利用gfp蛋白检测烟草遗传转化的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用GFP蛋白检测烟草遗传转化的方法，其将GFP蛋白的编码基因导入目的植物中获得转基因植物，通过检测转基因植物的根、茎、叶在紫外光的激发下是否呈现绿色荧光来检测烟草遗传转化，从而筛选出转化组织；本发明中将含有GFP蛋白的表达载体pB7WG2D通过农杆菌介导的叶盘法进行烟草的遗传转化，丛生芽诱导时期即可进行GFP蛋白的检测，确保了筛选出的丛生芽都是转化组织，并且避免了筛选剂的使用，节省了非转化组织的继代培养工作，从而提高了基因的遗传转化效率。
【专利说明】利用GFP蛋白检测烟草遗传转化的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种利用GFP蛋白检测烟草遗传转化的方法。
【背景技术】
[0002]转基因植物的检测通常采用PCR扩增、Southern杂交和ELISA等分子技术，这些检测技术必须在获得抗性植株后才能进行，并不能在培育转基因植株的过程中应用；且需要提取植株的基因组DNA或蛋白，对DNA或蛋白的纯度和浓度均高质量的要求。因此，有必要给出一种在转基因植株的培育过程进行实时、简便的检测的方案。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供一种利用GFP蛋白检测烟草遗传转化的方法，其可在烟草转基因植株的培育过程进行实时、简便的检测。
[0004]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
[0005]一种利用GFP蛋白检测烟草遗传转化的方法，具体操作为:将GFP蛋白的编码基因导入目的植物中获得转基因植物，通过检测转基因植物的根、茎、叶在紫外光的激发下是否呈现绿色荧光来检测烟草遗传转化，从而筛选出转化组织；
[0006]GFP蛋白编码基因的喊基序列如SEQ ID NO: I所不。
[0007]具体的操作为:
[0008]将表达载体pB7WG2D采用冻融法转化到根瘤农杆菌LBA4404中构建得到重组菌LBA4404/pB7WG2D ;表达载体pB7WG2D中含有启动子和连接在启动子下游的GFP蛋白的编码
基因;
[0009]将制备好的重组菌LBA4404/pB7WG2D的菌液进行活化，用菌液以共培养方式浸染烟草叶盘，暗培后将叶盘移入至恢复培养基恢复培养I周后移入丛生芽诱导培养基培养，然后荧光检测筛选转化的丛生芽，将其切下后移入伸长培养基继代培养，采用荧光检测继代培养获得的抗性苗，将发绿色荧光的再生苗移入生根培养基培养，获得组培植株，最后将组培植株经过驯化后，移入营养土中栽培。
[0010]启动子为花椰菜花叶病毒35S启动子和Ubiquitin启动子。
[0011]将烟草种子用次氯酸钠溶液消毒，用OD值在0.6~0.8之间的菌液以共培养方式浸染烟草叶盘5分钟，暗培3天。
[0012]本发明中将含有GFP蛋白的表达载体pB7WG2D通过农杆菌介导的叶盘法进行烟草的遗传转化，丛生芽诱导时期即可进行GFP蛋白的检测，确保了筛选出的丛生芽都是转化组织，并且避免了筛选剂的使用，节省了非转化组织的继代培养工作，从而提高了基因的遗传转化效率。
[0013]另外，虽然该方法相对于分子检测，操作简便，快速高效，且利用手携式长波紫外灯检测含有GFP的转基因植物，可以进行活体的实时检测，但是这种检测方法的还是存在一定的缺陷，亦即必须要有足够的GFP转录，如果GFP转录不足的话，就会导致荧光现象不足而检测不出来。因此，如何在GFP转录不足的情况下依然可以检测到强荧光信号也是本发明的关键，本发明通过法国VILBER Fusion FX7成像系统对GFP绿色荧光蛋白进行检测，Fusion FX7采用固定的H).95大光圈镜头，能够保证透光率最大，即使再微弱的光也能够被有效传至CXD传感器，另外，低于室温67 V的4级Pelti er制冷CXD，使得成像过程中所产生的暗电流更小，背景噪音更低，进一步保证了荧光检测的高灵敏度。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为FX7荧光检测筛选转化的丛生芽；
[0015]图2为FX7荧光检测伸长的丛生芽；
[0016]图3为PCR分别扩增GFP基因和BAR基因结果。
【具体实施方式】
[0017]为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0018]实施例1、培育转GFP烟草植株
[0019]将表达载体pB7WG2D采用冻融法转化到根瘤农杆菌LBA4404 (Invitrogen公司，产品编号18313015)中构建重组菌LBA4404/pB7WG2D。表达载体pB7WG2D中含有启动子和连接在启动子下游的GFP 蛋白的编码基因；启动子为花椰菜花叶病毒35S启动子和Ubiquitin启动子。
[0020]GFP蛋白编码基因的喊基序列如SEQ ID NO: I所不；
[0021]SEQ ID NO: I
[0022]tggtgaagactaatctttttctctttttcatcttttcacttctcctatcattatcctcggccgacatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagtteatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagaaggacgagctgtaa
[0023]将烟草种子用次氯酸钠溶液消毒，将制备好的重组菌LBA4404/pB7WG2D菌液进行活化，用OD (吸光)值在0.6-0.8之间的菌液以共培养方式浸染烟草叶盘5分钟，再暗培养3天。将暗培养后的叶盘移入到恢复培养基(B5大量盐和微量盐，MS铁盐，B5维生素，3%鹿糖，0.59g.L-1Mes, 1.7mg.L-16-BA, IOOmg.L-lcefotaxime, 0.8%琼脂，PH = 5.6)。
[0024]恢复培养I周后，移入丛生芽诱导培养基(Β5大量盐和微量盐，MS铁盐，Β5维生素，3 % 鹿糖，0.59g.L-lMes, 1.7mg.L-16-AP, IOOmg.L-lcefotaxime, 5mg.L-1PPT,
0.8%琼脂，PH= 5.6)，采用FX7荧光检测来筛选转化的丛生芽，如图1所示，将其切下后移入伸长培养基(MS大量盐和微量盐，MS铁盐，B5维生素，3%蔗糖，0.59g.L-1Mes,
0.1mg.L_1 IAA, IOOmg ?L-lcefotaxime, 0.8%琼脂，PH = 5.6),每隔 I 周继代 I 次。待伸长的抗性苗转入生根培养基之前，再次采用FX7荧光检测抗性苗，将发绿色荧光的再生苗(图2)移入生根培养基(1/2浓度的B5大量盐和微量盐，MS铁盐，2%蔗糖，0.59g.L-lMes, Img *L-1IAB,0.8%琼脂，PH = 5.6)，获得组培植株10株。最后将组培植株经过驯化后，移入营养土中栽培。
[0025]实施例2、转GFP烟草植株的PCR鉴定
[0026]分别提取上述获得的转化植株的基因组DNA，PCR分别检测GFP基因和BAR基因，结果如图3所示，野生型烟草均未扩增出GFP基因和BAR基因的特异条带，而经过绿色荧光蛋白筛选得到的10株转化植株，全部扩增出GFP基因和BAR基因的特异条带，转化率达到100%。
[0027]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范 围。
【权利要求】
1.一种利用GFP蛋白检测烟草遗传转化的方法，具体操作为:将GFP蛋白的编码基因导入目的植物中获得转基因植物，通过检测转基因植物的根、茎、叶在紫外光的激发下是否呈现绿色荧光来检测烟草遗传转化，从而筛选出转化组织； GFP蛋白编码基因的喊基序列如SEQ ID NO:I所不。
2.如权利要求1所述的利用GFP蛋白检测烟草遗传转化的方法，其特征在于，具体的操作为: 将表达载体PB7WG2D采用冻融法转化到根瘤农杆菌LBA4404中构建得到重组菌LBA4404/pB7WG2D ;表达载体pB7WG2D中含有启动子和连接在启动子下游的GFP蛋白的编码基因; 将制备好的重组菌LBA4404/pB7WG2D的菌液进行活化，用菌液以共培养方式浸染烟草叶盘，暗培后将叶盘移入至恢复培养基恢复培养I周后移入丛生芽诱导培养基培养，然后荧光检测筛选转化的丛生芽，将其切下后移入伸长培养基继代培养，采用荧光检测继代培养获得的抗性苗，将发绿色荧光的再生苗移入生根培养基培养，获得组培植株，最后将组培植株经过驯化后，移入营养土中栽培。
3.如权利要求2所述的利用GFP蛋白检测烟草遗传转化的方法，其特征在于:启动子为花椰菜花叶病毒35S启动子和Ubiquitin启动子。
4.如权利要求2所述的利用GFP蛋白检测烟草遗传转化的方法，其特征在于:将烟草种子用次氯酸钠溶液消毒，用OD值在0.6~0.8之间的菌液以共培养方式浸染烟草叶盘5分钟，暗培3天。
【文档编号】C12N15/64GK103993035SQ201410017274
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年1月7日 优先权日:2014年1月7日
【发明者】宋雯雯, 段方猛 申请人:青岛农业大学