一种兔皮肤真菌复合pcr检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种兔皮肤真菌复合PCR检测方法，其特征在于,包括以下步骤：(1)疑似感染须癣毛癣菌、犬小孢子菌、絮状表皮癣菌的病料用热裂解法提取DNA；(2)合成Pa，Pb；Pc，Pd；Pe，Pf三对特异引物；(3)以病料DNA为模板，Pa-Pf3对引物混合为引物进行PCR扩增；(4)电泳检测PCR产物。本发明的有益之处在于：提供了一种兔皮肤真菌复合PCR检测方法，经过一次PCR就能鉴别3种皮肤真菌。较传统直接显微观察和病原分离培养等方法特异性强、敏感性高、省时；与其他分子生物学方法比，减少了PCR次数，也不需序列测定，具有简单、快速、经济等特点，且非常适合大规模样品检测。
【专利说明】—种兔皮肤真菌复合PCR检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种兔皮肤真菌感染的检测方法，具体涉及一种兔皮肤真菌复合PCR检测方法，属于生物医药【技术领域】。
【背景技术】
[0002]皮肤真菌(Dermatophyte)是皮肤真菌病的病原菌。兔皮肤真菌病(Dermatomycosis)是一类传染性极强的人畜共患病，不仅危害养兔业，造成重大经济损失，还传染人，影响人体健康。皮肤真菌病的病原涉及三个属，分别为毛癣菌属(Trichophyton)、小孢子菌属(Microsporum)和表皮癖菌属(Epidermophyton)。兔皮肤真菌流行病学调查显示须癣毛癣菌、犬小孢子菌和絮状表皮癣菌是最常见皮肤真菌。不同的皮肤真菌侵染部位不同，引起的病变有差异，用药和采取防控措施也各不相同，因此，对皮肤病真菌种类鉴定显得非常重要。
[0003]目前，常见皮肤真菌检测方法包括:病料直接显微观察、病原分离培养和分子生物学方法。病料直接显微观察简单、快速，但无法鉴别真菌的种类，有5% -15%假阴性；病原分离培养虽然通过菌落、菌丝和孢子的形态，结合生化试验，可以明确真菌种类，但由于皮肤真菌生长缓慢，一般为3-4周，耗时长，且有40%假阴性；分子生物学方法包括染色体DNAG+C的含量、总DNA同源性、线粒体DNA限制酶断片长度多态分析、随机引物PCR、随机扩增DNA多态性分析、PCR指纹等。最近发现，采用核糖体DNA(rDNA)区及rRNA小亚基序列分析，特别是 ITS (analysis of internal transcribed spacer)区分析比对编码 rRNA 小亚基(18SrRNA)基因更适应对皮肤真菌检测，目前，把rDNA的ITS区序列分析称为皮肤癣菌鉴定的金标准。虽然该方法特异、敏感，但需要基因序列的测定及分析，这限制了此方法的应用，且一次反应仅能鉴定一种真菌，不适合大规模样品检测。
【发明内容】
[0004]为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种具有特异性强、敏感性高，成本低，且适合大规模样品检测的兔皮肤真菌复合PCR检测方法。
[0005]为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案:
[0006]一种兔皮肤真菌复合PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤:
[0007](I)病料DNA提取:疑似感染须癣毛癣菌、犬小孢子菌、絮状表皮癣菌的病料采用热裂解的方法提取DNA ； [0008](2)引物的合成:
[0009]须癣毛癣菌特异弓I物:Pa5’ GCAAAGAAGCCTGGAAGAAG3’
[0010]Pb5’ GGAGACCATCTGTGAGAGTTG3’
[0011]犬小孢子菌特异引物:Pc5’GACCGCCCGTCGCT ACTAT3’
[0012]Pd5’ TTCGCTGCGTTCTTCATTAG3’
[0013]絮状表皮癣菌特异引物:Pe5’GAAGAAGATTGTCGTTTGCATCGTCTC3’[0014]Pf5’CTCGAGGTCAAAAGCACGCCAGAG3’ ；
[0015](3)复合PCR:以病料DNA为模板，Pa-Pf3对弓丨物混合为弓丨物进行PCR扩增；
[0016](4)PCR产物检测:采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，凝胶成像分析仪观察结
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[0017]前述的兔皮肤真菌复合PCR检测方法，其特征在于，步骤(3)中，PCR的反应体系为=MixtureslO μ L，三对引物Pa-Pf最终浓度0.2mM,模板DNA4 μ L，加ddH20至总体积20 μ L0
[0018]前述的兔皮肤真菌复合PCR检测方法，其特征在于，在步骤(3)中，PCR循环参数为:94°C初始变性5min，94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s，35个循环，72°C终延伸IOmin0
[0019]前述的兔皮肤真菌复合PCR检测方法，其特征在于，前述须癣毛癣菌特异引物、犬小孢子菌特异引物和絮状表皮癣菌特异引物的浓度配比为1:1:1。
[0020]本发明的有益之处在于:采用复合PCR方法，所用样品量少，经过一次PCR就能鉴别3种皮肤真菌。较传统直接显微观察和病原分离培养等方法特异性强、敏感性高、省时；与其他分子生物学方法比，减少了 PCR次数，也不需序列测定，具有简单、快速、经济等特点，且非常适合大规模样品检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1是本发明所述的兔皮肤真菌复合PCR检测方法的一个具体实施例中获得的电泳图。
[0022]图中，M为DNA分子质量标准；F1，F2，F3为疑似感染须癣毛癣菌、犬小孢子菌、絮状表皮癣菌的3组病料；F4为阳性对照；F5，F6为阴性对照。
【具体实施方式】
[0023]1.DNA 提取
[0024](I)菌株DNA提取:将须癣毛癣菌、犬小孢子菌和絮状表皮癣菌的菌株接种在沙堡弱SDA培养液，27 °C，震荡培养8天，收获；取真菌团块放入500 μ L裂解液(400mMTris-HCl (pH8.0), 60mMEDTA (pH8.0)，150mM NaCl，I % 十二烷基硫酸钠);室温放置 lOmin，加150 μ L乙酸钾(ρΗ4.8)，漩涡震荡，离心12000g，lmin ;上清液放入新试管，加入等体积异丙醇；DNA团块用70%乙醇洗，干燥后，溶解在50yL的TE(10mM Tris7ImM EDTA)中，2 μ LDNA用于后续PCR。菌株DNA模板作为阳性对照组。
[0025](2)病料DNA提取:将疑似感染须癣毛癣菌、犬小孢子菌、絮状表皮癣菌的三组病料F1，F2，F3分别进行下述操作:将病料加入100 μ L提取液(60mM NaHC03，250mM KCI，50mMTris,pH9.5) 95°C，IOmin ;加100 uL2%牛血清蛋白，漩涡震荡，即可用于后续PCR。病料DNA模板作为实验样品组。 [0026](3)阴性对照:取没有感染须癣毛癣菌、犬小孢子菌、絮状表皮癣菌的两组DNA样品F5，F6为阴性对照组。
[0027]2.引物的合成
[0028]须癣毛癣菌特异弓I物:Pa5’ GCAAAGAAGCCTGGAAGAAG3’[0029]Pb5’ GGAGACCATCTGTGAGAGTTG3’
[0030]犬小孢子菌特异引物:Pc5’GACCGCCCGTCGCT ACTAT3’
[0031]Pd5’ TTCGCTGCGTTCTTCATTAG3’
[0032]絮状表皮癣菌特异引物:Pe5’GAAGAAGATTGTCGTTTGCATCGTCTC3’
[0033]Pf5’CTCGAGGTCAAAAGCACGCCAGAG3’ ；
[0034]引物合成在北京生工生物技术有限公司，预期扩增出目的片段大小须癣毛癣菌为:288bp，犬小孢子菌为:500bp，絮状表皮癣菌为:366bp。
[0035]3.复合 PCR
[0036](I)PCR反应体系:MixtureslOy L，三对引物Pa-Pf最终浓度0.2mM，三对引物的浓度配比为1:1:1，须癣毛癣菌特异引物、犬小孢子菌特异引物和絮状表皮癣菌特异引物的量分别为:I μ L,模板DNA4 μ L,加ddH20至总体积20 μ L。
[0037](2)PCR循环参数:94°C初始变性5min，94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s，35个循环，72°C终延伸IOmin。获得须癣毛癣菌DNA核酸序列SEQ.1D.No:1，犬小孢子菌DNA核酸序列SEQ.1D.No:2，絮状表皮癣菌DNA核酸序列SEQ.1D.No:3。
[0038]4.PCR产物检测:取5 μ L反应产物于I %含溴乙锭的琼脂糖凝胶中电泳，凝胶成像分析仪观察，见图1 =Fl组出现500bp条带，表明Fl组病料感染了犬小孢子菌；F2组出现366bp条带，表明F2组病料感染了絮状表皮癣菌；F3组出现288p条带，表明F3组病料感染了须癣毛癣菌。
[0039] 由此可见，本发明的兔皮肤真菌复合PCR检测方法，所用样品量少，经过一次PCR就能鉴别3种皮肤真菌，较传统直接显微观察和病原分离培养等方法特异性强、敏感性高、省时；与其他分子生物学方法比，减少了 PCR次数，也不需序列测定，具有简单、快速、经济等特点，且非常适合大规模样品检测。
【权利要求】
1.一种兔皮肤真菌复合PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)病料DNA提取:疑似感染须癣毛癣菌、犬小孢子菌、絮状表皮癣菌的病料采用热裂解的方法提取DNA ； (2)引物的合成: 须癣毛癣菌特异引物:Pa5’ GCAAAGAAGCCTGGAAGAAG3’
Pb5’ GGAGACCATCTGTGAGAGTTG3’ 犬小孢子菌特异引物:Pc5’ GACCGCCCGTCGCT ACTAT3’
Pd5’ TTCGCTGCGTTCTTCATTAG3’ 絮状表皮癣菌特异引物:Pe5’ GAAGAAGATTGTCGTTTGCATCGTCTC3’
Pf5，CTCGAGGTCAAAAGCACGCCAGAG3，； (3)复合PCR:以病料DNA为模板，Pa-Pf3对引物混合为引物进行PCR扩增； (4)PCR产物检测:采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，凝胶成像分析仪观察结果。
2.根据权利要求1所述的兔皮肤真菌复合PCR检测方法，其特征在于，步骤(3)中，PCR的反应体系为:MixtureslO μ L，三对引物Pa-Pf最终浓度0.2mM,模板DNA4 μ L，加ddH20至总体积20 μ L0
3.根据权利要求2所述的兔皮肤真菌复合PCR检测方法，其特征在于，在步骤(3)中，PCR循环参数为:94°C初始变性5min, 94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s，35个循环，72°C终延伸IOmin。
4.根据权利要求1、2或3所述的兔皮肤真菌复合PCR检测方法，其特征在于，所述须癣毛癣菌特异引物、犬小孢子菌特异引物和絮状表皮癣菌特异引物的浓度配比为1:1:1。
【文档编号】C12R1/645GK104004835SQ201410204465
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年5月15日 优先权日:2014年5月15日
【发明者】刘彦威, 刘娜, 刘利强, 杜鹃, 石玉祥, 张永英, 王慧真 申请人:河北工程大学