携带eb病毒核抗原1的重组腺病毒疫苗及其应用的制作方法

携带eb病毒核抗原1的重组腺病毒疫苗及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于疫苗制备领域，公开了一种携带EB核抗原1基因片段的重组腺病毒疫苗，该重组腺病毒疫苗是由EB核抗原1基因片段插入到腺病毒载体构建而成；该EB核抗原1基因片段编码EB核抗原1的C端氨基酸序列。本发明的疫苗可用于癌症的预防和治疗。
【专利说明】携带EB病毒核抗原1的重组腺病毒疫苗及其应用
[0001]

【技术领域】
[0002]本发明涉及疫苗制备领域。具体而言，本发明涉及携带携带EB病毒核抗原I疫苗。更具体地说，本发明涉及经所述的携带EB病毒核抗原I的重组腺病毒疫苗以及与其他疫苗联合应用。
[0003]

【背景技术】
[0004]世界卫生组织下属的国际癌症研究机构提供的新数据显示，2012年全球新增约1410万例恶性肿瘤病例，死亡人数达820万。鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma, NPC)在各种恶性肿瘤中具有独特的流行病学特征，在世界上大多数国家很罕见，发病率在1/100000以下。而在我国南方很常见，严重危害人民的生命和健康，尤其是我国的广东、广西一些地区；大部分鼻咽癌发生在45?54岁年龄组，严重影响劳动力健康。鼻咽癌发病率在肿瘤中位于第一、二位，被称为“广东癌”。
[0005]鼻咽癌是一种起源于鼻咽部上皮组织的常见恶性肿瘤。目前，放射治疗是鼻咽癌首选的治疗方案，按照分层综合治疗原则，多数早期病例采用单纯放射治疗，少数放射敏感性差的肿瘤和晚期病例可加辅助化疗或增敏剂等，以提高疗效。但中晚期鼻咽癌治疗后常常复发或向远处转移，对于该类患者在临床上尚无有效治疗方案。
[0006]EB病毒和鼻咽癌密切相关，而且有一致性。EB病毒抗体，尤其是IgA/VCA抗体，在鼻咽癌患者中明显高于对照组；肿瘤存在与消退与抗体滴度呈正相关，而与患者所在地理位置和种族差别无关；在未分化和高分化的鼻咽癌中能恒定地发现EB病毒基因组和EB病毒相关抗原；EB病毒含有能使B淋巴细胞、猴肾和人类上皮细胞发生转化和不断增殖的基因；咽部正常细胞膜和鼻咽癌细胞均有EB病毒受体的存在。虽然病毒能进入咽部正常上皮细胞内，而且肿瘤中也存在病毒基因组，但病毒在鼻咽癌发生中的作用机制还未被证实。
[0007]病毒在活体内的感染是一个复杂的过程，包括病毒的潜伏、活化、转化复制等。鼻咽癌患者的肿瘤组织以及外周血淋巴细胞中存在着EB病毒潜伏感染。在已分化和未分化上皮细胞中可发现EB病毒基因组和潜伏基因产物；所有鼻咽癌都表达EB病毒编码的潜伏蛋白和EBNAl。EB病毒所表达的潜伏抗原中，LMPl被认为在鼻咽癌发生中起关键性作用，它可以诱发细胞增生并影响细胞生长调控机制，被认为是EB病毒的一个致癌基因。NPC患者的血清中存在EBV特异性的IgA/VCA抗体，在NPC组织中存在EBV核酸和基因的表达。在NPC患者血清中发现了 EBV DNA的增殖。这些结果引导人们将EB病毒基因作为EBV相关肿瘤的特异性免疫靶抗原。
[0008]EB病毒主要通过唾液传播，世界上大多数人都感染了 EB病毒，一旦感染终身携带。但多数人安然无恙，仅有少数个体发展成为NPC，显然EBV特异性细胞免疫在控制病毒、防止肿瘤发生中起到了重要的作用。同时有特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic Tlymphocyte, CTL),它控制EB病毒转化的B淋巴细胞，这种特异性的细胞免疫是受HLA所限制的。并发现具有这种特异活性的T细胞识别表位。近年来，经过研究和详细分析已证明LMPULMP2均能诱发特异性CTL反应。细胞免疫在对病毒活化的“监视”和清除转化的B细胞中起着关键性作用。
[0009]NPC细胞的EBV抗原表达主要局限在EBNAl和LMP1、LMP2上。LMPl作为EBV重要的致瘤蛋白，在许多EBV相关疾病中扮演重要的角色，是EB病毒细胞免疫反应的刺激剂和靶抗原，尤其是N段的蛋白区域，提供了 EB病毒诱导的特异性细胞毒性杀伤反应的靶抗原，在早前就有证实LMPl蛋白序列中有特异性CTL识别表位，具有激发细胞免疫的能力，但该基因具有潜在的致癌性。LMP2也是在NPC等EBV相关肿瘤中持续表达的病毒蛋白之一。LMP2不引起B淋巴细胞的转化，无致癌性。并且LMP2蛋白序列中存在多个可被人CTL识别的抗原表位，不同的人HLA分型识别不同的抗原表位，而且LMP2也能刺激转基因小鼠细胞系的CTL反应。国际上已经用LMP2作为治疗性疫苗，用于NPC的临床试验。我们科室构建的包含该基因的重组腺病毒疫苗已经完成临床I期试验，并申报临床I1、111期试验。构建的痘苗病毒疫苗，正处于临床前的药效学实验阶段。
[0010]EBNAl蛋白中包含一段甘氨酸-丙氨酸重复区(Gly-Ala repeat reg1n),具有阻止EBNAl全长蛋白的降解，抑制其递呈给CD8+T细胞的作用，这种潜在的免疫抑制作用限制了其在EBV相关肿瘤免疫治疗中的应用，尤其限制了伯尔基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma,BL)的CTL治疗。
[0011]EBV核抗原I (EB nuclear antigenl, EBNA1)是在NPC组织细胞中有限表达的几种抗原之一，也是唯一在EBV潜伏感染和活化状态中均表达的抗原。早期研究显示=EBNAl表达产物为DNA结合蛋白，是EB病毒在肿瘤细胞中维持潜伏感染状态及DNA复制的关键因子，是重要的致细胞转化蛋白，同时，可以诱导体液免疫应答，在NPC病人中可以检测到IgG/ENBAl和IgA/EBNAl抗体。近年研究发现EBNAl蛋白序列中含有的⑶4+ T细胞表位，在特异性的CD4 +T细胞介导的细胞免疫反应中起重要的调节作用。
[0012]EBNAl由EBV BamHIK基因编码，长1923bp，无内含子，编码641个氨基酸。依据EBNAl氨基酸序列特点将其分成3部分，N端(1-89):由89个氨基酸组成；G_Ar重复序列(90-327):由多个“甘氨酸和丙氨酸”组成的重复序列;C端(328-641):含有多个⑶4T细胞识别表位。其中1-89位和322-379位氨基酸残基，互相协调共同介导病毒基因组以附加体的形式连接细胞染色体上并持续存在。
[0013]近年研究发现EBNAl C-末端(380-641位氨基酸)具有明显特异性⑶4 + T细胞表位，对比而言很少能看到针对于潜伏膜蛋白(LMP1、2)表位的反应(EBNA1、EBNA3C>>LMP1和LMP2)。在我国鼻咽癌高危人群中EBNAl多肽表位明显集中在EBNAl的C-末端区域，包括DP5-限制性多肽表位，被近一半的检测志愿者所识别，引起DP5-阳性靶细胞对EBNAl的识别[27]。文献报道，在EBNAl中可能有28条⑶4 T细胞识别表位，而目前能够确定的只有10条(DP3, DP5, DQ2, DQ7, DRl, DR7, DR11，DR14，DR15, DR103)。CD4 + T 细胞主要分为两个亚群辅助性T细胞(Thl和Th2)，是抗病毒抗体和CTL产生过程中所必需的辅助细胞，同时产生细胞因子如IFN-Y和TNF等直接发挥抗病毒作用，参与机体的体液免疫和细胞免疫应答。有研究表明，EBNAl的51个重叠多肽(aa400-641)刺激⑶4+特异性记忆T细胞和IFN- Y的释放，单独的EBNAl多肽不能检测到CTL应答，但对包含有EBNAl (aa73_487)或EBNAl(aa494-508)的多聚抗原表位却呈现较强的应答反应。在14例EBV阳性淋巴组织增生性疾病患者中有9例患者可成功产生EBNAl特异性⑶8+效应T细胞[28]。健康人体优先识别EBNAlC-末端部分区域(aa452-548)，患者的CD4+T细胞对整个C-末端区域(aa400_641)有较广泛的识别作用，人类白细胞DR限制性EBNAl (aa481-500)表位形成部分C-末端螺旋区域。EBNAl (aa458 - 641)可被CD4-T细胞表位识别，EBNAl (aa401_641)表位的形成也已被[29]报道。人类白细胞DR限制性EBNAl(aa514-527)表位来自EBV游离体，该表位形成部分β_片层结构。EBNAl (aa561-573)对特异性CD4+T细胞同时具有很高的亲和力，因此该多肽可用于T细胞识别强有力的刺激物并可被HLA-DRl1、-DRl2或-DR13分子递呈。数据显示，该多肽优先诱导⑶4+调节性T细胞，EBNAl (aa518-530)多肽优先诱导⑶4+效应T细胞；605-641位氨基酸残基的肽段存在一个酸性激活的结构域，该羧基末端具有较强的免疫原性:EBNA1 (aa607-619)特异性⑶4+T细胞对MHC-1类多肽具有很强的亲和力，可被常见的HLA-DQ2分子递呈。
[0014]EBNAl在特异性细胞免疫应答中起重要的作用。在EB病毒感染导致的伯尔基特淋巴瘤细胞中，EBNAl在以附加体形式存在的细胞中呈现明显负调控效应。EBNAl特异性⑶4 + T细胞系，包括⑶4+辅助T细胞和调节T细胞，具有双重效应，既可刺激新生⑶4+和CD8+T细胞的增殖反应，也可诱导T细胞免疫抑制。在器官移植者中，循环中的EBV特异性的⑶8 + T细胞功能和数量依赖于⑶4 + T细胞的数量。绝对低的⑶4 + T细胞数量，大大增加了移植后淋巴细胞增生性疾病风险。一些报道称EBNAl特异性的⑶4T细胞在体外能抑制EBV感染的B细胞生长，EBV特异性的⑶4+T细胞在T细胞基础上的治疗可能发挥重要的作用。在EBV相关肿瘤中和细胞系中，EBNAl在细胞核中的定位影响CD4+T细胞表位的展示，其转录与表达决定EBV阳性肿瘤细胞生长，EBNAl特异性的CD4+T细胞识别EBV转化B细胞系，翻译效率影响CD8+T细胞识别表位的抗原提呈。对NPC的研究，由于NPC细胞仅选择性的稳定表达EBNAl和LMP1、2，因而EBNAl可能在特异性的⑶4 + T介导的细胞免疫反应中起重要的调节作用。
[0015]鉴于EBNAl在特异性的⑶4 + T介导的细胞免疫反应中起重要的作用，目前已经有把EBNAl作为治疗NPC疫苗的报导。Taylor等将EBV的EBNAl的CD4细胞识别表位集中区域(363-641位氨基酸)基因和LMP2全长的全长基因连接起来创建了 EL融合基因，构建了重组安卡拉痘苗病毒疫苗人(rMVA-EL)，表达嵌合抗原，以此激活特异性的⑶4+和⑶8+T细胞的免疫应答。结果表明在EBV阳性的白人和华人中，rMVA-EL可以激活记忆性CD4+和⑶8+T免疫应答。并且，高的免疫剂量激发更强程度的EBNA1/LMP2应答水平。目前rMVA-EL已经在英国和香港完成了 I期临床试验，正在进行II期临床试验。Lutzky VP等利用非复制型的腺病毒5/F35载体(Ad5F35)将LMP1、LMP2和EBNAl氨基酸序列以30个氨基酸长度为一个肽段依次进行分割，相邻肽段之间有15个氨基酸重叠，然后利用计算机软件将各肽段随机串联，拼接成一个全新的蛋白序列，其中LMPl去除11个氨基酸共5个拷贝的重复区，EBNAl去除283个甘氨酸一丙氨酸重复区。然后，根据新蛋白序列合成的6869bp的cDNA，依据密码子偏爱性选择第一或第二密码子，避免重叠氨基酸的编码相同，插入到Ad5F35载体中构建一个新的抗原拼接疫苗(Ad-SAVINE)。实验表明构建的Ad-SAVINE可以激活健康人和鼻咽癌患者的LMP特异性的细胞免疫应答。Smith等用Ad-SAVINE疫苗对复发和转移的NPC患者进行正规临床试验效果评估。在24个参加试验的病人中，16个病人EBV特异性的CTL水平明显升高(72.7%)，6个仅有微小或没有增加。在过继性免疫治疗后，EBNAl和LMPl、LMP2特异性CTL增加的NPC患者出现一度流感样症状或轻微不适。NPC的生存期38?420d，均值136d，同没有接受T细胞的比较，平均生存期从22(T523d。结果表明Ad-SAVINE疫苗进行过继性免疫治疗安全性和耐受性良好，可以使NPC患者临床受益。尽管如此，EBNAl对于具有CD8+T细胞识别表位的LMP2特异性细胞免疫应答的影响，还不清明确。因此，根据EBNAl本身的特性构建质粒，以EBNAl作为一种T细胞治疗肿瘤的有限靶抗原，也是目前研究的新热点，将为EB病毒相关肿瘤的靶向性基因治疗提供一个更新、更有效的途径。
[0016]


【发明内容】

[0017]基于本科室在EB病毒相关重组疫苗的研究基础，依据EBNAl基因特异性及腺病毒的广泛应用，我们将构建EBNAl蛋白羧基末端序列939bp重组腺病毒pDC316_EBNAl质粒，使用AdMax包装系统:其包装系统包括pBHG骨架质粒，穿梭质粒，HEK293细胞，通过Cre/LoxP获得重组病毒，这个过程发生在293细胞中，得到的重组病毒是El缺失的复制缺陷型腺病毒，病毒在不能够提供El区的细胞中只能实现外源基因的表达而本身不具备增殖能力。具体而言，本发明涉及经所述的携带EB病毒核抗原I的重组腺病毒疫苗和与其疫苗联合的疫苗。本发明还提供了携带EB病毒核抗原I的重组腺病毒疫苗的制备方法。
[0018]EB病毒与许多人类肿瘤相关,其中EBV核抗原I (EB nuclear antigenl,EBNA1)是在NPC组织细胞中有限表达的几种抗原之一，也是唯一在EBV潜伏感染和活化状态中均表达的抗原。EBNAl蛋白中含有⑶4+T细胞识别表位，但其中也中包含一段甘氨酸-丙氨酸重复区(Gly-Ala repeat reg1n),具有阻止EBNAl全长蛋白的降解,抑制其递呈给⑶8+T细胞的作用，这种潜在的免疫抑制作用限制了其在EBV相关肿瘤免疫治疗中的应用，因此，结合我们在EBV疫苗研究方面的工作，通过基因工程手段改造的EBNA1(去除重复序列)，同时携带该基因的疫苗对其他携带EBV相关基因疫苗细胞免疫应答的起促进作用的部分。
[0019]本发明的发明人成功构建了一种复制缺陷型的重组腺病毒，该病毒携带外源基因，所述的外源基因编码的蛋白是一种能够很好的引发CTL反应和增强其他特异性的CTL反应的抗原。本发明的具体实施方案中，所述的外源基因为EB病毒核抗原I编码的基因(EBNA1)，这种携带有EB病毒核抗原I编码的基因的复制缺陷型重组腺病毒简称^rAd-EBNAl或含有EBNAl基因的重组腺病毒。所述的rAd-EBNAl滴度不小于IX 101° VP/mL，可在体内诱导EBNAl特异性的抗体生成反应和细胞毒性淋巴细胞反应。本发明的一个优选实施方案中，该重组病毒的滴度为IXlO13 VP/mL.本发明的一个优选实施方案中，所述的rAd-EBNAl是利用Admax系统构建的。
[0020]简而言之，为了得到本发明所述的rAd-EBNAl，我们首先PCR法扩增B95-8细胞株中EBV ebnal基因的C-端部分片段，经I和汝^ II酶切位点插入pDC316穿梭质粒。测序比对正确后，与腺病毒骨架质粒PBHG共转染293细胞。收集病变后细胞，获得的重组病毒颗粒。并进一步在293细胞扩增和纯化，获得高纯度病毒。
[0021]PCR扩增获得939 bp 基因片段，通过I和及^7 II酶切位点插入，获得重组穿梭质粒PDC316-EBNA1，测序结果与标准株序列一致。pDC316_EBNAl和骨架质粒pBHG共转染293细胞后，细胞出现病变，获得含EBV 基因片段的重组腺病毒(rAd-EBNAl)。流式细胞术和Western blot检测结果证实，EBNAl在293细胞中表达，电镜下观察到典型的腺病毒颗粒，病毒二代滴度可达18 TCID5(l/mL。进一步扩增可获得重组病毒的滴度为I X 113 VP/mL.另一方面，本发明提供了携带EBNAl基因的rAd-EBNAl。在一个具体的实施方案中，本发明提供了经本发明所述的rAd-EBNAl。本发明中所述的重组腺病毒是E1、E3基因缺失的非复制型腺病毒5型载体系统一AdMax?系统。腺病毒载体是基因治疗中发展最为成熟的载体系统。具有安全性高、稳定性好、宿主细胞范围广泛、对人致病性低、规模化和商业化程度高、同时表达多个基因等优点。因而已在基因工程疫苗研制和基因治疗中显示出巨大的应用前景。AdMax?腺病毒系统是由腺病毒载体鼻祖Dr.Frank Graham在1999年创建的一套重组腺病毒构建系统，该系统基本原理是通过Cre-1oxP重组酶，使共转染到293细胞中的腺病毒载体穿梭质粒和骨架质粒在重组酶的作用下产生重组腺病毒，得到的重组病毒是E1/E3缺失的复制缺陷型腺病毒。与其他腺病毒包装系统相比，该系统表现出明显的优势，具有出毒速度快(7-10d)、效率高(高约100倍)、可信度高(序列<7-8kb，外源蛋白对腺病毒没有毒性，可以完全表达)、过程简单(仅需构建穿梭质粒和共转染两步)优势。
[0022]本文中所述的含EBV EBNAl基因片段的rAd-EBNAl疫苗，表达外源基因编码的蛋白抗原。其中所述的外源基因为EBNAl蛋白基因。
[0023]本文中所述的rAd-EBNAl，表达外源基因编码蛋白复制缺陷型rAd-EBNAl疫苗。
[0024]另一方面本发明提供的一种制备rAd-EBNAl疫苗的方法包括:
Cl) 本实验成功从B95-8细胞中获取EBV EBNAl基因片段；
(2)构建了重组穿梭质粒PDC316-EBNA1 ;
(3)在293细胞内包装出重组腺病毒rAd-EBNAl，并表达了 EBNAl蛋白。
[0025](4) 用如上方法的到rAd-EBNAl疫苗。
[0026]在一个具体的实施方案中，其中所述的腺病毒穿梭质粒是PDC316。
[0027]在一个具体的实施方案中，其中所述的腺病毒骨架质粒是pBHG。
[0028]在一个具体的实施方案中，其中所述的腺病毒包装细胞是293细胞。
[0029]试验证明本发明所述的rAd-EBNAl能够在体外激发EBNAl特异性的CTL，同时对LMP2特异性CTL反应起增强作用。
[0030]本发明所述的rAd-EBNAl疫苗，用于治疗和预防EBV相关肿瘤的疫苗和药物用途。在一个具体的实施方案中所述的疫苗为rAd-EBNAl疫苗，所述的肿瘤为鼻咽癌。
[0031]根据给药的途径不同，可将本发明的疫苗组合配置成静脉、肌肉内、体腔内、组织内、皮内或皮下给药的可注射溶液或分散剂。
[0032]为了制备注射溶剂，例如可以使用无菌蒸馏水、注射用水、磷酸缓冲液、以及含有乙醇、多元醇的溶剂或分散介质作为载体或稀释剂。在任何情况下，所述的可注射制剂均应是无菌和可流动并适合于通过注射器注射给药的。
[0033]也可用于制药工业中已知的方法和辅助成分，将本发明的疫苗组合制成包裹剂。
[0034]另一方面，本发明提供了所述的疫苗制备用于预防和治疗EB病毒相关肿瘤，特别是鼻咽癌的疫苗或药物应用。
[0035]

【专利附图】

【附图说明】
[0036]图1:ebnal基因片段扩增及回收电泳图；
图2:pDC316-EBNAl双酶切、单酶切、pDC316单酶切鉴定；
图3:质粒在293细胞内的重组不意图；
图4:感染rAd-EBNAl后293细胞出现的典型病变(200 X)；
图5:rAd-EBNAl颗粒电镜负染结果(X97 000)；
图 6:ffestern blot 鉴定 EBNAl 表达；
图?:流式细胞仪检测EBNAl在细胞中表达；
图8:ELISP0T法检测小鼠EBNAl特异性细胞免疫反应；
A:免疫后I周EBNAl特异性细胞免疫反应B:免疫后2周EBNAl特异性细胞免疫反应C:免疫后4周EBNAl特异性细胞免疫反应D:免疫后8周EBNAl特异性细胞免疫反应图9 =EBNAl CD4+T特异性细胞免疫应答持续时间。
[0037]

【具体实施方式】
实施例
[0038]在本申请中，如无特殊说明，本发明的实施都使用分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学常规，技术，这些技术都是本领域技术人员所掌握。
[0039]实验材料和方法
大肠杆菌DH5a、质粒PDC316、pBHG、B95_8、293细胞细胞株为中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所曾毅院士实验室保存。培养条件为含10% FBS、1%青链霉素、1%谷氨酰胺的DMEM培养液。其中FBS购自美国GIBCO公司、DMEM购自Hyclone公司，其他培养液均由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所配液室提供。
[0040]质粒大量提取试剂盒QIAGEN Plasmidega Kits购自德国QIAGEN公司；常用限制性内切酶l、bgl I1、核酸凝胶纯化试剂盒、PCR试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司；连接酶购自美国NEB公司；真核转染试剂FuGene HD购自美国Promega公司；RPMI1640细胞培养基、DMEM细胞培养基和无菌PBS购自美国HyClone公司；胎牛血清购自美国GIBCO公司；PVDF膜MultiScreenHTS购自瑞典MABTECH公司；Tris碱(SERVA公司)，硼酸(上海云岭化工厂，AR)，EDTA (Sigma原装)，胰蛋白胨(0X0ID公司)，酵母提取物(0X0ID公司)，山羊抗小鼠EBNAl单抗购自美国Santa Cruz B1technology公司，辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗小鼠IgG、流式抗体购自中衫金桥生物技术有限公司。其他分析纯化学试剂由中国疾控中心病毒病所提供。
[0041]实施例1
1.1.ebnal基因片段的获取
EBV ebnal片段的PCR扩增引物的设计及合成用Primer5.0、DNAstar软件配合设计，由B95-8标准株为模板扩增939 bp (108937-109875) (aa329_aa641)的ebnal基因，具体序列见 SEQ NO:1 ；
c gaggaggcag tggaggccgg
108961 ggtcgaggag gtagtggagg ccggggtcga ggaggtagtg gaggccgccg gggtagagga
109021 cgtgaaagag ccaggggggg aagtcgtgaa agagccaggg ggagaggtcg tggacgtgga
109081 gaaaagaggc ccaggagtcc cagtagtcag tcatcatcat ccgggtctcc accgcgcagg
109141 ccccctccag gtagaaggcc atttttccac cctgtagggg aagccgatta ttttgaatac
109201 caccaagaag gtggcccaga tggtgagcct gacgtgcccc cgggagcgat agagcagggc
109261 cccgcagatg acccaggaga aggcccaagc actggacccc ggggtcaggg tgatggaggc
109321 aggcgcaaaa aaggagggtg gtttggaaag catcgtggtc aaggaggttc caacccgaaa
109381 tttgagaaca ttgcagaagg tttaagagct ctcctggcta ggagtcacgt agaaaggact
109441 accgacgaag gaacttgggt cgccggtgtg ttcgtatatg gaggtagtaa gacctccctt
109501 tacaacctaa ggcgaggaac tgcccttgct attccacaat gtcgtcttac accattgagt
109561 cgtctcccct ttggaatggc ccctggaccc ggcccacaac ctggcccgct aagggagtcc
109621 attgtctgtt atttcatggt ctttttacaa actcatatat ttgctgaggt tttgaaggat
109681 gcgattaagg accttgttat gacaaagccc gctcctacct gcaatatcag ggtgactgtg
109741 tgcagctttg acgatggagt agatttgcct ccctggtttc cacctatggt ggaaggggct
109801 gccgcggagg gtgatgacgg agatgacgga gatgaaggag gtgatggaga tgagggtgag
109861 gaagggcagg agtga
在引物上下游分别插入EcoR 1、Bgl II酶切位点，以便于克隆基因插入到腺病毒穿梭质粒PDC316中。(引物序列如下:上游5 ’ CGGAATTCATGCGAGGAGGCAGTG3，下游5’GAAGATCTTCACTCCTGCCCTT3’其中斜体部分分别为EcoR 1、Bgl II酶切位点。)PCR反应体系及反应条件如下:10 X PCR buff er2.5 μ L, dNTP(10 mmol) 2 yL，上下游引物20 μ M各 0.5 yL，Taq 酶 0.5 yL，模板 I μ L，ddH2018 yL，共计 25 μ L 反应体系。95°C X4min, (94 °C X 30 s,56°C X 30 s,72°C Xl min) X 30Cycles, 72°C 8 min，4°C 储存。同时做阴性对照(阴性模板为高压灭菌水)。
[0042]1.2.ebnal基因片段切胶回收
将PCR产物10 μ L上样，1%琼脂糖凝胶电泳，充分分离后在紫外灯照射下观察是否出现目的条带，切下目的条带，做切胶回收(用试剂盒)。方法如下:按照0.1 g胶加入300μ L QG 的比例，50°C 10 min,间断混勻 2-3 次；上清转入 QIA quick spin column, 12 000rpm 离心 I min JPAPE Buffer 700 μ L, 12 000 rpm 离心 I min ; 12 000 rpm 再次离心I min ;加15 μ L ddH20于纯化柱介质上,静置I min ; 12 000 rpm离心I min,收集DNA溶液；3 yL上样，在110 V电压下1%琼脂糖凝胶观察扩增产物回收的情况，结果见图1。
[0043]1.3.ebnal基因片段及穿梭质粒pDC316双酶切及回收
参照限制性内切酶双酶切使用表用限制性内切酶EcoR I和Bgl II分别双酶切PDC316、EBV-ebnal PCR扩增后胶回收片段。双酶切体系是20 yL(DNA/质粒2 yL ；NEBufferf μ L ；EcoR I 0.5 μ L ；Bgl II 0.5 μ L, ddH20 14 μ L)，在建议最适温度 37°C培养箱中酶切过夜。将酶切产物10 μ L上样，在110 V电压下1%琼脂糖凝胶电泳，充分分离后在紫外灯照射下观察是否出现目的条带，在紫外灯下切胶并使用Qiagen公司的切胶回收试剂盒回收目的片段，具体操作参见相关说明书。3 UL上样，在110 V电压下1%琼脂糖凝胶观察酶切产物回收的情况。
[0044]1.4.ebnal片段和穿梭质粒pDC316的连接
回收产物测浓度，连接比例按照载体:目的片段=1:3飞(摩尔比)的比例进行连接。连接体系如下(20 yL):pDC316 9 μ L ；EBV-ebnal 4 μ L ;连接酶 I μ L ;Buffer 2 μ L ；Η204 yL，16°C连接过夜。
[0045]1.5.连接产物转化大肠杆菌DH5 α
将连接产物加入200 μ L DH5 α感受态细胞的Eppendorf管中，轻轻旋转混匀，冰浴30min。将管移入预热的42°C水浴箱中水浴90 S，然后迅速将试管转移到冰上，使细菌冷却2^3 min。每管加入800 μ L不含抗生素的LB培养基，移至37°C摇床上，温育45 min (转速<150 rpm)。取50 μ L已转化的感受态细胞，用一支无菌的弯头玻棒轻轻涂到含AMP (100μ g/mL)的琼脂平板表面，将平板平置于室温至液体被吸收，倒置平皿，于37°C培养箱中培养12?16 h(同时做阴性对照)。
[0046]1.6.pDC316-EBNAl 的提取及鉴定
挑琼脂平板上的3个单菌落分别于5 mL含Amp(100 μ g/mL)的LB培养基中，37 °C，220rpm摇床过夜。用无菌吸头吸取5 μ L做PCR反应模板，反应体系与反应条件同目的片段的获取。将PCR鉴定正确的菌液进行质粒的小量制备(用Qiagen质粒提取Kit)，具体步骤参考试剂盒说明书。对提取的质粒进行浓度测定及单、双酶切鉴定，体系10 μ L(质粒3μ L ；NEBuffer I μ L ；EcoR I 0.5 μ L ；Bgl II 0.5 μ L ；ddH20 5 μ L)，37°C水浴 / 孵育箱4 h，将酶切产物3 μ L上样，进行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。初步鉴定正确后取5 μ L送由北京天一辉远生物科技有限公司测序，用以确定扩增过程中是否出现碱基错配以及读框正确。将测序鉴定正确的质粒命名为PDC316-EBNA1。
[0047]实施例2
2.1.穿梭质粒及骨架质粒的提取
包装腺病毒所用质粒的质量与包装的成功率有密切的关系，为此在包装前用EndoFreePlasmid Maxi Kit提取所需的骨架质粒pBHGLox Δ El.3Cre,制备方法依试剂盒的操作说明所述。穿梭质粒为上述构建的PDC316-EBNA1。将制备好的质粒溶于试剂盒附带的无菌TE溶液中，用紫外分光光度计测定260 nm/280 nm的OD值，计算核酸纯度(要求0D260/0D280>1.8)及核酸含量，分装保存于_20°C备用。
[0048]2.2.重组腺病毒rAd-EBNAl的包装
本部分研究采用真核表达系统，将B95-8标准株中的基因与腺病毒穿梭质粒载体PDC316连接，构建重组质粒，与骨架质粒pBHG共转染293细胞，包装重组腺病毒，具体方法参考真核转染试剂说明书。用FuGene HD将质粒pDC316_EBNAl与pBHG共转染293细胞，见图3。具体方法为:按照4X 15细胞/孔的量接293细胞到六孔板中，每孔用含2%FBS的DMEM培养基培养。次日细胞达到80°/Γ90%汇合度，按说明书将构建好的骨架质粒与穿梭质粒按照1:3的比例加入100 uL的无抗生素DMEM中，涡旋混匀后静置5 min，再加入6 μ LHD转染试剂注意转染试剂在液面下缓慢加入，吹打混匀f 2次，室温静置25 min。再将转染混合物分散缓慢地滴加到待转染的细胞孔中，边加边摇晃，并做一阴性对照。将板子放于37°C、5% C02培养箱中孵育7-14 d，注意每天观察细胞的变化，看有无病变或者细菌污染的情况发生，培养基不足时注意补加，此时期是双质粒在293细胞内重组成腺病毒的过程。
[0049]2.3.原代病毒的收获及扩增
大约7 d后，加入质粒的细胞开始出现病变(CPE)，再观察1-2 d，待细胞病变明显时，开始收获病毒。将细胞用I mL无菌Tip头吹下,连同培养基一起移入15 mL Eppendorf管中，用洗液洗细胞两次。注意细胞吹打后不能脱落要加入2 mL胰酶消化，2 min后弃胰酶，轻敲培养瓶侧壁使细胞脱落。在_80°C和37°C (水浴)反复冻融3次(使细胞破碎，释放病毒)；3 000 rpm离心10 min,吸取上清，即为原代病毒,命名为rAd-EBNAl,于_80°C保存。取原代病毒2 mL再次感染T75培养瓶中的293细胞，37°C、5%的C02培养箱中孵育2h，后补加8 mL新鲜培养基继续培养，代细胞完全病变后，收获病毒，在-80°C和37°C (水浴)反复冻融3次，此为rAd-EBNAl第一代病毒，于-80°C保存。
[0050]2.4.rAd-EBNAl DNA和形态鉴定及滴度测定
PCR鉴定在200 UL病毒上清中加入20 μ L蛋白酶K(20 mg/mL)，56°C消化蛋白I h，煮沸10 min，使蛋白酶K失活，10 000 rpm离心5 min，除去蛋白，此为病毒DNA模板。PCR引物采用构建PDC316-EBNA1的引物，反应体系及程序同目的片段的获取。取5 μ L PCR产物加上I μ L的6Χ加样缓冲液，进行110 V恒压电泳，紫外灯下观察结果。形态观察收集的病毒上清液，磷钨酸负染后于电镜下观察重组腺病毒形态。
[0051]50%组织培养感染剂量(TCID50)方法测定rAd-EBNAl的滴度TCID50实验的基础是应用极限稀释法使293细胞出现病变从而估计滴度。本项检测须做两组重复试验，两组试验可在同一天进行，也可在不同天进行。细胞的准备:取用DMEM+5%FBS预培养的293细胞I个75 cm2方瓶，待细胞生长至80%，收集细胞并用胰酶消化计数。用5%FBS的DMEM制备细胞悬液，每板需要10 mL浓度为I X 105个/mL的细胞悬液，后按每孔100 μ L (即I X 104个细胞)加入2个96孔板。
[0052]制备感染样品:10-5开始连续8个稀释梯度，稀释液用5%FBS的DMEM。按表2_1接种样品:各加100 μ L梯度稀释好的样品溶液，盖上第I个板并在37°C，5%C02培养箱培养。同步骤操作感染第2板。从第3 d到第10 d观察细胞状况，第10 d分析、记录CPE结果:CPE应在10 d之间出现。第10 d在显微镜下观察每孔CPE情况，并与阴性对照的一排对比，记录每排样品的阳性孔数。(如有一个板被污染，试验必须重做)
表1 TCID5tl法检测重组腺病毒滴度

【权利要求】
1.一种携带EB核抗原I基因片段的重组腺病毒疫苗，其特征在于，所述重组腺病毒疫苗是由EB核抗原I基因片段插入到腺病毒载体构建而成。
2.如权利要求1所述重组腺病毒疫苗，其特征在于，所述EB核抗原I基因片段编码EB核抗原I的C端氨基酸序列。
3.如权利要求1-2任其一所述重组腺病毒疫苗，其特征在于，所述EB核抗原I基因片段的核苷酸序列为939bp。
4.如权利要求1-3任其一所述重组腺病毒疫苗，其特征在于，所述EB核抗原I基因片段的核苷酸序列如序列I所示。
5.如权利要求1-4任其一所述重组腺病毒疫苗，其特征在于，所述腺病毒载体为复制缺陷型。
6.如权利要求5所述重组腺病毒疫苗，其特征在于，所述腺病毒载体是利用Admax系统构建。
7.权利要求1-6所述的重组腺病毒疫苗在制备治疗或预防EBV相关疾病的药物中的应用；所述EBV相关疾病优选鼻咽癌。
8.一种组合物，其中含有权利要求1-6任其一所述的重组腺病毒疫苗和一种或多种药物学上可接受的载体、佐剂和/或赋形剂。
9.一种活化的细胞毒性T淋巴细胞，该细胞是利用权利要求1-6任其一所述的重组腺病毒疫苗刺激细胞毒性T淋巴细胞使其活化得到的。
10.权利要求9所述的活化的细胞毒性T淋巴细胞在制备用于过继性治疗药物中的用途。
【文档编号】C12N7/01GK104162153SQ201410285165
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年6月24日 优先权日:2014年6月24日
【发明者】曾毅, 杜海军, 仝艳艳, 周玲, 王湛, 张丽霞 申请人:中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所