一种亲和性触角状酶固定化载体的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种亲和性触角状酶固定化载体及其制备方法，属于酶固定化领域。本发明的特征在于：亲和性触角状酶固定化载体的触角状的不同链长可通过氯乙酰化聚苯乙烯微球功能基-CH2Cl与单体的摩尔比的不同而获得，再通过酸或和碱分别对触角状的环氧载体进行部分开环或先全开环再部分闭环，得到不同环氧基分布的、亲和性触角状酶固定化载体。该载体应用于脂肪酶或蛋白酶的柔性固定化，得到部分开环载体效果最好。由于载体部分开环，在链末端会产生一些亲水性的基团，这些基团可能对固定化酶具有保护作用，使得酶活提高。
【专利说明】一种亲和性触角状酶固定化载体
(—)【技术领域】
[0001]本发明涉及一种亲和性触角状酶固定化载体，其特征在于该载体具有不同环氧基分布的结构。及可通过酸或和碱分别对触角状的环氧载体进行部分开环或先全开环再部分闭环制备，属于酶固定化【技术领域】。
(二)【背景技术】
[0002]在固定化载体上，接上一些有足够长度的且是亲水的分子链，即所谓的“柔性链”，而后再将酶结合到柔性链上。该柔性链可使载体表面的刚性及疏水性得到改善，而变得柔顺、亲水，使减少并缓解固定化过程中酶分子所受到的碰撞力，维持酶蛋白的正常构象，从而减少酶活的损失；同时被固定的酶仍有较高的自由度，可以较好地保留其游离态的均相催化活性。这种方法可称作“酶的柔性固定化”。该方法具有较好的研究价值和应用前景。
[0003]酶的柔性固定化技术的核心是载体的选择与制备。要求载体既具有亲水性，又要具有足够长的分子链。如沈斌等(沈斌，魏荣卿，刘晓宁，朱建星，欧阳平凯，胺化聚苯乙烯载体柔性固定化木瓜蛋白酶[J]，化工学报，2005,56?):1070~1075)以Mannich反应制备出胺化聚苯乙烯树脂，再以双醛淀粉为柔性链对木瓜蛋白酶进行柔性固定化，所得到的固定化酶相比手臂固定化酶，具有较高的酶活回收率，且稳定性得到了较好的提高；Bunyamin Karagoz 等(Karagoz B, Bayramoglu G, Altintas B, Bicak N, AricaM Y, Poly(styrene-divinylbenzene)beads surface functionalized with d1-blockpolymer grafting and mult1-modal ligand attachment:performance of reversiblyimmobilized lipase in ester synthesis[J].Bioprocess Biosyst Eng,2011,34(6):735~746)对交联聚苯乙 烯微球经乙酰氧基汞化反应、氯交换反应和2-溴乙酰溴反应三步进行表面修饰制备出溴乙酰化聚苯乙烯(PS-acyl-Br)大分子引发剂，再通过ATRP法先后将苯乙烯(St)和甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)嵌段接枝到该引发剂表面，合成出含环氧基链载体(PS-acyl-PS-b-PGMA)。或另用己二胺(HMDA)和戊二醛(GA)先后再对该载体胺化和醛基化，获得另一种载体(PS-acyl-PS-b-PGMA-HMDA-GA)。将上述两种载体对脂肪酶共价固定化，结果表明，经胺化和醛基化后的载体由于具有一定的亲水作用，其固定化酶酶活高于未经胺化和醛基化载体。
(三)
【发明内容】
[0004]本发明公开一种亲和性触角状酶固定化载体，通过酸或和碱分别对触角状的环氧载体进行部分开环或先全开环再部分闭环，得到不同环氧基分布的、亲和性触角状酶固定化载体，用于脂肪酶或蛋白酶的柔性固定化。结果表明，由于载体部分开环，在链末端会产生一些亲水性的基团，这些基团可能对固定化酶具有保护作用，使得酶活提高。
[0005]本发明所述的载体按以下步骤制备:由氯乙酰化聚苯乙烯微球，通过原子转移自由基聚合法(ATRP)进行单体如甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)或和丙烯酰胺(AM)共聚或和丙烯酸酯(MA)共聚接枝，合成得到一触角状的环氧载体，而后再通过酸或和碱分别对其进行部分开环或先全开环再部分闭环，得到不同环氧基分布的、亲和性触角状酶固定化载体，该载体可用于脂肪酶或蛋白酶的柔性固定化。
[0006]本发明所述的亲和性触角状酶固定化载体的触角状的不同链长可通过氯乙酰化聚苯乙烯微球功能基-CH2Cl与单体的摩尔比的不同而获得，其中氯乙酰化聚苯乙烯微球功能基-CH2Cl与丙烯酰胺或丙烯酸酯和甲基丙烯酸缩水甘油酯的摩尔比的范围为1: 5: 15至 1: 40: 120。
[0007]本发明所述的亲和性触角状酶固定化载体，其特征在于所述的亲和性触角状酶固定化载体可由不同链长的触角状的环氧载体经部分开环得到表面含有部分极性羟基基团的、相同或相近环氧基担载量的、不同链长的触角状酶固定化载体，由其固定化酶。
[0008]本发明所述的亲和性触角状酶固定化载体，其特征在于所述的亲和性触角状酶固定化载体可由不同链长的触角状的环氧载体经先全开环再部分闭环得到不同或相同或相近环氧基担载量的、不同链长的触角状酶固定化载体，由其固定化酶。
[0009]本发明的亲和性触角状酶固定化载体，可用于脂肪酶或蛋白酶的柔性固定化，其特征在于所述的不同环氧基分布的、亲和性触角状酶固定化载体固定化酶按以下步骤制备:首先将酶溶解于缓冲液中，再加入亲和性触角状酶固定化载体，在20~45°C振荡反应20~50h，反应结束后用相同的缓冲液清洗所制备的固定化酶数次后获得柔性固定化酶。
[0010]本发明所述的亲和性触角状酶固定化载体，其特征在于所述的亲和性触角状酶固定化载体由于部分开环，在链末端会产生一些亲水性的极性基团，这些极性基团的亲水性可起到与酶分子相容性改善的作用，进而在维持蛋白分子正常构象的环境下固定化酶，使得酶活提闻。
(三)【具体实施方式】
[0011]实施例1
[0012]取YCJOl脂肪酶0.4ml溶于15ml pH为7.8，浓度为0.1Omol / L的磷酸缓冲液中，然后在该溶液中加入0.1Og由氯乙酰化聚苯乙烯微球为引发剂，通过调节引发剂的功能基-CH2Cl与丙烯酰胺和甲基丙烯酸缩水甘油酯的摩尔比为1: 5: 15，经丙烯酰胺和甲基丙烯酸缩水甘油酯的ATRP接枝后，再经40ml浓度为0.07mol / L的HCl溶液部分开环
0.5h制得的亲和性触角状酶固定化载体，30°C摇床中振荡反应48h后，分离出制得的柔性固定化酶，用上述磷酸盐缓冲液清洗6~8次后测定其酶活。
[0013]实施例2
[0014]取木瓜蛋白酶10.0Omg溶于IOml pH为6.0，浓度为0.05mol / L的磷酸缓冲液中，然后在该溶液中加入0.1Og由氯乙酰化聚苯乙烯微球为引发剂，通过调节引发剂的功能基-CH2Cl与丙烯酸酯和甲基丙烯酸缩水甘油酯的摩尔比为1: 8: 24，经丙烯酸酯和甲基丙烯酸缩水甘油酯的ATRP接枝后，再经40ml浓度为0.20mol / L的HCl溶液先全开环lh，然后用20ml浓度为0.0150mol / L的NaOH溶液再部分闭环3h制得的亲和性触角状酶固定化载体，25°C摇床中振荡反应25h后，分离出制得的柔性固定化酶，用上述磷酸盐缓冲液清洗6~8次后测定其酶活。
[0015] 实施例3
[0016]取Candida mgosa 脂肪酶 50.0Omg 溶于 IOml pH 为 7.0,浓度为 0.1Omol / L 的憐酸缓冲液中，然后在该溶液中加入0.1Og由氯乙酰化聚苯乙烯微球为引发剂，通过调节引发剂的功能基-CH2Cl与丙烯酸酯和甲基丙烯酸缩水甘油酯的摩尔比为1: 10: 30，经丙烯酸酯和甲基丙烯酸缩水甘油酯的ATRP接枝后，再经40ml浓度为0.20mol / L的HCl溶液先全开环1.5h，然后用20ml浓度为0.0150mol / L的NaOH溶液再部分闭环5h制得的亲和性触角状酶固定化载体，37°C摇床中振荡反应30h后，分离出制得的柔性固定化酶，用上述磷酸盐缓冲液清洗6~8次后测定其酶活。
[0017]实施例4
[0018]取胰蛋白酶10.0Omg溶于5ml pH为7.5，浓度为0.1Omol / L的磷酸缓冲液中，然后在该溶液中加入0.1Og由氯乙酰化聚苯乙烯微球为引发剂，通过调节引发剂的功能基-CH2Cl与丙烯酰胺和甲基丙烯酸缩水甘油酯的摩尔比为1: 15: 45，经丙烯酰胺和甲基丙烯酸缩水甘油酯的ATRP接枝后，再经40ml浓度为0.07mol / L的HCl溶液部分开环Ih制得的亲和性触角状酶固定化载体，20°C摇床中振荡反应30h后，分离出制得的柔性固定化酶，用上述磷酸盐缓冲液清洗6~8次后测定其酶活。
[0019]实施例5
[0020]取猪胰脂肪酶10.0Oml溶于5ml pH为7.0，浓度为0.1Omol / L的磷酸缓冲液中，然后在该溶液中加入0.1Og由氯乙酰化聚苯乙烯微球为引发剂，通过调节引发剂的功能基-CH2Cl与丙烯酰胺和甲基丙烯酸缩水甘油酯的摩尔比为1: 20: 60，经丙烯酰胺和甲基丙烯酸缩水甘油酯的ATRP接枝后，再经40ml浓度为0.07mol / L的HCl溶液部分开环1.5h制得的亲和性触角状酶固定化载体，40°C摇床中振荡反应36h后，分离出制得的柔性固定化酶，用上述磷酸盐缓冲液清洗6~8次后测定其酶活。
[0021]实施例6
[0022]取蛋白酶10.0Omg溶于5ml pH为6.0，浓度为0.05mol / L的磷酸缓冲液中，然后在该溶液中加入0.1Og由氯乙酰化聚苯乙烯微球为引发剂，通过调节引发剂的功能基-CH2Cl与丙烯酸酯和甲基丙烯酸缩水甘油酯的摩尔比为1: 25: 75，经丙烯酸酯和甲基丙烯酸缩水甘油酯的ATRP接枝后，再经40ml浓度为0.20mol / L的HCl溶液先全开环4h,然后用20ml浓度为0.0150mol / L的NaOH溶液再部分闭环IOh制得的亲和性触角状酶固定化载体，30°C摇床中振荡反应20h后，分离出制得的柔性固定化酶，用上述磷酸盐缓冲液清洗6~8次后测定其酶活。
[0023]实施例7
[0024]取脂肪酶0.5ml溶于IOml pH为7.5，浓度为0.1Omol / L的磷酸缓冲液中，然后在该溶液中加入0.1Og由氯乙酰化聚苯乙烯微球为引发剂，通过调节引发剂的功能基-CH2Cl与丙烯酸酯和甲基丙烯酸缩水甘油酯的摩尔比为1: 30: 90，经丙烯酸酯和甲基丙烯酸缩水甘油酯的ATRP接枝后，再经40ml浓度为0.20mol / L的HCl溶液先全开环6h，然后用20ml浓度为0.0150mol / L的NaOH溶液再部分闭环15h制得的亲和性触角状酶固定化载体，40°C摇床中振荡反应36h后，分离出制得的柔性固定化酶，用上述的磷酸盐缓冲液清洗6~8次后测定其酶活。
[0025]实施例8
[0026]取胃蛋白酶50.0Omg溶于IOml pH为6.5，浓度为0.1Omol / L的磷酸缓冲液中，然后在该溶液中加入0.1Og由氯乙酰化聚苯乙烯微球为引发剂，通过改变引发剂的功能基-CH2Cl与丙烯酰胺和甲基丙烯酸缩水甘油酯的摩尔比为1: 40: 120，经丙烯酰胺和甲基丙烯酸缩水甘油酯的ATRP接枝后，再经40ml浓度为0.07mol / L的HCl溶液部分开环2h制得的亲和性触角状酶固定化载体，37°C摇床中振荡反应24h后，分离出制得的柔性固定化酶，用上述磷酸盐缓冲 液清洗6~8次后测定其酶活。
【权利要求】
1.一种亲和性触角状酶固定化载体，其特征在于该载体按以下步骤制备:由氯乙酰化聚苯乙烯微球，通过原子转移自由基聚合法或ATRP法进行单体如甲基丙烯酸缩水甘油酯即GMA或和丙烯酰胺即AM共聚或和丙烯酸酯即MA共聚接枝，合成得到一触角状的环氧载体，而后再通过酸或和碱分别对其进行部分开环或先全开环再部分闭环，得到不同环氧基分布的、亲和性触角状酶固定化载体，该载体可用于脂肪酶或蛋白酶的柔性固定化。
2.根据权利要求1所述的一种亲和性触角状酶固定化载体，其特征在于所述的亲和性触角状酶固定化载体的触角状的不同链长可通过氯乙酰化聚苯乙烯微球功能基-CH2Cl与单体的摩尔比的不同而获得，其中氯乙酰化聚苯乙烯微球功能基-CH2Cl与丙烯酰胺或丙烯酸酯和甲基丙烯酸缩水甘油酯的摩尔比的范围为1: 5: 15至1: 40: 120。
3.根据权利要求1或2所述的一种亲和性触角状酶固定化载体，其特征在于所述的亲和性触角状酶固定化载体可由不同链长的触角状的环氧载体经部分开环得到表面含有部分极性羟基基团的、相同或相近环氧基担载量的、不同链长的触角状酶固定化载体，由其固定化酶。
4.根据权利要求1或2所述的一种亲和性触角状酶固定化载体，其特征在于所述的亲和性触角状酶固定化载体可由不同链长的触角状的环氧载体经先全开环再部分闭环得到不同或相同或相近环氧基担载量的、不同链长的触角状酶固定化载体，由其固定化酶。
5.根据权利要求1或2或3或4所述的一种亲和性触角状酶固定化载体，将其用于脂肪酶或蛋白酶的柔性固定化，其特征在于所述的不同环氧基分布的、亲和性触角状酶固定化载体固定化酶按以下步骤制备:首先将酶溶解于缓冲液中，再加入亲和性触角状酶固定化载体，在20~45°C振荡反应20~50h，反应结束后用相同的缓冲液清洗所制备的固定化酶数次后获得柔性固定化酶。
6.根据权利要求1或2或3所述的一种亲和性触角状酶固定化载体，其特征在于所述的亲和性触角状酶固定化载体由于部分开环，在链末端会产生一些亲水性的极性基团，这些极性基团的亲水性可起到与酶分子相容性改善的作用，进而在维持蛋白分子正常构象的环境下固定化酶，使得酶活提高。`
【文档编号】C12N11/08GK103710332SQ201410001850
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2014年1月3日 优先权日:2014年1月3日
【发明者】刘晓宁, 杨长青, 魏荣卿 申请人:南京工业大学