EVs-TRPC5在检测乳腺癌耐药程度中的应用的制作方法
【专利摘要】EVs-TRPC5在检测乳腺癌耐药程度中的应用，具体检测方法为：（1）收集患有乳腺癌的病人或动物的血液样本，分别通过离心去除样本中的完整细胞、血小板及细胞碎片，最后离心收集样本中的EVs；（2）可用RT-PCR法或者Elisa法检测收集到的EVs中TRPC5的表达情况，若TRPC5表达阳性，为出现耐药性的可疑病人或动物。本发明根据血液EVs中TRPC5的表达的高低，可显示出乳腺癌肿瘤细胞耐药转变的情况，具有检测方法简单、速度快、灵敏度高、成本低的优点。
【专利说明】EVs-TRPC5在检测乳腺癌耐药程度中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及TRPC5的一种新用途，尤其是涉及细胞外囊泡(EVs)的瞬时受体电位通道(TRPC5)在检测乳腺癌耐药程度中的应用。
【背景技术】
[0002]乳腺癌是女性常见的癌症，严重威胁女性身心健康。中国抗癌协会公布的最
新统计数字显示，从20世纪90年代以来，乳腺癌发病率和死亡率均持续稳定上升，发病率以每年4.476%的速度增长，死亡率以每年3%的速度增长。化学药物治疗是乳腺癌的主要治疗手段之一，目前临床常用药物有:(i )蒽环类，紫杉类，抗代谢类，抗微管类，烷化齐U，杂类等；(ii)抗雌激素，芳香化酶抑制剂等；(iii)曲妥珠单抗(抗Her-2)、贝伐单抗(抗VEGF)ο
[0003]但是，据美国癌症协会报道，90%以上肿瘤患者死于不同程度的化疗耐药。对化疗药物产生耐药已经成为肿瘤治疗的一大难题。经过近几十年的研究，目前发现的耐药机制有(I)细胞膜ABC药物转运蛋白表达增强，减少药物摄入及增加药物排出，P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)是目前研究最多也是最为重要的ABC药物转运蛋白，由多药耐药基因mdrl编码；(2)通过使药物发生异化降低药物活性，常见的酶有GST、CYP450等；(3)药物作用靶点突变或表达水平变化等；(4)肿瘤异质性；(5)肿瘤干细胞耐药等。
[0004]目前，早期诊断肿瘤的最新、最有效的方法是通过验血寻找肿瘤标记物。肿瘤标志物指的是在肿瘤发生、发展的过程中，能反应细胞癌变的一些细胞内物质。临床上通过对各种肿瘤标志物的检测，可以对相应肿瘤做早期诊断、检测疗效和肿瘤复发状况。因此，在深入研究耐药机制的基础上，开发乳腺癌耐药分子诊断指标、方法，实现试剂化，达到耐药早期、动态监测，在现阶段对于乳腺癌耐药的诊疗至关重要，也为优化药物结构设计、研发耐药逆转药物提供有益借鉴，因而具有重大而现实的社会价值。
[0005]MUCl是一种粘蛋白，在正常细胞表达时是一种跨膜糖蛋白，正常情况下，在乳腺、胃肠道及泌尿生殖道的上皮细胞顶端表达，糖基化完全。MUCl度正常上皮起润滑和保护作用、介导信号转导和细胞黏附。
[0006]在乳腺癌细胞株MCF-7中通过磷酸化，MUCl能结合Rrb/SOS，参与受体酪氨酸激酶介导的信号转导，而酪氨酸磷酸化是膜受体参与信号转导的一个关键步骤。乳腺癌MUCl的表达特点包括:高表达、异常表达低；糖基化、高唾液酸化；顶端定为不清，极性混乱；细胞浆和细胞表面都有过度表达，并且这些分子会从乳腺癌细胞进入血清。有研究者检测基底样乳腺癌患者，发现高表达MUC1，大约有92%的患者能检测出过表达的MUC1。
[0007]TRPC5 是瞬时受体电位通道(transient receptor potential channels, TRP 通道)家族的一个亚型，它是细胞膜上能通透钙离子的非选择性通道，主要分布于脑、肺、睾丸和胎盘，并主要参与生长锥的形成和脑的发育。本研究室研究发现，瞬时受体电位通道TRPC5与肿瘤多药耐药密切相关，TRPC5在耐阿霉素的乳腺癌细胞(MCF-7/ADM)中发生明显上调，并能间接介导肿瘤产生多药耐药的P-gp蛋白在多药耐药肿瘤细胞(如MCF-7/ADM)中的表达水平。本 申请人:针对该性质申请了相关专利，专利名称为《TRPC5作为药物靶点在逆转肿瘤多药耐药中的应用》(专利号:201210318389.5)。
[0008]细胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)是指细胞外环境含有大量可移动的细胞膜来源的囊泡。这些EVs主要包括外来体exosomes、微泡microvesicles以及凋亡小体apoptotic bodies,这些动态的EVs在细胞间交流和免疫调节过程中起着至关重要的作用。脂後标记蛋白flotillin-2在EVs上特异表达,可作为特异性标志物应用于研究过程中。肿瘤细胞也产生EVs，研究者在恶性胶质瘤、胰腺癌、胃癌和急性白血病病人的血液中发现都有大量的EVs存在。这些EVs中包含有细胞表面蛋白、RNA及DNA，通过EVs将囊泡内容物由供体细胞向受体细胞转运，从而介导细胞间交流，进而引发肿瘤的迁移和侵袭，然而这些EVs结构的形成原因及其与乳腺癌化疗耐药的相关性还有待进一步研究。
【发明内容】
[0009]针对现有技术存在的上述问题，本 申请人:提供了一种EVS-TRPC5在检测乳腺癌耐药程度中的应用。本发明根据血液EVs中TRPC5的表达的高低，可显示出乳腺癌肿瘤细胞耐药转变的情况，具有检测方法简单、速度快、灵敏度高、成本低的优点。
[0010]本发明的技术方案如下:
EVS-TRPC5在检测乳腺癌耐药程度中的应用，具体检测方法为:
(O收集患有乳腺癌的病人或动物的血液样本，分别通过离心去除样本中的完整细胞、血小板及细胞碎片，最后离心收集样本中的EVs ；
(2)可用RT-PCR、Elisa等方法检测收集到的EVs中TRPC5的表达情况，若TRPC5表达阳性，为出现耐药性的可疑病人或动物。
[0011]本发明有益的技术效果在于:
1、本发明通过检测血液EVs中TRPC5的表达水平，作为一个中间结果，可初步得到乳腺肿瘤的耐药情况。TRPC5的表达水平越高，则提供血液样本者发生耐药的可能性也就越高。
[0012]2、本发明采用的检测方法简单快速，只需抽取血液样本便可检测，极大程度地减轻了肿瘤病人的痛苦；
3、通过本发明可以初步检测出病人在该阶段的耐药情况，同时联合其它已有的乳腺癌耐药诊断技术，可有利于指导医生提出更加准确的治疗方案，以获得最佳疗效。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1为实施例1的TRPC5在耐药乳腺癌细胞EVs上的表达情况检测示意图；
图2为实施例2的TRPC5在耐药乳腺癌的异种移植瘤裸鼠血液和经化疗的乳腺肿瘤病人的血液EVs中的表达情况检测示意图。
【具体实施方式】
[0014]实施例中所使用的材料来源或制备方法如下:
1、细胞
(I)野生型人乳腺癌细胞MCF-7/WT购自美国模式培养物寄存库(ATCC)。
[0015](2)耐阿霉素人乳腺癌细胞MCF-7/ADM由江南大学药物设计与分子药理学研究室制备并保存，其制备方法如下:
将新复苏的野生型人乳腺癌细胞MCF-7/WT细胞(购自ATCC)于细胞培养常规条件下培养2代代，使细胞生长稳定，待细胞汇合时用胰酶进行消化并传代，第二天更新培养基，同时以MCF-7/WT IC50的1/10为起始浓度加入阿霉素，加药第二天后再次换液，并维持阿霉素的浓度进行常规传代培养，待细胞稳定生长后提高药物浓度继续培养，直到细胞可在阿霉素浓度为5 μ g/ml的培养基中稳定生长，即得，整个制备过程历时8个月。
[0016]2、抗体及 siRNA
TRPC5 antibody (ab63151)购自美国 Abcam 公司；goat polyclonal to rabbit IgG15 nm Gold (ab27236)购自美国 Abeam 公司；TRPC5_siRNA 购自美国 Invitrogen 公司。
[0017]3、病人
血液样本采自29位乳腺癌患者，其中17位患者接受过蒽环类/紫杉烷类药物化疗，12位患者未接受过任何化疗药物治疗。
[0018]4、实验仪器
透射电镜购自日本Hitachi公司；激光共聚焦显微镜购自德国Zeiss公司；PCR仪购自美国Bio-Rad公司；C02恒温细胞培养箱购自美国Thermo公司；核酸电泳仪系统购自美国Bio-Rad公司。
[0019]实施例1:TRPC5在耐药乳腺癌细胞的EVs上表达，且参与EVs的形成。
[0020]方法:收集体外培养的MCF-7/ADM和MCF-7/WT细胞，制备成透射电镜样本，在透射电镜下观察两种细胞的结构差异，并拍照记录。结果如图1A所示。
[0021]MCF-7/ADM细胞的透射电镜样本经过BSA封闭、TRPC5 一抗、免疫金标记二抗孵育后，在透射电镜下观察TRPC5的分布情况，并拍照记录。结果如图1B所示。
[0022]将MCF-7/ADM细胞以3000个/孔接种于共聚焦小皿中，待细胞贴壁后进行免疫染色，样本经BSA封闭、TRPC5 一抗、绿色荧光二抗孵育后，在激光共聚焦显微镜下观察TRPC5的表达及分布情况，并拍照记录。结果如图1B所示。
[0023]体外培养的MCF-7/ADM细胞先经Scrambled siRNA和TrpC5 siRNA处理，然后同样制备成透射电镜样本，在透射电镜下观察MCF-7/ADM细胞经TrpC5 siRNA干扰前后的结构差异，并拍照记录。结果如图1C所示。
[0024]结果:
如图1A所示，透射电镜结果显示，与MCF-7/WT细胞相比，MCF-7/ADM细胞膜表面产生了大量的EV结构。如图1B所示，免疫荧光染色和免疫透射电镜结果均显示，TrpC5在EVs上高量表达。如图1C所示，当MCF-7/ADM细胞分别经Scrambled siRNA和TRPC5 siRNA处理后，透射电镜结果显示TRPC5被抑制后，MCF-7/ADM细胞膜表面的EVs明显减少。这些结果表明，与野生型MCF-7细胞相比，耐阿霉素的MCF-7细胞表面产生大量的EVs结构，TRPC5蛋白在该结构上大量表达，并参与EVs的形成。因为在耐药细胞的EVs中才能检测到TRPC5，说明TRPC5和耐药是相对应的。
[0025]实施例2 =RT-PCR法检测血液样本EVs中TRPC5的表达情况。
[0026]方法:在雌性裸鼠的侧腹分别注射MCF-7/WT和MCF-7/ADM细胞(5 X IO6个细胞/裸鼠),养殖4?8周，当肿瘤长至约200mm3时，在耐药荷瘤小鼠肿瘤部位每三天注射一次ADM (3mg/kg),同时在所有荷瘤小鼠肿瘤部位每三天注射一次TRPC5-siRNA或对照siRNA(40pmol),30天后通过心脏穿刺技术收集血液保存在肝素钠溶液中，并收集EVs。
[0027]收集血液样本中的EVs:血浆样本收集在含EDTA的聚丙烯离心管中，首先以300 X g离心10分钟去除完整细胞，以2500 X g离心20分钟去除血小板和细胞碎片，重复操作2次，然后在4度条件下以16000 Xg离心I小时、100000 Xg离心I小时，沉淀为EVs，用PBS洗涤后，重悬在PBS溶液中备用。
[0028]RT-PCR:运用反转录试剂盒 Reverse Transcriptase M-MLV (RNase H-) Kit(TaKaRa)将EVs的基因组反转录成cDNAs，然后用常规的RT-PCR方法进行检测。用于检测裸鼠血液样本的引物包括:
TrpC5: forward, 5' -GACCTGATAA CCACTGAGAACCTGCTGAGC-3'; reverse, 5' -GACAACCTCT TGCCAAATGGGTCTTGATGC-3'; flotillin2: forward, 5' -CCAGAGACACTGTCCTTCCC-3'; reverse, 5' -CATTGGAGCAAGGAGACAGAG-3';
MUCl: forward, 5' -TTCTTCCTGCTGCTGCTCCTCAC-3'; reverse, 5' -GCACATCACT CACGCTGACGTCTG-3'; mdrl: forward, 5' -CTTTCGAACTGCAAATATGCCTCC-3'; reverse, 5' -GAGTTAGGAATGTAGCCCAGG-3';
GAPDH: forward, 5' -CAACGTGTCAGTGGTGGACC-3'; reverse,5' -AGCAGTGAGGGTCTCTCTCTTC-3'.用于检测病人血液样本的引物包括:
TrpC5: forward, 5' -AGACTTGCCATGGGCCACCTCTCATCAGAACC-3'; reverse, 5-GAGGCGAGTTGTAACTTGTTCTTCCTGTCCATC-3'; flotillin2: forward, 5' -AGATCCGGCAGGAAGAGATT-3'; reverse, 5' -GCTTCTGCCTTGAGCTTCAT-3';
MUCl: forward, 5; -CGACTACTACCA AGAGCTGCAGAGAGACAT-3'; reverse, 5' -TGTAAGAGAGGCTGCTGCCA CCATTACCTG-3'; mdrl: forward, 5' -CTGTTTGACTGCAGCATTGCTGAG AACAT-3'; reverse, 5' -CTGGCGCTTTGTTCCAGCCTGGACACTGAC-3';
GAPDH: forward, 5' -GGACTCATGACCACAGTCCATGCCATCACT-3'; reverse, 5' -CTTGGAGGCCATGTGGGCCATGAGGTCCAC-3'.结果:RT-PCR检测裸鼠血液样本EVs中各蛋白的mRNA水平，7只耐药荷瘤小鼠中，TrpC5、flotillin2、mdrl和MUCl的mRNA水平均显示阳性表达，表明耐药荷瘤小鼠肿瘤分泌的表达有TrpC5的EVs被释放到了裸鼠的外周血中，如图2A所示。当耐药肿瘤经TRPC5 - siRNA处理后，与对照组相比TRPC5、flotillin2和mdrl的转录水平明显下降，统计结果见图2A，该结果进一步提示TRPC5与EVs的形成和转运密切相关。
[0029]RT-PCR检测病人血液样本EVs中各蛋白的mRNA水平，17位经化疗的病人中，TRPC5、flotillin2、mdrl和MUCl的mRNA水平均显示高表达，且TRPC5表达为强阳性，而12位未经化疗的病人中，这些蛋白的mRNA水平均较低，如图2B所示。该结果进一步表明了携带有TRPC5的EVs与肿瘤耐药有密切的联系，提示乳腺癌病人血液EVs中TRPC5的表达可作为检测指标应用于耐药乳腺癌的诊断治疗中。[0030]实施例3 =Elisa法检测血液样本EVs中TRPC5的表达情况。
[0031]采用双抗体夹心法(Elisa法)定量测定血样本EVs中TRPC5的含量。运用商业化的或手动包被的用于检测人源性TRPC5蛋白的Elisa检测试剂盒，检测样本为用蛋白裂解液裂解好的血液EVs样本，根据常规的Elisa检测方法测定样本中TRPC5的含量，用相应检测仪器检测信号强度。样本中的TRPC5越多，相对检测值就越高，TRPC5就表达为阳性，那么提供血液样本者发生耐药的可能性也就越高。
【权利要求】
1.EVS-TRPC5在检测乳腺癌耐药程度中的应用，其特征在于具体检测方法为: (O收集患有乳腺癌的病人或动物的血液样本，分别通过离心去除样本中的完整细胞、血小板及细胞碎片，最后离心收集样本中的EVs ； (2)可用RT-PCR法或者Elisa法检测收集到的EVs中TRPC5的表达情况，若TRPC5表达阳性，为出现耐药性的可疑病人或动物。
【文档编号】C12Q1/68GK103954770SQ201410170932
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年4月25日 优先权日:2014年4月25日
【发明者】马鑫, 金坚, 汪淋军, 陈震, 陈蕴, 蔡燕飞 申请人:江南大学