Csf2rb基因在前列腺癌骨转移中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种人CSF2RB蛋白及其应用，用于制备前列腺癌骨转移诊断及治疗的产品。本发明的CSF2RB蛋白可作为诊断前列腺癌骨转移的特异性标志蛋白，使前列腺癌骨转移的诊断更加准确、快速；本发明的CSF2RB蛋白还可作为制备治疗前列腺癌骨转移的分子药物，提供新的前列腺癌骨转移的治疗途径。
【专利说明】CSF2RB基因在前列腺癌骨转移中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于蛋白治疗和诊断【技术领域】，特别是涉及一种CSF2RB蛋白在前列腺癌骨转移的早期诊断和治疗中的应用。
【背景技术】
[0002]前列腺癌(Prostate Cancer, PCa)是男性泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，在我国超过80%的前列腺癌患者在确诊时已经发生骨转移，而骨转移是导致前列腺癌患者死亡的重要原因。所以，前列腺癌骨转移的诊断，尤其对骨转移的早期诊断，是临床诊疗和预后的关键。
[0003]目前前列腺癌骨转移的诊断方法主要包括放射性核素全身骨显像、前列腺特异性抗原及骨标志物检测这三种手段。但放射性核素全身骨显像是针对已经出现了骨转移病灶的患者而言，要想在患者一开始发生成熟的骨质溶解破坏之时甚至之前就发现骨转移趋势，特异性骨标记物的检测无非是一个很好的选择。
[0004]目前广泛应用的前列腺特异性抗原(PSA)在前列腺癌和前列腺增生症(BPH)患者血清中均可增高，所以它对前列腺癌骨转移的筛选诊断来说，特异性仍不高，它只是监测前列腺癌预后的一个重要标记物。除外PSA，近年来关注的骨形成标志物碱性磷酸酶(ALP)、骨吸收标志物抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP5b)与I型胶原吡啶交联终肽(ICTP)标记物，在诊断前列腺癌骨转移中的敏感性分别为59.3 %、37.0 %、59.3%，特异性则为96.7 %、80.0%,76.7% ;PSA、TRACP5b、ALP、ICTP诊断前列腺癌骨转移的价值相当，联合检测并动态观察可能有利于前列腺癌骨转移的早期诊断，但它们的敏感性和特异性均不令人满意。所以早期诊断骨转移和指导个性化治疗的分子分型诊断仍是我们面临的极大挑战，而发现灵敏度和特异性更高的新的肿瘤标志物，是提高前列腺癌骨转移早期诊断水平的关键。
[0005]目前，对于中晚期前列腺癌患者，手术治疗的效果差，大多数采用药物治疗。根据不同的病情可以采用化学药物治疗、外放射治疗、放射性核素内放射治疗以及各种疗法的综合应用等。然而，放化疗药物不仅作用于肿瘤，还可以作用于肿瘤周围健康的组织，因而在杀伤肿瘤的同时，也给机体带来了很大的副作用，最终影响对肿瘤的治疗效果。
[0006]因此，本领域迫切需要开发早期判断前列腺癌骨转移的特异性标志物，并开发前列腺癌骨转移的靶向药物。
【发明内容】
[0007]本发明提供了 CSF2RB基因或其蛋白在预测或诊断前列腺癌骨转移的应用，本发明还提供了 CSF2RB能够有效抑制前列腺癌的骨转移或前列腺癌细胞的骨转移。
[0008]本发明第一方面，提供了一种集落刺激因子2受体β (Colony StimulatingFactor2Receptor, Beta, CSF2RB)基因或其蛋白的用途，用于制备预测或检测前列腺癌骨转移的试剂或试剂盒。
[0009]在另一优选例中，所述CSF2RB基因来自哺乳动物，较佳地，来自啮齿动物(小鼠或大鼠)或灵长动物(例如人)；更佳地，来源于人。
[0010]在另一优选例中，所述CSF2RB基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.:1所示，其编码的蛋白序列如SEQ ID N0.:2所示。
[0011]在另一优选例中，所述的试剂包括CSF2RB的特异性引物、特异性抗体、探针和/或
[0012]在另一优选例中，所述的检测CSF2RB蛋白或mRNA的检测试剂包括:
[0013](a).抗CSF2RB蛋白的特异性抗体；和/或
[0014](b).特异性扩增CSF2RB的mRNA或cDNA的特异性引物。
[0015]在另一优选例中，所述的检测包括酶联免疫反应法(ELISA法)检测或时间分辨免疫荧光法(TRFDWi)检测。
[0016]在另一优选例中，所述的CSF2RB蛋白或其特异性抗体偶联有或带有可检测标记。
[0017]在另一优选例中，所述可检测标记选自下组:生色团、化学发光基团、荧光团、同位素或酶。
[0018]在另一优选例中，所述CSF2RB的特异性抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。
[0019]在另一优选例中，所述检测是测定组织样品。
[0020]在另一优选例中，所述的组织样品包括前列腺癌组织和癌旁组织。
[0021]在另一优选例中，所述的癌旁组织为正常组织。
[0022]本发明第二方面，提供了一种用于检测前列腺癌骨转移的诊断试剂盒，所述的试剂盒含有一容器，所述容器中含有检测CSF2RB蛋白或mRNA的检测试剂；以及标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于检测前列腺癌骨转移。
[0023]在另一优选例中，所述的检测前列腺癌骨转移指判断前列腺癌骨转移是否发生，和/或判断发生前列腺癌骨转移的可能性(易感性)大小。
[0024]在另一优选例中，所述的检测包括临床检测、辅助检测或早期检测。
[0025]在另一优选例中，所述判断包括预先判断(预测)。
[0026]在另一优选例中，所述的检测CSF2RB蛋白或mRNA的检测试剂包括:
[0027](a).抗CSF2RB蛋白的特异性抗体；和/或
[0028](b).特异性扩增CSF2RB的mRNA或cDNA的特异性引物。
[0029]在另一优选例中，所述的标签或说明书中注明以下内容:
[0030]当检测对象的前列腺癌细胞或组织中CSF2RB表达量El与正常前列腺细胞或组织的CSF2RB表达量E2之比> 2，则提示该检测对象前列腺癌骨转移的几率高于普通人群。
[0031]在另一优选例中，所述的E2是正常人群的正常前列腺细胞或组织的CSF2RB表达量。
[0032]在另一优选例中，所述的正常前列腺细胞或组织包括癌旁的前列腺细胞或组织。
[0033]在另一优选例中，所述的表达量是相对于对照基因(如β -肌动蛋白)的相对表达量。
[0034]本发明第三方面，提供了一种CSF2RB抑制剂的用途，用于制备预防或治疗前列腺癌骨转移的药物组合物。
[0035]在另一优选例中，所述CSF2RB基因来自哺乳动物，较佳地，来自啮齿动物(小鼠或大鼠)或灵长动物(例如人)；更佳地，来源于人。[0036]在另一优选例中，所述CSF2RB基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.:1所示，其编码的蛋白序列如SEQ ID N0.:2所示。
[0037]在另一优选例中，所述的抑制剂包括:CSF2RB的抗体、CSF2RB核酸的反义RNA、microRNA、siRNA、shRNA 以及 CSF2RB 的活性抑制剂。
[0038]在另一优选例中，所述的siRNA序列如SEQ ID N0.:7和SEQ ID N0.:8所示。
[0039]在另一优选例中，所述的shRNA序列如SEQ ID N0.:9和SEQ ID N0.: 10所示。
[0040]在另一优选例中，所述的药物组合物包括CSF2RB抑制剂作为活性成分，和药学上可接受的载体。
[0041]在另一优选例中，所述的药物通过选自下组的用药方式进行给药:口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、舌下含化、直肠灌注、鼻腔喷雾、口腔喷雾、皮肤局部或全身经皮用药。
[0042]在另一优选例中，所述的药物的制剂选自下组:片剂、胶囊剂、注射剂、颗粒剂、喷雾剂。
[0043]在另一优选例中，所述的CSF2RB抑制剂以0.01_20mg/kg体重的剂量(每次或每天)施用于哺乳动物。
[0044]在另一优选例中，所述的哺乳动物包括人、小鼠、大鼠，更佳地，为人。
[0045]本发明第四方面，提供了一种体外非治疗性抑制前列腺癌迁移的方法，包括步骤:在CSF2RB抑制剂存在下，培养前列腺癌细胞，从而抑制前列腺癌细胞迁移。
[0046]在另一优选例中，所述的方法包括向前列腺癌细胞的培养体系中添加CSF2RB抑制剂，从而抑制癌细胞迁移。
[0047]在另一优选例中，所述的CSF2RB抑制剂的浓度为0.5_5mg/mL。
[0048]本发明第五方面，提供了一种筛选用于抑制前列腺癌骨转移或前列腺癌细胞迁移的化合物的方法，包括步骤:
[0049](a)测试组中，在前列腺癌细胞的培养体系中添加测试化合物，并观察所述测试组的细胞中CSF2RB的表达量和/或活性；在对照组中，在相同细胞的培养体系中不添加测试化合物，并观察对照组的所述细胞中CSF2RB的表达量和/或活性；
[0050]其中，如果测试组中细胞的CSF2RB的表达量和/或活性小于对照组，就表明该测试化合物是对CSF2RB的表达和/或活性有抑制作用的治疗前列腺癌骨转移或前列腺癌细胞迁移的化合物；和/或
[0051] (b)对于步骤(a)中获得的候选化合物，测试所述候选化合物对前列癌细胞骨转移或前列腺癌细胞迁移的抑制作用。
[0052]在另一优选例中，在步骤(b)中包括步骤:向测试组前列腺癌细胞的培养体系中添加测试化合物，并观察前列腺癌细胞移动的距离的数量和/或侵袭情况；向对照组前列腺癌细胞的培养体系中不添加测试化合物，并观察前列腺癌细胞移动的距离的数量和/或侵袭情况；其中，如果测试组中前列腺癌细胞的迁移距离或侵袭数量显著小于对照组，就表明该测试化合物是对前列腺癌骨转移前列腺癌细胞迁移有抑制作用的化合物。
[0053]本发明第六方面，提供了一种预测或诊断前列腺癌骨转移的方法，包括步骤:
[0054](i).准备受试者测试样品；
[0055](ii).检测测试样品中CSF2RB相对于对照基因(如β -肌动蛋白)的mRNA表达量E1，与正常前列腺细胞或组织的CSF2RB表达量E2 (即参比值)，当其比值> 2则提示该检测对象肿瘤骨转移的几率高于普通人群。
[0056]在另一优选例中，所述测试样品为组织样品。
[0057]在另一优选例中，所述参比值为非肿瘤样品中CSF2RB的表达量。
[0058]在另一优选例中，所述检测步骤(ii)包括检测CSF2RB mRNA的量，或CSF2RBcDNA的量；和/或检测CSF2RB蛋白的量。
[0059]在另一优选例中，所述检测步骤(ii)包括通过RT-PCR或PCR方法进行检测。
[0060]在另一优选例中，所述的检测步骤(ii)包括使用抗CSF2RB蛋白的抗体进行检测。
[0061]本发明第七方面，提供了一种抑制前列腺癌骨转移或前列腺癌细胞迁移的方法，包括步骤:给需要治 疗的对象(哺乳动物)施用安全有效量的CSF2RB抑制剂。
[0062]在另一优选例中，所述的抑制剂包括:CSF2RB的抗体、CSF2RB核酸的反义RNA、microRNA、siRNA、shRNA 以及 CSF2RB 的活性抑制剂。
[0063]应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。
【专利附图】
【附图说明】
[0064]图1A显示了正常前列腺组织；图1B前列腺组织腺细胞团经激光显微切割后，HE染色的照片(XlOO)0
[0065]图2SDS-PAGE分离人正常前列腺细胞、PC-3细胞中的膜蛋白，并将每个泳道的凝胶平分为8段。
[0066]图3A CSF2RB蛋白的总离子流图；图3B CSF2RB蛋白的二级质谱图；图3CS0SH网站查询CSF2RB蛋白的跨膜区域(TMD)，提示CSF2RB为具有2个跨膜区的膜蛋白。
[0067]图4显示了 CSF2RB基因在三种细胞中表达情况，RT-PCR结果显示该基因在骨转移来源的PC-3细胞中表达，在人正常前列腺上皮细胞(RWPE-1)及脑转移来源的前列腺癌DU-145细胞中不表达。
[0068]图5的Western-blot实验显示CSF2RB蛋白在人正常前列腺细胞及三种不同转移潜能前列腺癌细胞中的表达情况。CSF2RB在人正常前列腺上皮细胞RWPE-1中几乎未检测到表达；在淋巴转移来源的LNcap细胞及脑转移来源的DU145细胞中均未检测到表达；在骨转移来源的PC-3细胞中表达量较高。
[0069]图6免疫组化实验示CSF2RB蛋白在人前列腺正常组织、前列腺癌组织中的表达情况。A.人正常前列腺组织(N):CSF2RB在N中几乎未检测到表达；B.人前列腺癌组织:CSF2RB在前列腺癌组织中呈弱棕黄色表达(弱阳性)；C.人前列腺癌骨转移组织:CSF2RB在人前列腺癌骨转移组织中呈强棕黄色表达(强阳性)；D.人前列腺癌腹壁转移组织:CSF2RB在人前列腺癌腹壁转移组织中呈弱棕黄色表达(弱阳性)。
[0070]图 7CSF2RB-siRNA 下调 PC-3 细胞 CSF2RB mRNA 表达的 real-time PCR 结果，CSF2RBmRNA 基因下调 70% -75%。
[0071]图8A.细胞划痕实验观察CSF2RB mRNA下调前后细胞迁移情况(第一排从左至右分别为Oh阴性对照及两条CSF2RB-shRNA下调PC-3细胞CSF2RB mRNA基因前，第二排从左至右分别为24h阴性对照及两条CSF2RB-shRNA下调PC-3细胞CSF2RBmRNA后)；CSF2RB下调后可见细胞迁移能力较对照组明显减弱。B.用公式计算抑制CSF2RB后PC-3细胞的相对迁移距离明显下降，*P<0.05。C.Boyden小室观察CSF2RB_shRNA下调PC-3细胞CSF2RBmRNA基因前后PC-3细胞侵袭能力(sh_NC阴性对照，下调前；CSF2RB_shl、CSF2RB_sh2分别为下调PC-3细胞CSF2RB mRNA基因后)，CSF2RB下调后，PC-3细胞数量明显减少，说明PC-3细胞的侵袭能力较对照组明显减弱。D.与对照组相比，CSF2RB下调组侵袭细胞数量平均值明显减少，*P〈0.05。
[0072]图9CSF2RB-shRNA下调PC-3细胞CSF2RB mRNA表达，PC-3细胞生长速度明显减慢。
[0073]图1OWestern-Blot实验检测PC-3中CSF2RB下调前后，其下游通路蛋白T-AKT (总AKT) ,ρ-ΑΚΤ (磷酸化 AKT)及 mTOR 的变化。PC_3Sramble 为 CSF2RB 下调前，PC_3sh_CSF2RB为CSF2RB下调后；可见CSF2RB下调后p_AKT、mTOR在PC-3细胞中有不同程度的下调。
[0074]图llWestern-blot检测DU145细胞中过表达CSF2RB对PI3K/Akt信号通路和MAPK信号通路的影响。如图所示，经CSF2RB的受体GM-CSF因子刺激/非刺激DU145细胞后，过表达CSF2RB均促进Akt和Erkl/2磷酸化；此外过表达CSF2RB在GM-CSF刺激后降低了迁移抑制蛋白E_cadherin( 钙黏蛋白)的表达。
【具体实施方式】
[0075]本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量筛选并通过细胞生物学的研究，首次证明CSF2RB蛋白促进前列腺癌细胞的增殖，是一个前列腺癌转移的促进因子，具体地，本发明通过从一株骨转移来源的细胞系中，筛选出与已知前列腺癌骨转移因子(趋化因子CXCL12的受体CXCR4)不同的新的相关蛋白CSF2RB蛋白。基于本发明，将CSF2RB蛋白首次作为诊断前列腺癌转移尤其是骨转移的特异性标志蛋白，可使得前列腺癌骨转移诊断更准确、快速。此外，本发明CSF2RB蛋白的抑制剂或拮抗剂，可作为制备预防或治疗前列腺癌转移的分子药物，提供新的治疗途径。在此基础上完成了本发明。
[0076]CSF2RB蛋白和多核苷酸
[0077]在本发明中，“本发明蛋白”、“本发明多肽”、“ CSF2RB蛋白”可互换使用，指集落刺激因子 2 受体 β 蛋白，(Colony Stimulating Factor2Receptor, Beta, CSF2RB)。应理解，所述术语还包括CSF2RB的活性片段和衍生物。
[0078]在本发明中，“本发明基因”、“本发明多核苷酸”指编码CSF2RB蛋白或其活性片段和衍生物的核苷酸序列，包括正义和反义核酸。
[0079]在本发明中，术语“CSF2RB蛋白”或“CSF2RB多肽”可互换使用，都指具有人蛋白CSF2RB氨基酸序列的蛋白或多肽。
[0080]集落刺激因子2 受体 β (Colony Stimulating Factor2Receptor, Beta, CSF2RB)是具有2个跨膜结构的膜蛋白，以β链的形式构成细胞因子IL-3、IL-5和GM-CSF受体的侧链。共同β链(hi3c)，即CSF2RB，在高亲和的配体结合及信号转导中是必需的。研究发现，CSF2RB主要在血液系统疾病中研究较多，既促进造血细胞增殖又促进分化，在维持造血细胞增殖、分化、自我更新的平衡中具有重要作用。
[0081]一种优选的CSF2RB基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.:1所示；其编码的CSF2RB蛋白序列如SEQ ID N0.:2所示。
[0082]如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
[0083]如本文所用，“分离的CSF2RB蛋白或多肽”是指CSF2RB蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化CSF2RB蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。在本发明中，CSF2RB蛋白包括融合蛋白和非融合蛋白。
[0084]本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
[0085]本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
[0086]编码CSF2RB的成熟多肽的多核苷酸包括:只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
[0087]本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码多肽的功能。
[0088]本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段，包括正义和反义的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码CSF2RB蛋白的多核苷酸。
[0089]本发明的人CSF2RB核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
[0090]一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。[0091 ] 此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
[0092]应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
[0093] 本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或CSF2RB蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。[0094]通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组的CSF2RB蛋白。一般来说有以下步骤:
[0095](I).用本发明的编码人CSF2RB蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
[0096](2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；
[0097](3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
[0098]本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含人CSF2RB编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
[0099]此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
[0100]包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
[0101]宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺 乳动物细胞。代表性例子有:大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CH0、COS、或293细胞的动物细胞等。
[0102]用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法:磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
[0103]获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
[0104]在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于:常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结
口 ο
[0105]抑制剂
[0106]利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与CSF2RB蛋白发生相互作用的物质，尤其是抑制剂等。
[0107]本发明CSF2RB蛋白的抑制剂(包括抗体、反义核酸以及其他抑制剂)，当在治疗上进行施用(给药)时，可抑制CSF2RB蛋白的表达和/或活性，进而抑制前列腺癌的骨转移或前列腺癌细胞的迁移。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8,较佳地pH约为6-8,尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于):瘤内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。
[0108]可用于本发明的抑制剂包括:CSF2RB的抗体、抑制性mRNA、CSF2RB核酸的反义RNA、microRNA (miRNA)、siRNA、shRNA 以及 CSF2RB 的活性抑制剂。其中，典型的 CSF2RB 抑制剂为抑制性miRNA、siRNA。
[0109]典型地，将CSF2RB基因作为制备预防或治疗前列腺癌骨转移或前列腺癌细胞迁移的药物的靶点的技术方案包括以下方案:
[0110]1.化学合成双链核糖核酸分子，其序列特异性针对CSF2RB基因序列，利用脂质体包裹递送至肿瘤细胞内干扰CSF2RB基因的表达，观察软琼脂克隆形成能力、细胞迁移能力等细胞生物学特性的 改变。可利用本领域常规的方法来设计和合成特异性针对CSF2RB的核酸序列(如siRNA)。
[0111]2.利用各种载体，包括DNA载体、慢病毒载体来干扰CSF2RB基因的表达，达到体内干扰CSF2RB基因的效果，检测它们对裸鼠瘤体腹腔扩散或骨转移的治疗效果，从而实现抑制前列腺癌骨转移或癌细胞迁移的目的。
[0112]3.获得能够特异性抑制CSF2RB基因转运活性的多肽、单克隆抗体，达到抑制CSF2RB活性的目的，从而现实抑制前列腺癌细胞骨转移或癌细胞迁移的目的。
[0113]本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明CSF2RB抑制剂(如抗体、反义序列(如siRNA)、或抑制剂)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于):盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约I微克-10毫克/千克体重。
[0114]抗体
[0115]本发明还包括对人CSF2RB蛋白具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人CSF2RB基因产物或片段。较佳地，指那些能与人CSF2RB基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，将提纯的人CSF2RB基因产物或它的抗原片段注射入动物体内以产生多克隆抗体。同样，表达人CSF2RB蛋白或它的抗原的细胞也可以用来对动物致免疫而产生抗体。
[0116]本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab) 2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体。
[0117]本发明的抗体包括可以抑制CSF2RB功能的抗体，也可以是不影响人CSF2RB功能的抗体。每一类抗体都可以通过对人CSF2RB基因产物的片段或功能域致免疫而产生，而人CSF2RB基因产物及其片段可以用重组方法产生或用多肽合成仪进行合成。与非修饰形式的CSF2RB基因产物结合的抗体，可以利用在原核细胞(如E.coli)中产生的基因产物来免疫动物而得到。与翻译后修饰形式如糖基化或磷酸化CSF2RB蛋白或多肽结合的抗体，可以利用在真核细胞如酵母或昆虫细胞中产生的基因产物来免疫动物而得到。
[0118]可用于本发明的CSF2RB抗体可以是抗人CSF2RB蛋白抗体。本发明的抗人CSF2RB蛋白抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的人CSF2RB蛋白。
[0119]药物组合物和给药方式
[0120]本发明提供了含有活性成分(a)CSF2RB抑制剂；(b)药学上可接受的载体。
[0121]在本发明的药物组合物中，CSF2RB抑制剂CSF2RB抑制剂的含量没有特别限制，通常为 0.01-95wt%，较佳地为 0.l-90wt%o
[0122]本发明的药物组合物可以是单方制剂，也可以是复方制剂。
[0123]在复方制剂中，除了含有CSF2RB抑制剂之外，还可包含其他抗肿瘤化合物，例如化疗剂。代表性的化疗剂包括(但并不限于):烷化剂、抗代谢物、叶酸类似物、嘧啶类似物、嘌呤类似物以及相关抑制剂、长春花碱类、epipodopyvllotoxins、抗生素、L 一天冬酞胺酶、拓扑异构酶抑制剂、干扰素、钼配位复合物、大黄素取代的脲、甲基肼衍生物、肾上腺皮质抑制剂、肾上腺皮质类固醇、孕激素、雌激素、抗雌激素、雄激素、抗雄激素以及促性腺激素-释放激素类似物。优选的化疗剂包括:5—氟尿嘧啶(5-FU)、甲酰四氢叶酸、伊立替康、奥沙利钼、卡培他滨、紫杉醇和多西紫衫醇。
[0124]本发明的药物组合物的剂型和制备方法没有特别限制，可用本领域常规通用的制法制成片剂、胶囊、颗粒剂、缓释剂、注射剂等各种剂型。优选的剂型是口服制剂(如片剂)和注射剂。
[0125]在本发明中，CSF2RB抑制剂或含CSF2RB抑制剂的药物制剂可用于预防和治疗前列腺癌骨转移或前列腺癌细胞迁移。
[0126]在本发明中，给药方式没有特别限制，可以通过口服、静脉内、肌内、腹腔内或皮下等途径给药。
[0127]本发明制剂可以每天服用或给药一次或两次、或多次，或者以缓释方式给药。优选的方式是每天服药一次，因为这样便于病人坚持，从而显著提高病人服药的顺应性。
[0128]服用时，极大多数病例一般每天应用的总剂量为每人Img~200g，较佳地为IOmg ~100g0
[0129]筛选方法
[0130]本发明还提供了基于CSF2RB进行药物筛选的方法。一种方法是先筛选影响(抑制)CSF2RB表达或活性的化合物，然后对筛选出的化合物进一步测试其对前列腺癌细胞的抑制作用。
[0131]本发明提供的筛选预防或治疗前列腺癌骨转移、前列腺癌细胞迁移的候选化合物的方法，基于该化合物对CSF2RB的表达量和/或活性的影响，一种典型的筛选方法包括步骤:
[0132](a )测试组中，在前列腺癌细胞的培养体系中添加测试化合物，并观察所述测试组的细胞中CSF2RB的表达量和/或活性；在对照组中，在相同细胞的培养体系中不添加测试化合物，并观察对照组的所述细胞中CSF2RB的表达量和/或活性；
[0133]其中，如果测试组中细胞的CSF2RB的表达量和/或活性小于对照组，就表明该测试化合物是对CSF2RB的表达和/或活性有抑制作用的预防或治疗前列腺癌骨转移的候选化合物。和/或[0134](b)对于步骤(a)中获得的候选化合物，进一步测试其对前列腺癌细胞骨转移或迁移的抑制作用。如，在测试组中，前列腺癌细胞的培养体系中添加测试化合物，并观察癌细胞移动的距离的数量和/或侵袭情况；在对照组中，在前列腺癌细胞的培养体系中不添加测试化合物，并观察癌细胞移动的距离的数量和/或侵袭情况；其中，如果测试组中癌细胞的迁移距离或侵袭数量显著小于对照组，就表明该测试化合物是对前列腺癌骨转移细胞或前列腺癌细胞迁移有抑制作用的预防或治疗前列腺癌的候选化合物。
[0135]检测方法和试剂盒
[0136]本发明涉及定量和定位检测人CSF2RB蛋白水平或mRNA水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的。试验中所检测的人CSF2RB蛋白水平，可以用于诊断前列腺癌的骨转移或前列腺癌细胞的迁移。
[0137]一种检测样品中是否存在CSF2RB蛋白的方法是利用CSF2RB蛋白的特异性抗体进行检测，它包括:将样品与CSF2RB蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在CSF2RB蛋白。
[0138]CSF2RB蛋白或其多核苷酸可用于CSF2RB蛋白相关疾病的诊断和治疗。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列或DNA芯片上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。抗CSF2RB的抗体可以固定在蛋白质芯片上，用于检测样品中的CSF2RB 蛋白。
[0139]本发明还提供了一种检测前列腺癌是否有骨转移的试剂盒，它含有特异性扩增CSF2RB的引物对和/或CSF2RB特异性抗体以及标签或说明书。
[0140]其中，所述的标签或说明书注明以下内容:当检测对象的CSF2RB相对-肌动蛋白的mRNA表达量与非癌症组织的CSF2RB相对-肌动蛋白的mRNA表达量之比>2，则提示该检测对象前列腺癌骨转移的几率高于普通人群。
[0141]一种典型的本发明的试剂盒可用于检测人前列腺组织样品。
[0142]本发明还包括一种抑制前列腺癌骨转移或前列腺癌细胞迁移的方法，包括步骤:给需要治疗的对象(哺乳动物)施用安全有效量的CSF2RB抑制剂。
[0143]本发明的有益效果
[0144]1.本发明CSF2RB基因或蛋白可以用于作为诊断或预测前列腺癌骨转移的特异性标志物，即CSF2RB高表达者前列腺癌骨转移的几率更大。
[0145]2.本发明CSF2RB抑制剂可以有效地抑制前列腺癌的骨转移或前列腺癌细胞的迁移，可作为预防或治疗前列腺癌骨转移或前列腺癌细胞迁移的药物。
[0146]3.本发明的CSF2RB抑制剂还可以用作药物的筛选，从而筛选出对能够有效抑制前列腺癌骨转移或前列腺癌细胞迁移的药物。
[0147]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
[0148]通用方法:
[0149](I)激光显微切割(LCM)获取正常前列腺上皮细胞[0150]由于前列腺外周区腺体丰富，占前列腺腺体体积的70%，且为前列腺癌的好发区，故该区为正常前列腺与前列腺癌对比分析蛋白表达谱的最佳选择区。取10例无前列腺病史的尸检人前列腺组织标本，取其外周区部分制备IOum厚度冰冻切片；改良HE染色；用LCM选择性获取腺上皮细胞团，并收集至收集管中。
[0151](2)前列腺癌细胞的培养
[0152]PC-3细胞培养于F12培养基中，培养基中含10%新生胎牛血清、I % L-谷氨酰胺、100U.mL-Ι青霉素、IOOmg.L-1链霉素。于37°C、5% C02孵箱中培养，选用对数生长期细胞进行实验。
[0153](3)膜蛋白的样品制备及定量
[0154]3.1膜蛋白的样品制备
[0155](I)首先收集50mg用LCM获取的人正常前列腺细胞团，然后用细胞刮刀收集细胞培养瓶中的PC-3细胞3-5 X I O6。
[0156](2)用试剂盒中2ml冷洗液洗三种细胞，各两遍。
[0157](3)每种细胞中均加入IOul蛋白酶抑制剂，并快速加入2ml蛋白提取液1，充分混匀后，4°C摇床孵育lOmin。
[0158](4)4°C，16000g离心 15min后，得到的上清即为胞浆蛋白。
[0159](5)将上清尽量吸干净，加入5μ I蛋白酶抑制剂，然后迅速加入1ml蛋白提取液2，充分混匀后，4°C摇床孵育30min。
[0160](6)4°C，16000g离心15min后，得到的上清即为膜蛋白。
[0161](7)将上清移到另一离心管中，并于_80°C冰箱备用。
[0162]3.2BCA蛋白定量
[0163](I)以牛血清白蛋白(BSA)为标准品，按BCA蛋白检测试剂盒说明书将A液与B液按50:1的体积比混合为工作液。
[0164](2)在96孔板中分别加入25 μ I的标准品和/或待测样本，每个样本设3复孔。
[0165](3)各孔中加入200 μ I工作液，混匀，37°C孵育30min。
[0166](4)用酶标仪于562nm波长处测定各孔的OD值，参照标准品绘制标准曲线，计算各待测样品的蛋白浓度。
[0167](4) SDS-PAGE
[0168]两组样品，每组各IOOug膜蛋白在分离胶为13%、浓缩胶为5%的SDS-PAGE胶上进行分离，起始电流15mA、15min,然后加大电流至30mA, 40min,直至溴酹兰到凝胶底端,停止电泳。电泳结束后用HSC固定液固定I小时，然后进行胶体考马斯亮蓝染色I小时，最后脱色。
[0169](5)胶内酶解及质谱分析
[0170]考马斯亮蓝染色后，每个样品的整个泳道均被平分为8份凝胶，进行胶内酶解，然后使用IDLC-LTQ进行分析，C18柱(0.15mm直径，15cm长)，上样为自动进样器，上样后样品经过C18Trap柱脱盐，然后在C18柱上进行分离(A相为0.1 % FA的Millpore水，B相为
0.1 % FA84%乙腈水溶液，梯度为2小时内从4%的B相上升到50%的B相)，质谱设备为LTQ(Thermo), Metal needle 电喷雾。
[0171](6)数据库查询[0172]对串联质谱的原始数据使用BioWorkSTM3.0软件中的Turbo SEQUEST程序搜索IPI Human V3.15.1的数据库，最后得到鉴定的蛋白质结果。可被承认的SEQUEST搜索结果必须是DelCN ^0.1(无论电荷什么状态)。带一个电荷的肽必须是胰蛋白酶肽，且相关得分(Xcorr)不得少于1.9，带2个电荷的胰蛋白酶肽或部分胰蛋白酶肽的相关得分不得少于2.2分，带3个电荷的胰蛋白酶肽或部分胰蛋白酶肽的相关得分不得少于3.75分。
[0173](7)蛋白质信息汇总及生物信息学查询
[0174]使用Buildsummary软件合并每个组的所有条带查库结果输出鉴定蛋白质列表。用GOA(http://www.eb1.ac.uk/GOA/)对质谱鉴定后的蛋白质按照细胞组分、功能、生物学途径进行分类；对比人正常前列腺细胞、PC-3细胞中的蛋白在IPI中的数据库号获得两者的差异膜蛋白质后，找出正常细胞中没有仅存在于PC-3细胞中的差异膜蛋白质，并通过(http:1Iwm.psort.0rg/)查询蛋白的亚细胞定位情况。然后用SOSUI (http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/)网站查询膜蛋白的跨膜区域(TMD),在蛋白的基序内预测跨膜螺旋。
[0175](8)前列腺癌骨转移侯选靶标蛋白的选择标准
[0176]为了选出新的前列腺癌骨转移的侯选标志蛋白，应用了下面的选择标准:
[0177](I)没有在前列腺癌中研究过的新蛋白；
[0178](2)被选出 的蛋白要满足SEQUEST程序搜索结果的过滤参数(当Charge+1，Xcorr ^ 1.9 ;当 Charge+2, Xcorr > 2.2 ;当 Charge+3, Xcorr ^ 3.75 ;其中 DelCN ^ 0.1)
[0179](3)质谱鉴定结果中:理论谱与实验谱的离子匹配数/理论谱中离子数> 50% ；
[0180](4)蛋白的二级质谱图在基线噪声以上应该是清楚的，b、y离子应该是连续的。
[0181]上述4个条件同时满足说明蛋白可以作为目标侯选蛋白。
[0182](9)CSF2RB在基因及蛋白水平的表达情况
[0183]9.1半定量聚合酶链反应(RT-PCR)
[0184]①实验用引物:
[0185]CSF2RB 上游引物:5’-GCCATAGCAATCAGCAGAACG-3’ (SEQ ID N0.:3)
[0186]下游引物:5’-GATGAGAAGAGGACCCCCTAAT-3’(SEQ ID N0.:4)
[0187]β-actin 上游引物:5’-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3’ (SEQ ID N0.:5)
[0188]下游引物:5’-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3’(SEQ ID N0.:6)
[0189]②实验流程
[0190]I)常规培养PC-3细胞及RWPE-1细胞，各收集1.5 X IO6个细胞，加ImLTrizol吹打，
[0191]室温5分钟。
[0192]2)加氯仿1/5体积(0.2ml)，颠倒混匀10下，室温5分钟。4°C，离心
[0193]12000g，15 分钟。
[0194]3)转上层水相(约400 μ I)于另一 1.5mlEP管中加等体积异丙醇(约400
[0195]μ I)，混匀室温10分钟，4°C，离心12000g, 10分钟。
[0196]4)弃上清，加冰预冷的75%乙醇(用DEPC水配)lml，4°C离心7500g，
[0197]5 分钟。
[0198]5)弃上清，空气干燥5-10分钟，溶于DEPC水中至20 μ I (10 μ 1-20 μ I)。[0199]6) RNA分析:在260nm和280nm测定样品的吸收值，确定RNA质量。
[0200]IOD260 = 40 μ g RNA,计算 RNA 产率。OD260/OD280 = 1.8 ~2.0 之间，说明 RNA 纯度高。变性琼脂糖凝胶电泳，确定抽提RNA完整性和DNA污染情况。
[0201]7)按下述方法进行逆转录:
[0202]I反应体系
MgCI1.2 μ I
[0203]10XRXA PCR BufferI μ I
RNase Free dH23.75 μ I
dXTP MixtureImI
RXase Inhibitor0.25 μ I
AMV Reverse Transcriptase 0.5 u I
[0204]
Oiigo dT-Adaptor Primer 0, 5 μ I
Sample RNAI μ I
Total10 μ I
[0205]II反应条件
[0206]42 °C 30 分钟
[0207]99 °C5 分钟
[0208]5 °C5 分钟
[0209]8)按下述方法进行PCR
[0210]I反应体系
[0211]
5 X PCR Buffer10 μ I
火菌蒸馏水8.75 P I
TaKaRa EX Taq0.25 P I
上游特异性PCR引物 0.5μ.1
下游特异性PCR引物 0.5μ I
Total40 P I
[0212]II把8) —①的反应液加入到7)-②的逆转录反应结束后的PCR反应管中，轻轻混匀。
[0213]③反应条件
[0214]
【权利要求】
1.一种集落刺激因子 2 受体 β (Colony Stimulating Factor2Receptor, Beta,CSF2RB)基因或其蛋白的用途，其特征在于，用于制备预测或检测前列腺癌骨转移的试剂或试剂盒。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的试剂包括CSF2RB的特异性引物、特异性抗体、探针和/或芯片。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述检测是测定组织样品。
4.一种用于检测前列腺癌骨转移的诊断 试剂盒，所述的试剂盒含有一容器，所述容器中含有检测CSF2RB蛋白或mRNA的检测试剂；以及标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于检测前列腺癌骨转移。
5.一种CSF2RB抑制剂的用途，其特征在于，用于制备预防或治疗前列腺癌骨转移的药物组合物。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的抑制剂包括:CSF2RB的抗体、CSF2RB核酸的反义RNA、microRNA、siRNA、shRNA以及CSF2RB的活性抑制剂。
7.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的药物组合物包括CSF2RB抑制剂作为活性成分，和药学上可接受的载体。
8.—种体外非治疗性抑制前列腺癌迁移的方法，包括步骤:在CSF2RB抑制剂存在下，培养前列腺癌细胞，从而抑制前列腺癌细胞迁移。
9.一种筛选用于抑制前列腺癌骨转移或前列腺癌细胞迁移的化合物的方法，其特征在于，包括步骤: (a)测试组中，在前列腺癌细胞的培养体系中添加测试化合物，并观察所述测试组的细胞中CSF2RB的表达量和/或活性；在对照组中，在相同细胞的培养体系中不添加测试化合物，并观察对照组的所述细胞中CSF2RB的表达量和/或活性； 其中，如果测试组中细胞的CSF2RB的表达量和/或活性小于对照组，就表明该测试化合物是对CSF2RB的表达和/或活性有抑制作用的治疗前列腺癌骨转移或前列腺癌细胞迁移的化合物；和/或 (b)对于步骤(a)中获得的候选化合物，测试所述候选化合物对前列癌细胞骨转移或前列腺癌细胞迁移的抑制作用。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，在步骤(b)中包括步骤:向测试组前列腺癌细胞的培养体系中添加测试化合物，并观察前列腺癌细胞移动的距离的数量和/或侵袭情况；向对照组前列腺癌细胞的培养体系中不添加测试化合物，并观察前列腺癌细胞移动的距离的数量和/或侵袭情况；其中，如果测试组中前列腺癌细胞的迁移距离或侵袭数量显著小于对照组，就表明该测试化合物是对前列腺癌骨转移前列腺癌细胞迁移有抑制作用的化合物。
【文档编号】C12Q1/68GK103966334SQ201410216106
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年5月20日 优先权日:2014年5月20日
【发明者】李群, 李玉林, 李一雷, 高勇 申请人:李群