一种用于呼吸道合胞病毒感染的重组腺病毒疫苗的制作方法

本发明属于生物工程。本发明公开了一种用于呼吸道合胞病毒感染的重组腺病毒疫苗，所述疫苗包括mhc-ii限制性抗原表位肽、pref。

背景技术：

1、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，rsv)是一种可以引起婴幼儿和老年人及免疫功能缺陷者下呼吸道感染(lower respiratory tract infections，lrti)的常见病原体。研究发现，在流感高发季节，rsv病毒感染的检出频率以55.3％，远高于流感病毒的16.3％；因rsv病毒感染引起的肺炎病例为39％，而流感病毒引起的为18％，且在3月龄下新生儿中rsv病毒感染引起的临床病程程度明显高于流感病毒感染。rsv同时也威胁着成年人的健康，据统计，在美国65岁及65岁以上的成年人中，每年因rsv感染而导致的死亡率为7.2/100,000，在急性下呼吸道感染的住院病病例中，rsv引起的死亡病例占8％。因此，越来越多的数据证明rsv引起的严重健康威胁和沉重的全球经济负担越来越得到认可。但迄今为止，依旧没有获批上市的可以安全有效的预防rsv疫苗，因此who将rsv疫苗列为21世纪全球疫苗优先发展的计划之一。

2、rsv属于副粘病毒科肺病毒属，单股负链的rna病毒，基因组编码11种蛋白。其中融合蛋白f(fusion glycoprotein，f蛋白)是其最重要的抗原蛋白，且在不同rsv病毒株之间高度保守。已有研究表明，f蛋白具有两种不同的构像，即post-fusion f(postf)和pre-fusion f(pref)，pref蛋白引起的抗体的中和活性是postf蛋白的10-100倍，因此，针对pref蛋白的研究是目前rsv疫苗开发的焦点所在。

3、腺病毒载体与其它病毒载体相比，具有基因信息清楚，易于操作且可以插入大片段的外源基因；能有效增值，病毒滴度高，适用于基因治疗；宿主范围广，不仅可以感染分裂细胞，也可感染静置细胞；不整合至宿主dna中，不引起宿主dna突变；性质相对稳定等优势被广泛用于重组病毒的表达。目前，研究最为透彻和应用最为广泛的是人5型腺病毒，如康希诺的重组新冠、重组埃博拉以及俄罗斯“卫星v”，然而人5型腺病毒在人群中自然感染的比率比较高，固有免疫限制了其进一步的应用。

4、因此，人腺病毒稀有血清型和非灵长类血清型腺病毒成为了疫苗开发的另一个突破口。目前，基于人ad26和黑猩猩腺病毒(chimpanzee adenovirus，chad)的重组腺病毒新冠疫苗已经相继上市，且单针免疫可以起到良好的免疫效果。进一步显示了包括人稀有血清型和非人灵长类腺病毒载体等用于疫苗研究的安全性和可行性。

5、通过构建呼吸道合胞病毒mhc-ii限制性抗原表位肽及其融合前f蛋白整合疫苗，可以实现较高的cd4+t细胞免疫应答，为呼吸道合胞病毒疫苗研发拓阔研究思路。我们选择人稀有血清型的26型腺病毒和黑猩猩63型腺病毒作为载体，并对这两个腺病毒进行改造(rad26和rchad63)，构建可表达呼吸道合胞病毒融合前f(pref)及mhc ii限制性抗原表位肽的复制缺陷型重组腺病毒，进一步提高安全性，用于呼吸道合胞病毒感染的预防。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供呼吸道合胞病毒mhc-ii限制性抗原表位肽及其在疫苗制备中的应用。为实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

2、重组腺病毒疫苗，含有名称为rad26-pref-t-foldon和/或rchad63-pref-t-foldon的重组腺病毒，其中，rad26-pref-t-foldon含有重组腺病毒载体pad26-pref-t-foldon；rchad63-pref-t-foldon含有重组腺病毒载体pchad63-pref-t-foldon，其中，pref-t为编码pref蛋白和呼吸道合胞病毒mhc-ii限制性抗原表位肽t的核苷酸序列，其中，所述呼吸道合胞病毒mhc-ii限制性抗原表位肽t为复合表位肽，选自任意一组或多组seqid no.1～24吸道合胞病毒mhc-ii限制性抗原表位肽t的组合，其中，多组时每两组之间通过gpgpg连接。

3、在一个实施方案中，本发明所述的重组腺病毒疫苗，其特征在于，所述pref为tpa-pref的序列，其编码的氨基酸序列为seq id no.25；所述pref-t选自pref-t1，pref-t3，pref-t4，编码的氨基酸序列为seq id no.26～28，优选pref-t1，seq id no.26。

4、在一个实施方案中，本发明所述的重组腺病毒疫苗，其特征在于，其中，所述foldon，其编码的氨基酸序列为seq id no.29；其中，所述pref-t-foldon，其编码的氨基酸序列为seq id no.30。在一个实施方案中，本发明所述的重组腺病毒疫苗，其特征在于，其中，所述重组腺病毒载体为质粒pcdna3.1-pref-t-foldon经同源重组方法与骨架质粒整合得到，其中所述骨架质粒为pad26和pchad63。

5、在一个实施方案中，本发明所述的重组腺病毒疫苗，其特征在于，其中，编码呼吸道合胞病毒mhc-ii限制性抗原表位肽与pref蛋白的核苷酸，通过linker连接，所述linker选自：刚性linker、柔性linker、ires连接肽、2a连接肽及其他形式的linker中的一种，优选：eaaak。

6、本发明进一步提供多核苷酸序列，其特征在于：为编码seq id no.1～24及其组合，seq id no.26～28，seq id no.29-30的任意氨基酸序列的序列。

7、本发明进一步提供质粒，其特征在于，所述质粒为pcdna3.1-pref-t-foldon。

8、本发明进一步提供重组腺病毒载体，选自：pad26-pref-t-foldon或pchad63-pref-t-foldon。

9、本发明进一步提供重组腺病毒表达系统，选自：真核表达系统、酵母表达系统、大肠杆菌表达系统及昆虫细胞表达系统。所述的重组腺病毒表达系统，所述细胞为hek293细胞。

10、本发明进一步提供呼吸道合胞病毒mhc-ii限制性抗原表位肽t，选自t1，t3，t4，氨基酸序列分别对应于：

11、

12、

13、在一个实施方案中，包括本发明所述的重组腺病毒疫苗的制备方法：

14、(1)合成含有如pcdna3.1-pref-t-foldon所述核苷酸序列的质粒；

15、(2)将步骤(1)所述质粒通过同源重组方法与骨架质粒整合在一起，获得重组腺病毒载体pad26-pref-t-foldon或pchad63-pref-t-foldon；

16、(3)将步骤(2)所述重组腺病毒载体经过pac i酶切线性化，得到线性化质粒，采用所述线性化质粒转染至包装细胞如hek293细胞；

17、(4)培养步骤(3)所述细胞；

18、(5)收获从步骤(4)所述细胞释放的复制缺陷型重组腺病毒rad26-pref-t-foldon或rchad63-pref-t-foldon。

19、本发明进一步包括将上述重组腺病毒rad26-pref-t-foldon或rchad63-pref-t-foldon制备成疫苗制剂，所述疫苗制剂为注射剂，其中可以根据需要加入必要的疫苗载体或疫苗佐剂。

20、组合后的表位肽复合物称为：t，其通过linker与经过改造后的pref融合蛋白连接在一起，称为：pref-t，最后在其组合片段c-末端添加foldon序列，形成三聚体的形式表达，称为：pref-t-foldon。

21、本发明提供了pcdna3.1-pref-t-foldon质粒，其含有优化设计后的编码呼吸道合胞病毒mhc-ii限制性抗原表位肽与pref蛋白的核苷酸序列。所述重组腺病毒表达载体为质粒pcdna3.1-pref-t-foldon经同源重组方法与骨架质粒整合得到，其中所述骨架质粒为pad26和pchad63。

22、本发明重组腺病毒为复制缺陷型重组腺病毒，其由上述重组腺病毒载体制备而成，所述复制缺陷型重组腺病毒为rad26-pref-t-folden和rchad63-pref-t-folden。

23、本发明提供了针对呼吸道合胞病毒的疫苗，其活性成分为上述复制缺陷型重组腺病毒。

24、本发明提供了表达一种呼吸道合胞病毒mhc-ii限制性抗原表位肽与pref蛋白的核苷酸序列及含有其核苷酸序列的重组腺病毒载体、重组腺病毒及构建方法，得到的复制缺陷型重组腺病毒能够感染真核细胞，从而实现呼吸道合胞病毒mhc-ii限制性抗原表位肽与pref蛋白在真核细胞中表达的目的，为进一步研究呼吸道合胞病毒疫苗打好基础。

25、以下为本发明中出现的术语作进一步的解释和说明：

26、腺病毒：存在于人和其它哺乳动物以及禽类的眼、上呼吸道及消化道内等部位的直径为70～90nm，呈二十面体立体对称无包膜的dna病毒；

27、重组腺病毒：利用基因工程改造的复制缺陷的腺病毒，只可以在特定细胞系复制的腺病毒，免疫人体只感染而不复制的腺病毒。

28、腺病毒疫苗：将外源基因克隆至腺病毒载体中，并于特定细胞系包装出的复制缺陷型腺病毒制备的疫苗。

29、rad26：重组人26型腺病毒

30、pref：此处特指呼吸道合胞病毒融合前融合糖蛋白；

31、t：t细胞表位肽组合或复合物；

32、foldon：t4噬菌体fibritin蛋白质的结构域

33、rchad63：重组黑猩猩63型腺病毒

34、pad26：人26型腺病毒骨架质粒

35、pchad63：黑猩猩63型腺病毒骨架质粒

36、呼吸道合胞病毒mhc-ii限制性抗原表位肽：呼吸道合胞病毒ii型主要组织相容性复合体抗原表位肽；

37、信号肽：是引导新合成的蛋白质向分泌通路转移的短肽链；

38、tpa：组织纤溶酶原激活物信号肽

39、pcdna3.1：质粒pcdna3.1

40、linker：连接基团；

41、刚性linker：具有相对坚硬结构，可以有效将蛋白结构域分开的连接基团；

42、柔性linker：不影响蛋白结构域的相互作用或者相互距离的连接基团；

43、ires：内部核糖体进入位点；

44、2a：一种平均长度18-22个氨基酸短肽，存在于多种病毒中；

45、质粒：任何染色体外的遗传决定物质；

46、载体：指在基因工程重组dna技术中将dna片段(目的基因)转移至受体细胞的一种能自我复制的dna分子；

47、表达盒：启动子，靶基因，和报道基因组成，能在特定组织中表达并易于检测的一组dna序列；

48、真核表达系统：是通过dna重组技术，在酵母、昆虫细胞、真核细胞(如cho、293细胞等)等中高效表达编码病原微生物保护性抗原基因的一类表达系统；

49、酵母表达系统：是通过dna重组技术，在酵母菌中高效表达编码病原微生物保护性抗原基因的一个表达系统；

50、大肠杆菌表达系统：是通过dna重组技术，在大肠杆菌中高效表达编码病原微生物保护性抗原基因的一个表达系统；

51、昆虫细胞表达系统：是通过dna重组技术，在昆虫细胞中高效表达编码病原微生物保护性抗原基因的一个表达系统；

52、hek293细胞：人胚胎肾细胞293；

53、骨架质粒：包含启动子、终止子、抗性基因等重要信息的质粒；

54、包装细胞：用于病毒扩增或复制的细胞系；

55、缺陷型重组腺病毒：只在特殊细胞系复制的腺病毒；

56、抗原组合：二种及以上抗原的组合；

57、抗原表位复合物：多表位肽的组合；

58、序列1：呼吸道合胞病毒ns1蛋白mhc-ii限制性抗原表位肽

59、序列2：呼吸道合胞病毒ns1蛋白mhc-ii限制性抗原表位肽

60、序列3：呼吸道合胞病毒ns2蛋白mhc-ii限制性抗原表位肽

61、序列4：呼吸道合胞病毒ns2蛋白mhc-ii限制性抗原表位肽

62、序列5：呼吸道合胞病毒n蛋白mhc-ii限制性抗原表位肽

63、序列6：呼吸道合胞病毒n蛋白mhc-ii限制性抗原表位肽

64、序列7：呼吸道合胞病毒p蛋白mhc-ii限制性抗原表位肽

65、序列8：呼吸道合胞病毒p蛋白mhc-ii限制性抗原表位肽

66、序列9：呼吸道合胞病毒p蛋白mhc-ii限制性抗原表位肽

67、序列10：呼吸道合胞病毒m蛋白mhc-ii限制性抗原表位肽

68、序列11：呼吸道合胞病毒m蛋白mhc-ii限制性抗原表位肽

69、序列12：呼吸道合胞病毒sh蛋白mhc-ii限制性抗原表位肽

70、序列13：呼吸道合胞病毒sh蛋白mhc-ii限制性抗原表位肽序列14：呼吸道合胞病g毒ns1蛋白mhc-ii限制性抗原表位肽序列15：呼吸道合胞病g毒ns1蛋白mhc-ii限制性抗原表位肽序列16：呼吸道合胞病g毒ns1蛋白mhc-ii限制性抗原表位肽

71、序列17：呼吸道合胞病毒f蛋白mhc-ii限制性抗原表位肽

72、序列18：呼吸道合胞病毒f蛋白mhc-ii限制性抗原表位肽

73、序列19：呼吸道合胞病毒f蛋白mhc-ii限制性抗原表位肽序列20：呼吸道合胞病毒m2-1蛋白mhc-ii限制性抗原表位肽序列21：呼吸道合胞病毒m2-2蛋白mhc-ii限制性抗原表位肽序列22：呼吸道合胞病毒m2-2蛋白mhc-ii限制性抗原表位肽

74、序列23：呼吸道合胞病毒l蛋白mhc-ii限制性抗原表位肽

75、序列24：呼吸道合胞病毒l蛋白mhc-ii限制性抗原表位肽序列25：优化后呼吸道合胞病毒融合前融合蛋白(pref)氨基酸序列(pref)序列26：呼吸道合胞病毒pref蛋白与呼吸道合胞病毒f蛋白、g蛋白及n蛋白所筛选的8条mhc-ii限制性抗原表位肽进行串联组合而成的氨基酸序列(pref-t1)

76、序列27：呼吸道合胞病毒pref蛋白与呼吸道合胞病毒f蛋白、g蛋白、n蛋白、p蛋白、m蛋白及l蛋白所筛选的15条mhc-ii限制性抗原表位肽进行串联组合而成的氨基酸序列(pref-t3)

77、序列28:呼吸道合胞病毒pref蛋白与呼吸道合胞病毒f蛋白、g蛋白、n蛋白、ns1蛋白、ns2蛋白、m2-1蛋白及m2-2蛋白所筛选的15条mhc-ii限制性抗原表位肽进行串联组合而成的氨基酸序列(pref-t4)

78、序列29：t4噬菌体fibritin蛋白质的结构域foldon的氨基酸序列序列30：呼吸道合胞病毒pref蛋白与呼吸道合胞病毒f蛋白、g蛋白、n蛋白所筛选的8条mhc-ii限制性抗原表位肽及foldon的氨基酸序列串联组合而成的氨基酸序列(pref-t1-foldon)

79、序列31：优化后呼吸道合胞病毒融合前融合蛋白(pref)核苷酸序列(pref)序列32：呼吸道合胞病毒pref蛋白与呼吸道合胞病毒f蛋白、g蛋白及n蛋白所筛选的8条mhc-ii限制性抗原表位肽进行串联组合而成的氨基酸序列翻译后的核苷酸序列(pref-t1)

80、序列33：呼吸道合胞病毒pref蛋白与呼吸道合胞病毒f蛋白、g蛋白、n蛋白、p蛋白、m蛋白及l蛋白所筛选的15条mhc-ii限制性抗原表位肽进行串联组合而成的氨基酸序列翻译后的核苷酸序列(pref-t3)

81、序列34：呼吸道合胞病毒pref蛋白与呼吸道合胞病毒f蛋白、g蛋白、n蛋白、ns1蛋白、ns2蛋白、m2-1蛋白及m2-2蛋白所筛选的15条mhc-ii限制性抗原表位肽进行串联组合而成的氨基酸序列翻译后的核苷酸序列(pref-t4)

82、序列35：呼吸道合胞病毒pref蛋白与呼吸道合胞病毒f蛋白、g蛋白、n蛋白所筛选的8条mhc-ii限制性抗原表位肽及foldon的氨基酸序列串联组合而成的氨基酸序列翻译后的核苷酸序列(pref-t1-foldon)