酶（crtl)的可转录多核苷酸分子（描述于Misawa 等人，Plant Journal, 4:833-8401993 和 Plant Journal, 6:481-4891994 中）、编码用于横 酰脲类除草剂耐受性的乙酰羟酸合成酶（AHAS，也就是ALS)的可转录多核苷酸分子（描述 于 Sathasiivan 等人，Nucl. Acids Res.，18:2188-21931990 中），以及用于草丁勝和双丙 氨磷耐受性的bar基因（描述于DeBlock等人，EMBO Journal, 6:2513-25191987中）。本 发明的启动子分子可表达连接的可转录多核苷酸分子，其编码草胺膦（phosphinothricin) 乙酰基转移酶、草甘膦抗性EPSPS、氨基糖苷磷酸转移酶、羟苯基丙酮酸酯脱氢酶、潮霉素磷 酸转移酶、新霉素磷酸转移酶、茅草枯脱齒素酶、溴草腈抗性腈水解酶、邻氨基苯甲酸合成 酶、芳氧基链烷酸酯双加氧酶、乙酰CoA羧化酶、草甘膦氧化还原酶和草甘膦-N-乙酰基转 移酶。
[0089] 包括于术语"选择标记"中的也有编码选择标记的基因，其分泌可作为识别或选择 转化细胞的方式检测。其实例包括编码可通过抗体相互作用识别的可分泌抗原的标记或甚 至编码可催化地检测的可分泌酶。可选择的分泌标记蛋白质划分为多个类别，包括（例如， 通过ELISA)可检测的小的可扩散的蛋白质、可在细胞外溶液中检测的小的活性酶（例如， α -淀粉酶、β -内酰胺酶、草胺膦转移酶）或插入或禁闭在细胞壁中的蛋白质（例如包括 在例如延伸表达单元中发现的前导序列的蛋白质或者与烟草致病性相关的蛋白质，也称为 烟草PR-S)。其他可能的选择标记基因对于本领域技术人员是明显的并且包含在本发明中。 [0090] 细胞转化
[0091] 术语"转化"是指将核酸引入受体宿主中。如本文中使用的，术语"宿主"是指细 菌、真菌或植物，包括细菌、真菌或植物的任何细胞、组织、器官或后代。例如，根据本发明 的宿主细胞可以是任何细胞或生物体如植物细胞、藻类细胞、藻类、真菌细胞、真菌、细菌细 胞、昆虫细胞等等。在一个实施方案中，宿主和转化的细胞可以包括来自以下的细胞：植物、 曲霉属、酵母、昆虫、细菌和藻类。具有特定兴趣的植物组织和细胞包括，但不限于原生质 体、愈伤组织、根、块茎、种子、茎、叶、幼苗、胚和花粉。
[0092] 如本文中使用的，术语"转化的"是指其中被引入外源多核苷酸分子（例如构建 体）中的细胞、组织、器官或生物体。引入的多核苷酸分子可被整合至受体细胞、组织、器官 或生物体的基因组DNA中，以使得被引入的多核苷酸分子被遗传至后续的后代。"转基因的" 或"转化的"细胞或生物体也包括细胞或生物体的后代，以及产生于在杂交中应用这种转基 因生物体作为母本并且显示由外源多核苷酸分子的存在导致的改变表型的育种程序的后 代。术语"转基因"是指含有一个或多个异源多核酸分子的细菌、真菌或植物。
[0093] 存在许多将多核酸分子引入植物细胞中的方法。该方法通常可以包括选择合适的 宿主细胞、使用重组载体转化宿主细胞以及获得转化的宿主细胞的步骤。合适的方法包括 细菌感染（例如农杆菌）、双元细菌人工染色体载体、DNA的直接递送（例如，通过PEG-介 导的转化）、干燥/抑制介导的DNA摄取、电穿孔、用碳化硅纤维搅拌以及DNA涂覆颗粒的加 速等（综述在 Potrykus等，Ann.Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. ,42:2051991 中）。
[0094] 将DNA分子引入细胞中的技术为本领域技术人员公知的。在本发明的实施中，通 过将植物DNA构建体引入植物基因组中来转化植物细胞的方法和材料可包括任何公知的 和证实的方法。任何转化方法可以用于用本发明的一个或多个启动子和/或构建体转化宿 主细胞。
[0095] 再生的转基因植物可以进行自花授粉以提供纯合的转基因植物。可选地， 从再生的转基因植物获得的花粉可与非转基因植物杂交，优选为农学重要物种的自 交系。通常用于不同性状和作物的育种方法的描述可见于几本参考书中的一本， 参见，例如，Allard, Principles of Plant Breeding, John Wiley&Sons，NY, U. of CA, Davis, CA, 50-98, 1960 ；Simmonds, Principles of crop improvement, Longman, Inc. , N Y, 369-399, 1979 ;Sneep 和 Hendriksen, Plant breeding perspectives, Wageningen(ed), Center for Agricultural Publishing and Documentation, 1979 ；Fehr, Soybeans:Impro vement, Production and Uses, 2nd Edition, Monograph. , 16:249, 1987 ；Fehr, Principles of variety development, Theory and Technique, (Vol I)和Crop Species Soybean(Vol 2) ,Iowa State Univ., Macmillan Pub. Co·, NY, 360-376, 1987。相反地，来自非转基因植 物的花粉可用于给再生的转基因植物授粉。
[0096] 可以分析转化的植物的目标基因的存在以及本发明调控元件所赋予的表达水 平和/或表达谱。本领域技术人员知道许多可用于分析转化的植物的方法。例如，植物 分析的方法包括，但不限于Southern印迹法或northern印迹法、基于PCR的方法、生 化分析、表型筛选方法、田间评估以及免疫诊断分析。可转录多核苷酸分子的表达可用 TaqMan⑧（Applied Biosystems, Foster City, CA)试剂和制造商描述的方法测量和 使用 TaqMan? Testing Matrix 确定 PCR 循环次数。可选地，Invader? (Third Wave Technologies, Madison, WI)试剂和制造商描述的方法可用于评估转基因表达。
[0097] 本发明植物的种子可从能繁殖的转基因植物收获并且用于生长本发明的转化植 物后代世代，包括包含本发明构建体和表达具有农学意义的基因的植物杂交系。
[0098] 本发明还提供本发明植物的部分。植物部分包括，但不限于叶、茎、根、块茎、种子、 胚乳、胚珠和花粉。本发明还包括和提供包含本发明的核酸分子的转化的植物细胞。
[0099] 转基因植物可将转基因多核苷酸分子传递至其后代。后代包括包含源自祖代植物 的转基因的任何可再生的植物部分或种子。转基因植物优选对转化的多核苷酸分子为纯合 的，并且作为有性繁殖的结果将该序列传递至所有后代。后代可从产生于转基因植物的种 子生长。然后，这些另外的植物可以进行自花授粉以产生植物的纯育品系。来自这些植物 的后代特别地评估基因表达。基因表达可通过例如western印迹法、northern印迹法、免 疫沉淀和ELISA的几种常见方法检测。
[0100] 尽管已概括地描述了本发明，通过参考以下实施例将会更加容易地理解本发明， 除非特别说明，这些实施例仅是示例性的且并不意图限制本发明。本领域技术人员应该理 解，以下实施例中公开的技术代表了本发明人发现的技术以很好地实施本发明。但是，本领 域技术人员应该理解，根据本发明公开的内容，可以对公开的【具体实施方式】做出许多改变， 并仍然会得到相同或相似的结果而不偏离本发明的精神和范围，因此提出或显示在所附附 图中的所有内容应被理解为示例性的而不是限制性的。 实施例
[0101] 实施例1
[0102] 从玉米分离的调控元件和相应的转录调控表达元件组
[0103] 调控元件从玉米分离，且构建包含玉米调控元件的转录调控表达元件组（EXP)序 列。
[0104] 玉米种子在美国北部在早至四月初的早植对玉米种子造成潜在有害的风险。例 如，长期的冷和湿田间条件可能阻止最佳萌发和成苗（seedling establishment)。通过转 录物谱分析和后续的表征，鉴定了几种候选基因，其显示可用于种子发育和萌发的表达模 式。来自候选基因的启动子和前导序列（此处分别称为P-Zm. Nac-1:1:2 (SEQ ID N0:3)和 L-Zm. Nac-1:1:1(SEQ ID NO:4))从玉米基因组DNA扩增并克隆和测序。
[0105] 基于专有和公共的基因组和EST序列设计扩增引物，其然后用于按照制造商的方 案构建的GenomeWalker?(Clontech Laboratories, Inc, Mountain View, CA)文库以克隆相 应基因组DNA序列的5'区域。使用这一序列，调控元件通过生物信息学方式在基因的5' 区域内鉴定。利用这一分析的结果，调控元件定义在基因编码序列上游的5'序列内。然后 设计引物以扩增调控元件。各调控元件的相应DNA分子使用包含独特限制性酶位点的引物 和从玉米分离的基因组DNA利用标准PCR条件扩增。这一克隆的序列包含玉米基因的蛋白 质编码区域上游的启动子和5' UTR序列。所得的DNA片段使用标准DNA克隆方法接合到基 础植物表达载体中并测序。
[0106] 鉴定的转录调控表达元件组（"EXP"）的序列在本文中提供为SEQ ID NO: 1、6和 8,如以下表1中所列的。启动子序列在本文中提供为SEQ ID N0:2。前导序列在本文中提 供为SEQ ID N0:3。内含子序列在本文中提供为SEQ ID N0:4、6和8。
[0107] 表1.从各种草物种分离的转录调控表达元件组（"EXP")、启动子、前导序列和内 含子
[0108]

【权利要求】
1. 一种DNA分子，其包含选自下组的DNA序列： a) 与SEQ ID N0:l、2、3、4、6或8中任一具有至少85%序列同一性的序列； b) 包含SEQ ID NO: 1、2、3、4、6或8中任一的序列；和 c) SEQ ID N0:l、2、3、4、6或8中任一的片段，其中所述片段具有基因调控活性； 其中所述序列与异源可转录多核苷酸分子可操作地连接。
2. 权利要求1的DNA分子，其中所述序列与SEQ ID NO: 1、2、3、4、6或8中任一的DNA 序列具有至少90 %的序列同一性。
3. 权利要求1的DNA分子，其中所述序列与SEQ ID NO: 1、2、3、4、6或8中任一的DNA 序列具有至少95 %的序列同一性。
4. 权利要求1的DNA分子，其中所述DNA序列包含基因调控活性。
5. 权利要求1的DNA分子，其中所述异源可转录多核苷酸分子包含具有农学意义的基 因。
6. 权利要求5的DNA分子，其中所述具有农学意义的基因赋予植物除草剂耐受性。
7. 权利要求5的DNA分子，其中所述具有农学意义的基因赋予植物害虫抗性。
8. -种转基因植物细胞，包含含有选自下组的序列的异源DNA分子： a) 与SEQ ID N0:l、2、3、4、6或8中任一具有至少85%序列同一性的序列； b) 包含SEQ ID NO: 1、2、3、4、6或8中任一的序列；和 c) SEQ ID N0:l、2、3、4、6或8中任一的片段，其中所述片段具有基因调控活性； 其中所述序列与异源可转录多核苷酸分子可操作地连接。
9. 权利要求8的转基因植物细胞，其中所述转基因植物细胞是单子叶植物细胞。
10. 权利要求8的转基因植物细胞，其中所述转基因植物细胞是双子叶植物细胞。
11. 一种转基因植物或其部分，其包含权利要求1的DNA分子。
12. 权利要求11的转基因植物的后代植物或其部分，其中所述后代植物或其部分包含 所述DNA分子。
13. -种转基因种子，其中所述种子包含权利要求1的DNA分子。
14. 一种转基因盒，其包含选自SEQ ID NO: 1、6和8的转录调控表达元件组，其中 所述转录调控表达元件组与异源编码序列可操作地连接，该异源编码序列与选自SEQ ID NO: 10、11、12和13的3'UTR可操作地连接。
15. 权利要求14的转基因盒，其包含如SEQ ID NO: 1所示的转录调控表达元件组，其 中所述转录调控表达元件组与异源编码序列可操作地连接，该异源编码序列与如SEQ ID NO: 10所示的3' UTR可操作地连接。
16. 权利要求14的转基因盒，其包含如SEQ ID N0:6所示的转录调控表达元件组，其 中所述转录调控表达元件组与异源编码序列可操作地连接，该异源编码序列与选自SEQ ID NO: 11和12的3' UTR可操作地连接。
17. 权利要求14的转基因盒，其包含如SEQ ID N0:8所示的转录调控表达元件组，其 中所述转录调控表达元件组与异源编码序列可操作地连接，该异源编码序列与选自SEQ ID NO: 12和13的3' UTR可操作地连接。
18. -种生产商品的方法，包括获得根据权利要求11的转基因植物或其部分，和从该 转基因植物或其部分生产所述商品。
19. 权利要求18的方法，其中所述商品是蛋白质浓缩物、蛋白质分离物、籽粒、淀粉、种 子、粗粉、面粉、生物质或种子油。
20. -种表达可转录多核苷酸分子的方法，包括获得根据权利要求11的转基因植物并 栽培植物，其中所述可转录多核苷酸被表达。
【文档编号】C12N5/14GK104364370SQ201380031796
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2013年4月10日 优先权日:2012年4月20日
【发明者】J·阿伦斯, S·彻里安, P·J·罗伊达, L·L·路非亚, W·吴, 谢嘉丽 申请人:孟山都技术公司