一种转基因茄子的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种转基因茄子的制备方法，包括种子消毒、载体构建、预培养、浸染、分化和生根培养，选择培养基中包括IAA，ZT，Kan和Cef。本发明所述制备方法可以把各种优良农艺性状的调控基因转导到茄子中，从而可以快速提高茄子品质，加快育种进程。通过转基因工程，可以产生积累外源蛋白。转基因茄子的制备方法不仅是品种改良的有效方法，还可以作为生物工厂，应用到代谢工程上。
【专利说明】一种转基因前子的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及转基因植物的制备的方法，特别涉及转基因茄子的制备方法。
【背景技术】
[0002]爺子(Solanum melongena L., 2n = 24)起源于古印度,在热带和亚热带地区广泛种植，是我国的重要果菜之一。茄子极易受黄萎病、青枯病、枯萎病、绵疫病等多种病害以及线虫和各种昆虫的侵害，尽管有少数野生种质资源为抗病材料，但是它们所拥有的天然抗性不足以完全抵抗病虫害，而且不能在育种过程中被充分利用。在传统茄子育种中，由于连锁的毒害基因存在，导致育性不兼容，若想得到可育的后代，需要花费更长时间(Pratap etal.，2011)。分子生物学和农杆菌介导的基因转化的研究进展，可将克隆的重要农艺性状及抗病调控基因被基因转导人茄子优良品种中，因此可快速改良品种，提高抗病性，加速育种进程(Mariashibu et al.，2012)。如 Rotino 等(Rotino et al.，1997)米用基因工程手段，在茄子子房中特异表达生长素合成基因，使生长素含量大大增加，导致子房未经受精而直接膨大发育成果实，获得了单性结实品种，并在番茄、草莓、悬钩子、葡萄等蔬菜水果上利用同样的转基因工程，均得到单性结实品种(Rotino et al., 1997, 2005; Ficcadenti etal.,1999;Mezzetti et al.，2004)。
[0003]到目前为止，关于茄子转基因的研究进展，已在多个文献中被公布。如以根为外植体，含 0.lmg/L TDZ,3mg/L6-BA, 100mg/L Kan 和 500mg/L Cef 的 MS 固体培养基上，4 周后可通过愈伤组织获得不定芽(Franklin et al.，2003)。以无菌苗子叶为外植体，在含2.5mg/L6-BA,0.5mg/L IAA, 100mg/L Kan和500mg/LCef的MS培养基上进行再生培养，能获得再生苗(Prabhavathi and Yadav, 2002)。Arpaia等以子叶为外植体,再生培养基选择0.5mgl/L ZEA, 0.3mgl/L6-BA, 0.2mgl/L KIN和 0.lmgl/L NAA(Arpaia et al.，1997)。张兴国等以下胚轴为外植体，确定lmg/L`的ZT和l-3mg/L的BA组合时均获得70%以上的芽再生率，150mg/L的Kan浓度为最适选择压(张兴国等2001)。Singh(2010)等以茎为外植体，携带有aadA基因的pPRVlllA载体通过基因枪哄击,成功获得转基因爺子。Subramanyam等用茄子种子为外植体，在3mg/L的MS液体培养基中预培养18h后，含有IOOyM乙酰丁香酮，
0.2%Si lwett L-77的MS液体农杆菌悬浮液侵染20 min后，通过500mm Hg真空导入，在MS培养基上进行培养，获得转基因苗(Kondeti Subramanyam et al.，2013)。通常一般载体利用Kan作为抗性基因，Khan等利用pMAT21载体，构建无抗性基因的载体，以子叶为外植体，通过MS培养基，获得转基因苗。
[0004]虽然这些体系都能获得转基因苗，但是材料基因型非常重要，不同基因型材料的再生能力差异很大，也影响再生的途径(金丹丹等2004)。因此尽管已有这么多成功案例被公布，但是以浙江省大面积种植的紫红线茄基因型运用这些转基因体系时，不管是根、茎、带柄子叶还是叶片，作为外植体都不能获得转基因植株。作为一种重要的经济作物，茄子转基因研究是非常重要的，如果能充分利用高效的转基因体系，可以将一些重要而优良的农艺性状调控基因转导到茄子中，从而可以快速改良品种。因此结合本地育种目标，创建适合本地育种品种的转基因体系非常重要，可以大大提升本省人民喜欢的茄子品种的品质提升。
【发明内容】
[0005]为了解决现有技术中存在的不足，本发明提供了一种新的最有效最适宜紫红线茄的转基因方法，包括种子消毒、载体构建、预培养、浸染、分化和生根培养，其特征在于，预培养基中包括吲哚乙酸(Indole-3-acetic acid,简称IAA)和玉米素(Zeatin,简称ZT),选择培养基中包括IAA, ZT,卡那霉素(Kanamycin,简称Kan)和头孢氨节(Cefotaxime,简称Cef)。
[0006]进一步地，IAA浓度选自 0.3-0.8mg/L，ZT 浓度为 2mg/L，Kan 浓度为 25mg/L，Cef为 500mg/L。
[0007]进一步地，IAA浓度为0.5mg/L, ZT浓度为2mg/L, Kan浓度为25mg/L, Cef浓度为500mg/L。
[0008]进一步地，种子消毒方法包括:种子经75%乙醇处理30s，10%NaC10表面消毒15min，无菌水洗漆4~5次。
[0009]进一步地，种子消毒后在MS固体培养基中培养，所述固体培养基中添加较低浓度的 Cef。
[0010]进一步地，M S固体培养基包括3%蔗糖和200mg/LCef。
[0011]进一步地，载体的构建方法包括:引物序列为SmARF8-1NT-F和SmARF8_INT-R，PCR克隆后获得294bp片段，PCR产物位于SmARF8基因1609bp_1902bp区段；2个PCR片段分别以3’-5’和5’-3’方向构建到PBS-1n载体玉米NIRl基因第二个内含子片段两端后，用Sac I和Pst I进行双酶切，获得含有内含子结构及2个PCR片段的片段AjfPCAMBIA1300进行改造，CaMV35S启动子亚克隆到pCAMBIA1300载体的EcoRI和SacI酶切位点之间，豌豆RubiscoE9基因的poly (A)序列插入到HindIII和PstI酶切位点之间，成功获得PCAMBIAI35S-1300载体。酶切后的片段A，用T4DNA连接酶构建到PCAMBIAI35S-1300载体上；将含有35S启动子、片段A和poly㈧终止子的载体经EcoR I和Hind III酶切后，构建到PCAMBIAI35S-2300载体上，成为含有NPT II抗性基因的复合表达载体PCAMBIAI35S-2300-SmARF8-1NT。
[0012]进一步地，预培养的方法包括:超净台下将无菌苗的外植体，接种到预培养基上；25°C,16h光照/8h黑暗的条件下生长2天。
[0013]进一步地，分化培养的方法包括:农杆菌侵染后的外植体，在选择培养基上生长，直到未经愈伤分化而直接长出不定芽，从外植体上切下不定芽后继续在选择培养基上生长获得健壮分化苗。
[0014]进一步地，选用茎作为外植体进行预培养。
[0015]本发明的有益效果是:(I)由于茄子种子较大，10%NaC10表面消毒15min，并在MS发芽培养基中添加较低浓度的Cef，可抑制污染，获得无菌苗。(2)将2个SmARF8基因294bp的PCR扩增片段分别以相反方向构建到含有玉米NIRl基因第二个内含子结构两端，然后被转导到植物体内时，能形成发夹结构，从而达到干涉内源基因SmARFS，使它们不能进行转录表达的目的。(3)无菌苗的茎外植体在含0.5mg/L IAA浓度，2mg/L ZT激素培养基上生长，茎能未经愈伤分化，而直接长出不定芽，出芽效率达到80%。并经RT-PCR，qRT-PCR和Sourthen blot分析验证,转基因效果良好,成功获得爺子转基因植株。本发明所述转基因茄子的制备方法，可以把各种优良农艺性状的调控基因转导到茄子中，从而可以快速提高茄子品质，加快育种进程。通过转基因工程，可以产生积累外源蛋白，转基因茄子的制备方法不仅是品种改良的有效方法，还可以作为生物工厂，应用到代谢工程上。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1:PCAMBIAI35S-2300-SmARF8-1NT载体构建过程框架图。A:含有玉米NIRl基因第二个内含子的PBS-1n载体，SmARF8基因的294bp PCR片段分别以相反方向构建到内含子区域两端，然后用Sac I和Pst I进行酶切，被命名为片段A。B:PCAMBIAI35S-1300-SmARF8-1NT载体T-DNA区域。片段A被构建到载体上，受35S启动子启动表达。C:PCAMBIAI35S-2300-SmARF8-1NT载体T-DNA区域。含有35S启动子和终止子的区域经EcoR I和Hind III酶切后，重组构建到PCAMBIAI35S-2300载体上。35S启动子启动NPT II基因和片段A的表达。基因转录表达方向用箭头表示，酶切位点用直线表示。
[0017]图2:含有PCAMBIAI35S-2300-SmARF8-1NT载体的转基因茄子发育过程。A、B:Kan抗性分化苗在 0.5mgl/L IAA, 2mgl/L ZT, 25mgl/L Kan 和 500mgl/LCef 的 MS 选择培养基生长与发育21d和28d ；C:子叶外植体在同样培养基上没有出现分化苗；D:分化苗在选择培养基上继续伸长；E:分化苗在MS培养基上生根；F:生根后转基因植株转移到塑料钵中生长；G植株在温室中生长结果。
[0018]图3:非转基因对照和PCAMBIAI35S-2300-SmARF8-1NT融合载体导入的转基因植株(TO)的 RT-PCR，qRT-PCR 和 Sourthern blot 验证分析。A、B:RT_PCR 和 qRT-PCR 分析鉴定SmARF8基因的转录表达水平。M:DNA marker。1:非转基因对照植株。2_6:转基因植株cDNA被扩增。C =RT-PCR验证过的转基因植株的Southern blot杂交分析。1-2:非转基因对照植株，3-7:转基因植株。
【具体实施方式】
[0019]下面结合具体实施例对本发明进行详细的说明。这些具体的实施例仅仅是在不违背本发明精神下的有限列举，并不排除本领域的一般技术人员把现有技术和本发明结合而产生的其他具体的实施方案。
[0020]实施例1种子消毒及无菌苗的制备
[0021]材料:紫红线茄E666、E25、E22 和 E673。
[0022]本发明所述 的消毒方法对紫红线茄消毒，所述消毒方法包括:精选的紫红线茄种子经75%乙醇处理30s，10%NaC10表面消毒15min，无菌水洗涤4~5次，接种到含3%蔗糖的MS固体培养基上(200mg/LCef )，并以不加抗生素为对照。每瓶放置20粒种子，3次重复。在25°C ±1°C，黑暗中培养一个星期后，光照强度为50μπιΟ1.m-2.s_2，每天光照16h的光照培养箱内继续生长21d，培育出无菌小苗。
[0023]采用现有技术的消毒方法对紫红线茄种子消毒，所述消毒方法为:精选的种子经75%乙醇处理30s, 0.l%HgCl消毒Imin和0.l%HgCl消毒2min两种消毒方式分别处理，无菌水洗涤4~5次，接种到含3%蔗糖的MS固体培养基上(200mg/LCef)，不加抗生素为对照。每瓶放置20粒种子，3次重复。在25°C ±1°C，黑暗中培养一个星期后，光照强度为50 μ mo I.π2.s'每天光照16h的光照培养箱内继续生长21d,培育出无菌小苗。
[0024]比较上述三种方法的消毒效果。采用现有技术中的0.l%HgCl消毒Imin和
0.l%HgCl消毒2min处理过的种子，播种在不含Cef抗生素的MS固体培养基上生长发芽后，消毒2min的种子不会污染，但是发芽率只有10% ;而消毒Imin的种子污染率为50%，发芽率也只有50%。因此这种HgCl消毒方式不适合茄子无菌苗的获得。采用本发明所述的消毒方法，10%NaC10消毒15min处理过的种子，播种在不含Cef抗生素的MS固体培养基上时，污染率为30%，但是发芽率达到80-90%。MS固体培养基中加入200mg/LCef，就不会发生污染事件，发芽率也没有受影响。因此本发明所述的10%NaC10消毒15min的种子消毒方法，以及将消毒后的种子播种在含200mg/LCef的MS固体培养基中培养，非常适合制备茄子的无菌苗，且发芽率高，效果明显优于现有技术的方法。
[0025]实施例2载体构建
[0026]根据茄子生长素响应因子SmARF8基因(FJ597628) cDNA序列设计引物SmARF8-1NT-F 和 SmARF8_INT-R (表 1)，PCR 克隆获得 294bp 片段，PCR 产物位于 SmARF8 基因 1609bp-1902bp 区段。
[0027]表1引物序列
[0028]
【权利要求】
1.一种转基因爺子的制备方法，包括种子消毒、载体构建、预培养、浸染、分化和生根培养，其特征在于，预培养基中包括吲哚乙酸和玉米素，选择培养基中包括吲哚乙酸，玉米素，卡那霉素和头孢氨苄。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，吲哚乙酸浓度选自0.3-0.8mg/L，玉米素浓度为2 mg/L,卡那霉素浓度为25 mg/L,头孢氨节浓度为500 mg/L。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，吲哚乙酸浓度为0.5mg/L，玉米素浓度为2 mg/L,卡那霉素浓度为25 mg/L,头孢氨节浓度为500 mg/L。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，种子消毒方法包括:种子经75%乙醇处理30s，10 % NaClO表面消毒15 min，无菌水洗涤4~5次。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，种子消毒后在MS固体培养基中培养，所述固体培养基中添加较低浓度的头孢氨苄。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，MS固体培养基包括3%蔗糖和200mg/L头孢氨节。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，载体的构建方法包括:引物序列为SmARF8-1m-￥和^k^P/^-1NT-R，PCR克隆后获得294 bp片段，PCR产物位于SmARF8基因1609bp-1902bp区段；2个PCR片段分别以3’-5’和5’-3’方向构建到PBS_in载体玉米Λ?7基因第二个内含子片段两端后，用fee /和/进行双酶切，获得含有内含子结构及2个PCR片段的片段A ;将pCAMBIA1300进行改造，CaMV 35S启动子亚克隆到pCAMBIA1300载体的及?01?1和SacI酶切位点之间，豌豆沿/Ai1Sco烈基因的poly (A)序列插入到/--(6/111和AiI酶切位点之间，成功获得PCAMBIAI 35S-1300载体；酶切后的片段A，用T4 DNA连接酶构建到PCAMBIAI 35S-1300载体上；将含有35S启动子、片段A和poly (A)终止子的载体备EcoR /和历fli////酶切后，构建到PCAMBIAI 35s_2300载体上，成为含有MT JJ抗性基因的复合表达载体 PCAMBIA I 355-2300-5^7^^-1^。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，预培养的方法包括:超净台下将无菌苗的外植体，接种到预培养基上；25 °C, 16 h光照/8 h黑暗的条件下生长2天。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，分化培养的方法包括:农杆菌侵染后的外植体，在选择培养基上生长，直到未经愈伤而直接长出不定芽，从外植体上切下不定芽后继续在选择培养基上生长获得健壮分化苗。
10.根据权利要求8和9之一所述的制备方法，其特征在于，选用茎作为外植体进行预培养。
【文档编号】C12N15/84GK103805632SQ201410041131
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年1月28日 优先权日:2014年1月28日
【发明者】包崇来, 杜黎明, 毛伟海, 胡天华, 朱琴妹, 胡海娇, 何群燕 申请人:浙江省农业科学院