亚细胞定位的炎症小体活性报告系统及其应用的制作方法

亚细胞定位的炎症小体活性报告系统及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物医药领域，涉及亚细胞定位的融合蛋白及其应用。本系统主要基于分泌型荧光素酶，可从细胞器水平报告炎症小体的活性。本系统中所包括的7种质粒主要通过将细胞器定位基因、白介素1β前体编码基因(pro-IL-1β)和分泌型荧光素酶(DN-Gluc)顺次克隆至表达载体pcDNA3.1的多克隆位点区域而得到。将本系统所包含的各质粒分别转染至靶细胞中，可通过检测细胞外上清液中的荧光素酶活性，对炎症小体的活性进行定量分析，具有高效、快捷和简便等优势，应用于炎症小体相关的药物筛选、分子机制、动物活体研究及相关产品的开发。
【专利说明】亚细胞定位的炎症小体活性报告系统及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医药领域，涉及一种融合蛋白及其编码序列和应用。
【背景技术】
[0002]炎症小体(Inflammasomes)介导机体的抗感染免疫，是先天性免疫的重要组成部分，主要通过Caspase-1加工白介素-1 β (Interleukin-1 β , IL-1 β )和白介素-18前体、产生相应的成熟细胞因子调控炎症反应和细胞死亡(Pyroptosis)。已证实炎症小体参与各种疾病和癌症的发生。目前对炎症小体活性的检测主要依赖于ELISA和Western Blot技术，分别检测成熟型IL-1 β和Caspase-1的剪切情况，操作比较繁琐。又由于相应蛋白分子量较小(成熟型IL-1 β为17Kda，而Caspase-1的P20亚基为20Kda)，且具有较强的细胞外分泌能力，故往往难以得到稳定的结果。各细胞器与炎症小体的联系已有报道，但炎症小体的亚细胞定位与活化的相互关系尚无报道或研究。

【发明内容】

[0003]本发明目的之一在于提供一种可以定位于细胞器并且可以评价细胞器与炎症小体活性关系的融合蛋白。
[0004]本发明目的之二在于提供上述融合蛋白的编码基因。
[0005]本发明目的之三在于提供特定的融合蛋白/基因在制备或构建特定药物激发的炎症小体反应的检测或 报告系统中的应用。
[0006]本发明构建各种细胞器定位的质粒，通过将IL-1 β (pro-1L-l β )与分泌型Gaussia荧光素酶(DN-Gluc)和相应细胞器定位蛋白融合，特异性检测炎症小体激活的Caspase-1对细胞器定位IL-1 β前体的加工，通过分析分泌到细胞外的突光素酶的活性检测细胞器定位的炎症小体活性状态。
[0007]本发明提供了分别于细胞质、线粒体、内质网、早期内体、晚期内体、溶酶体、高尔基体和细胞骨架定位的融合蛋白，分别命名为pro-1L-Ι β -DN-Gluc,Mito-pro-1L-1 β -DN-GlucΛ ER-pro-1L-1 β -DN-Gluc、ΕΕ-pro-1L-l β -DN-Gluc、LE-pro-1L-1β -DN-Gluc、 LYS-pro-1L-1β -DN-Gluc、 GA-pro-1L-1β -DN-Gluc、Actin-pro-1L-1β -DN-Gluc。
[0008]作为一种实施方式，上述融合蛋白的编码基因(如图1所示)分别为:
[0009]pro-1L-Ιβ -DN-Gluc(SEQ ID N0.1)
[0010]Mito-pro-1L-1β -DN-Gluc(SEQ ID N0.2)
[0011 ] ER-pro-1L-1β -DN-Gluc(SEQ ID N0.3)
[0012]EE-pro-1L-1β -DN-Gluc(SEQ ID N0.4)
[0013]LE-pro-1L-1β -DN-Gluc(SEQ ID N0.5)
[0014]LYS-pro-1L-1β -DN-Gluc(SEQ ID N0.6)
[0015]GA-pro-1L-1β -DN-Gluc(SEQ ID N0.7)[0016]Actin-pro-1L-1β -DN-Gluc(SEQ ID N0.8)
[0017]本发明同时提供了融合蛋白的氨基酸序列，分别为:
[0018]pro-1L-Ιβ -DN-Gluc(SEQ ID N0.9)
[0019]Mito-pro-1L-1β -DN-Gluc(SEQ ID N0.10)
[0020]ER-pro-1L-1β -DN-Gluc(SEQ ID N0.11)
[0021 ] EE-pro-1L-1β -DN-Gluc(SEQ ID N0.12)
[0022]LE-pro-1L-1β -DN-Gluc(SEQ ID N0.13)
[0023]LYS-pro-1L-1β -DN-Gluc(SEQ ID N0.14)
[0024]GA-pro-1L-1β -DN-Gluc(SEQ ID N0.15)
[0025]Actin-pro-1L-1β -DN-Gluc(SEQ ID N0.16)
[0026]本发明首次提供了一套结构为细胞器定位蛋白-白介素I β前体-分泌型荧光素酶的融合蛋白，将如SEQ ID N0.2中的Τ0Μ20、SEQ ID N0.3中的EMC3、SEQ ID N0.4中的 VAMP8、SEQ ID N0.5 中的 RAB5、SEQ ID N0.6 中的 LAMP2、SEQ ID N0.7 中的 APOE, SEQ IDN0.8 中的 ACTIN 分别和 SEQ ID N0.2—8 中的 pro-1L-Ι β 及 DN-Gluc 顺次克隆至 pcDNA3.1表达载体的多克隆位点中，得到 Mito-pro-1L-Ι β -DN-Gluc> ER-pro-1L-1 β -DN-Gluc>EE-pro-1L-1β -DN-Gluc, LE-pro-1L-1β -DN-Gluc, LYS-pro-1L-1β -DN-Gluc,GA-pro-1L-1β -DN-Gluc 和 Actin-pro-1L-1β -DN-Gluc?
[0027]pro-1L-1 β (白介素-1 β前体)是Caspase-1的切割对象，当炎症小体激活Caspase-1时，Caspase-1可切割该融合蛋白。
[0028]本发明首次将细胞器定位蛋白(线粒体定位蛋白T0M20、内质网定位蛋白EMC3、早期内体定位蛋白VAMP8、晚期内体定位蛋白RAB5、溶酶体定位蛋白LAMP2、高尔基体定位蛋白APOE和细胞骨架定位蛋白Actin)与全长的IL-1 β (pro-1L-Ι β )、分泌型Gaussia荧光素酶(DN-Gluc)融合。炎症小体未激活Caspase-1时，蛋白游离于胞浆中或定位于各细胞器上；而炎症小体活化后Caspase-1可切割该融合蛋白，产生的IL-1 β -DN-Gluc可分泌到细胞外，从而可通过检测细胞外的荧光素酶活性可对炎症小体(即Caspase-Ι)的活性进行定量分析。
[0029]本发明构建了上述分别定位于各细胞器的质粒系统，将本系统所包括的各质粒分别转染至靶细胞中，可通过检测细胞外上清液中的荧光素酶活性，对炎症小体的活性进行定量分析，具有高效、快捷和简便等优势，应用于炎症小体相关的药物筛选、分子机制和动物活体研究。因而，上述7种与细胞器相关的基因/质粒/融合蛋白，可以被应用与在炎症小体相关的药物筛选、分子机制和动物活体研究领域的应用。
[0030]通过上述的融合蛋白或其编码基因，本发明得以研究各种细胞器在特定的炎症小体相关反应中所起的作用，研究发现细胞器与炎症小体的活化存在密切联系。本发明进一步地研究出用于检测或报告炎症小体活性的具有高特异性和灵敏度的检测/报告蛋白、基因、质粒等。
[0031] 本发明进一步提供了特定融合蛋白/基因的特定应用。
[0032]首先，本发明提供了 ER-pro-1L-Ι β -DN-Gluc在制备TPA相关的炎症小体活性检测试剂/报告系统中的应用。
[0033]发明人通过TPA刺激和转染Caspase-1的方法诱导炎症小体激活，结果表明TPA刺激和转染Caspase-1均可引起融合蛋白切割的增加(图3A和3B)，而内质网更多地参与TPA对炎症小体的激活(图3A和3C)。将ER-pro-1L-Ι β -DN-Gluc蛋白或基因作为对TPA相关炎症小体活性的检测试剂或报告系统，将具有更好的灵敏度和适用性。
[0034]发明还提供了 Mito-pro-1L-Ι β -DN-Gluc在制备Nigericin或MDP相关的炎症小体活性检测试剂/报告系统中的应用。
[0035]为了进一步探索不同激活剂对炎症小体激活过程中是否存在亚细胞定位现象，发明用多种炎症小体激活剂(Nigericin、MDP、HSV)刺激人肿瘤细胞。结果表明Nigericin和MDP对线粒体定位报告系统的激活程度明显更高，而HSV对线粒体定位和内质网定位的报告系统的激活程度相一致(图4)。将Mito-pro-1L-Ι β-DN-Gluc蛋白或基因作为Nigericin和MDP的检测试剂或报告系统，对比其他蛋白或基因将具有更好的灵敏度和适用性。
[0036]与现有技术相比，本发明具有以下有意效果。
[0037]1.目前的研究已表明，炎症小体与感染性疾病、糖尿病、老年痴呆症以及肿瘤密切相关，提示炎症小体在这些疾病的发病、预防和治疗方面具有重要作用。目前对炎症小体活性的检测有多种方法，较多采用的是检测Caspase-1切割、IL-1 β加工和ASC多聚化。但Caspase-1的切割具有动态不稳定性，且底物ρ20可分泌到细胞外，理想的实验结果往往需要大量的重复仅表达于巨噬细胞、树突状细胞和少数粘膜上皮细胞，检测IL-1 β的方法具有很大的局限性；ASC多聚化是炎症小体激活的一个重要标志，然而这一方法同样操作繁琐。虽然不久前Eva等人也建立了一套荧光素酶报告系统，通过裂解细胞检测细胞内荧光素酶活性的方式测量炎症小体活性，但需要裂解细胞和处死实验动物。而本发明构建的荧光素酶DN-Gluc融合蛋白及其相关检测/报告系统，可以简化这一过程，仅需要收集细胞上清或体液检测荧光素酶活性即可。相比而言，我们的系统更具有操作简单、快速和灵敏等优点，非常适合无损伤的连续观察、动物活体研究和大量样品的药物筛选。
[0038]2.本发明首次开发了针对特定炎症小体激活剂相关的炎症小体活性检测试剂/报告系统。对于各个细胞器在炎症小体激活过程中所发挥的作用，目前尚无定论。发明人通过融合细胞器定位蛋白的方法，将报告蛋白特异性定位于细胞器上，包括线粒体、内质网、高尔基体、细胞骨架等，成功构建各细胞器定位的炎症小体活性报告系统。通过该系统，发明人发现TPA和Caspase-1可使线粒体和内质网定位的报告系统产生显著的活性，提示线粒体和内质网参与炎症小体的激活。内质网定位的报告系统对TPA反应性更好(图3D);而Nigericin和MDP则对线粒体定位的报告系统激活效率更高(图4)，与这两种药物引起线粒体损伤有关；HSV感染对两者激活效率均很高，与HSV诱导的内质网应激反应、线粒体损伤和ROS释放有关。这些结果显示不同条件下的炎症小体激活与各细胞器的关联程度不同。这种不同细胞器定位的报告系统揭示出的炎症小体激活差异，可为进一步研究炎症小体在亚细胞水平的聚合、分布和活性提供依据。
[0039] 3.本发明构建的细胞器定位蛋白-pro-1L-Ι β -DN-Gluc报告系统是一种能够简单、快速、高效检测炎症小体活性的方法，并能区分不同细胞器在该过程中的作用，可应用于炎症小体相关的药物筛选、分子机制和动物活体研究。
【专利附图】

【附图说明】[0040]图1显示了本发明的融合蛋白编码基因(炎症小体活性报告系统)图谱㈧无亚细胞定位的报告基因；(B)线粒体定位的报告基因；(C)内质网定位的报告基因；(D)早期内体定位的报告基因；(E)晚期内体定位的报告基因；(F)溶酶体定位的的报告基因；(G)高尔基体定位的报告基因；(H)细胞骨架定位的报告基因。
[0041]图2显示了融合蛋白/基因的定位和表达结果。
[0042]图3显示了不同检测试剂/报告系统检测炎症小体的活性的结果。
[0043]图4显示了不同检测试剂/报告系统用于不同激活剂对鼻咽癌细胞CNE-1中炎症小体的激活作用的检测结果。
【具体实施方式】
[0044]以下【具体实施方式】是对本发明技术方案的进一步阐释，而非限制。
[0045]实施例1
[0046]重组基因的构建方法(亚细胞定位的炎症小体报告基因/质粒的构建方法)
[0047](一 )所述的pro-1L-Ι β -DN-Gluc重组质粒的构建:
[0048](I)DN-Gluc基因的获得:根据DN-Gluc基因的序列设计引物，以Ketteler等人提供的 Actin-DN-Gluc 质粒[KETTELER, R., Z.SUN, et al.A pathway sensor for genome-widescreens of intracellular proteolytic cleavage.Genome B1l, 2008, 9(4):R64.]为模板，利用带有 EcoRI 酶切位点的上游引物(SEQ IDN0.17) 5’_TACGGGAATTCATGCTAGCCAAGCCCAC-3’ 和带有 XhoI 酶切位点的下游引物(SEQ ID N0.18)5’ -TACGCAGATCTAGACATGATAAGATAC-3’进行PCR，扩增获得DN-Gluc ;按PrimerStar2XPCR Mix (宝生物工程，大连)进行PCR反应:PCR总反应体系50 μ L，其中含PrimerStar PCR Μ?χ25 μ L、上下游引物各0.2 μ mol/L、cDNA模板I μ L，超纯水补至50 μ L ;并以不加模板(超纯水)设置阴性对照。反应条件:980C 3min ；98°C 5sec、60°C 15sec、72°C lmin，30 个循环；72°C 5min。琼脂糖凝胶电泳检测后，通过酚氯仿抽提对PCR产物进行纯化，得到DN-Gluc基因。
[0049](2)pro-1L-Ι β基因的获得:根据pro-1L-Ι β基因的序列设计引物，以人类鼻咽癌细胞系CNE-1的总RNA反转录所得的cDNA为模板，利用带有BamHI酶切位点的上游引物(SEQ ID N0.19)5’ -CGGATCCATGGCAGAAGTACCTGAGCT-3’ 和带有 EcoRI 酶切位点的下游引物(SEQ ID N0.20) 5’ -CATGCAATTTGTGTCTTCCGAATTCA-3’ 进行 PCR，扩增获得 pro-1L-lbeta ;按PrimerStar2XPCR Mix (宝生物工程，大连)进行PCR反应:PCR总反应体系50 μ L，其中含PrimerStar PCR Μ?χ25 μ L、上下游引物各 0.2 μ mol/L、cDNA 模板 I μ L,超纯水补至 50 μ L ；并以不加模板(超纯水)设置阴性对照。反应条件:98°C 3min ；98°C 5sec、60°C 15sec、72°C lmin，30个循环；72°C 5min。琼脂糖凝胶电泳检测后，通过酚氯仿抽提对PCR产物进打纯化，得到pro-1L-l β基因。
[0050](3)pro-1L-Ι β -DN-Gluc重组质粒的构建:将真核表达载体pcDNA3.0用BamHI和XhoI酶切，步骤(1)制备的DN-Gluc基因用EcoRI和XhoI酶切，步骤(2)制备的pro-1L-lbeta用BamHI和EcoRI酶切，37°C水浴1min ;酶切产物使用胶回收试剂盒(Omega公司)纯化。双酶切后pcDNA3.0与DN-Gluc和pro-1L-Ι β基因PCR产物进行连接反应，体系为:10XT4bufferlyL、T4DNA酶I μ L、双酶切后的pcDNA3.0载体2 μ L、双酶切后的DN-Gluc基因3 μ L、双酶切后的pro-1L-Ι β基因3yL;混匀后置于16°C过夜；然后进行转化:①将连接产物(5μ?加入100 μ L感受态大肠杆菌TOPlO (天根，北京)中，置冰中30min ?’②42°C热休克90s后，迅速置冰中3min ;③加入LB培养基400 μ L，置干燥恒温振荡箱中37°C 180~200rpm振摇60min ;④菌液用玻璃推铺于LB固体培养基(含卡那霉素30 μ g/mL)上，置37°C孵箱过夜培养；挑选阳性菌落，扩增培养后抽提质粒DNA，用Xho 1、EcoR I和BamHI酶切鉴定，测序鉴定，证实序列正确后扩增阳性克隆并提取质粒，获得pro-1L-Ι β -DN-Gluc重组质粒，_20°C冻存备用。
[0051]( 二 )所述的 Mito-pro-1L-Ι β -DN-Gluc 重组质粒的构建:
[0052](1)T0M20基因的获得:根据T0M20基因的序列设计引物，以人类鼻咽癌细胞系CNE-1的总RNA反转录所得的cDNA为模板，利用带有KpnI酶切位点的上游引物(SEQ ID N0.21) 5’-TGGTACCATGGTGGGTCGGAACAGCG-3’和带有BamHI 酶切位点的下游引物(SEQ ID N0.22)5，-TGGCTGAAGATGATGTGGAAGGATCCATG-3，进行 PCR，扩增获得 T0M20 ；按 PrimerStar2 X PCRMix(宝生物工程，大连)进行PCR反应:PCR总反应体系50 μ L，其中含PrimerStar PCRΜ?χ25 μ L、上下游引物各0.2 μ mol/L、cDNA模板I μ L，超纯水补至50 μ L ;并以不加模板(超纯水)设置阴性对照。反应条件:98°C 3min ；98°C 5sec、60°C 15sec、72°C lmin，30个循环；72°C 5min。琼脂糖凝胶电泳检测后，通过酚氯仿抽提对PCR产物进行纯化，得到T0M20基因。
[0053](2)Mito-pro-1L-Ι β-DN-Gluc重组质粒的构建:将(一)中构建的pro-1L-Ι β -DN-Gluc和步骤(1)中制备的T0M20基因分别用KpnI和BamHI酶切，37°C水浴1min ;酶切产物使用胶回收试剂盒(Omega公司)纯化。双酶切后pro-1L-Ι β -DN-Gluc与T0M20基因PCR产物进行连接反应，体系为:10XT4bufferl μ L、T4DNA酶I μ L、双酶切后的pro-1L-1 β -DN-Gluc载体2 μ L、双酶切后的T0M20基因6 μ L ;混匀后置于16°C过夜；然后进行转化:①将连接产物(5 μ L)加入100 μ L感受态大肠杆菌Τ0Ρ10 (天根，北京)中，置冰中30min ;@42°C热休克90s后，迅速置冰中3min ;③加入LB培养基400 μ L，置干燥恒温振荡箱中37°C 180~200rpm振摇60min ;④菌液用玻璃推铺于LB固体培养基(含卡那霉素30 μ g/mL)上，置37°C孵箱过夜培养；挑选阳性菌落，扩增培养后抽提质粒DNA，用Kpn I和BamHI酶切鉴定，测序鉴定，证实序列正确后扩增阳性克隆并提取质粒，获得Mito-pro-1L-Ι β -DN-Gluc 重组质粒，_20°C冻存备用。
[0054](三)所述的ER-pro-1L-Ιβ -DN-Gluc重组质粒的构建:
[0055](1)EMC3基因的获得:根据EMC3基因的序列设计引物，以人类鼻咽癌细胞系CNE-1的总RNA反转录所得的cDNA为模板，利用带有KpnI酶切位点的上游引物(SEQ ID N0.23)5’ -TGGTACCATGGCAGGGCCAGAACTGTTG-3’ 和带有 BamHI 酶切位点的下游引物(SEQ IDN0.24)5’ -TGGATCCTCAAAAAATAGAGGTCTGTAATT-3’ 进行 PCR，扩增获得 EMC3 ;按 PrimerStar2XPCRMix (宝生物工程，大连)进行PCR反应:PCR总反应体系50 μ L，其中含PrimerStar PCRMix25yL、上下游引物各0.2 μ mol/L、cDNA模板I μ L，超纯水补至50 μ L ;并以不加模板(超纯水)设置阴性对照。反应条件:98°C 3min ；98°C 5sec、60°C 15sec、72°C lmin，30 个循环；72°C 5min。琼脂糖凝胶电泳检测后，通过酚氯仿抽提对PCR产物进行纯化，得到EMC3基因。
[0056](2)ER-pro-1L-1P-DN-Gluc重组质粒的构建:将(一)中构建的pro-1L-Ι β -DN-Gluc和步骤(1)中制备的EMC3基因分别用KpnI和BamHI酶切，37°C水浴1min ;酶切产物使用胶回收试剂盒(Omega公司)纯化。双酶切后pro-1L-Ι β -DN-Gluc与EMC3基因PCR产物进行连接反应，体系为:10XT4bufferl μ L、T4DNA酶I μ L、双酶切后的pro-1L-1 β -DN-Gluc载体2 μ L、双酶切后的EMC3基因6 μ L ;混匀后置于16°C过夜；然后进行转化:①将连接产物(5yL)加入100 μ L感受态大肠杆菌TOPlO (天根，北京)中，置冰中30min ?’②42°C热休克90s后，迅速置冰中3min ;③加入LB培养基400 μ L，置干燥恒温振荡箱中37°C 180~200rpm振摇60min ;④菌液用玻璃推铺于LB固体培养基(含卡那霉素30 μ g/mL)上，置37°C孵箱过夜培养；挑选阳性菌落，扩增培养后抽提质粒DNA，用Kpn I和BamHI酶切鉴定，测序鉴定，证实序列正确后扩增阳性克隆并提取质粒，获得ER-pro-1L-Ι β -DN-Gluc 重组质粒，_20°C冻存备用。 [0057](四)所述的ΕΕ-pro-1L-lβ -DN-Gluc重组质粒的构建:
[0058](I)VAMPS基因的获得:根据VAMP8基因的序列设计引物，以人类鼻咽癌细胞系CNE-1的总RNA反转录所得的cDNA为模板，利用带有KpnI酶切位点的上游引物(SEQ ID Nο.25)5’-AGGGGTACCATGGAGGAAGCCAGTG-3’和带有 BamHI 酶切位点的下游引物(SEQ ID N0.2
6)5，-TCAGAGATCTAGAGAAGGCACCAGTGGC-3，进行 PCR，扩增获得 VAMP8 ；按 PrimerStar2 X PCRMix (宝生物工程，大连)进行PCR反应:PCR总反应体系50 μ L，其中含PrimerStar PCRMix25y L、上下游引物各0.2 μ mol/L、cDNA模板I μ L，超纯水补至50 μ L ;并以不加模板(超纯水)设置阴性对照。反应条件:98°C 3min ；98°C 5sec、60°C 15sec、72°C lmin，30个循环；72°C 5min。琼脂糖凝胶电泳检测后，通过酚氯仿抽提对PCR产物进行纯化，得到VAMP8基因。
[0059](2)EE-pro-1L-1P-DN-Gluc重组质粒的构建:将(一)中构建的pro-1L-Ι β -DN-Gluc和步骤(1)中制备的VAMP8基因分别用KpnI和BamHI酶切，37°C水浴1min ;酶切产物使用胶回收试剂盒(Omega公司)纯化。双酶切后pro-1L-Ι β -DN-Gluc与VAMP8基因PCR产物进行连接反应，体系为:10XT4bufferl μ L、T4DNA酶I μ L、双酶切后的pro-1L-1 β -DN-Gluc载体2 μ L、双酶切后的VAMP8基因6 μ L ;混匀后置于16°C过夜；然后进行转化:①将连接产物(5 μ L)加入100 μ L感受态大肠杆菌Τ0Ρ10 (天根，北京)中，置冰中30min 42°C热休克90s后，迅速置冰中3min ;③加入LB培养基400 μ L，置干燥恒温振荡箱中37°C 180~200rpm振摇60min ;④菌液用玻璃推铺于LB固体培养基(含卡那霉素30 μ g/mL)上，置37°C孵箱过夜培养；挑选阳性菌落，扩增培养后抽提质粒DNA，用Kpn I和BamHI酶切鉴定，测序鉴定，证实序列正确后扩增阳性克隆并提取质粒，获得ΕΕ-pro-1L-l β -DN-Gluc 重组质粒，_20°C冻存备用。
[0060](五)所述的LE-pro-1L-Ιβ -DN-Gluc重组质粒的构建:
[0061](1)RAB5基因的获得:根据RAB5基因的序列设计引物，以人类鼻咽癌细胞系CNE-1的总RNA反转录所得的cDNA为模板，利用带有KpnI酶切位点的上游引物(SEQ ID N0.27)5’-TAGGGGTACCGCCACCATGGCTAGTCGAGG-3’和带有BamHI 酶切位点的下游引物(SEQ ID N0.28)5’ -ATCGGGATCCGTTACTACAACACTGA-3，进行 PCR，扩增获得 RAB5 ；按 PrimerStar2 X PCR Mix (宝生物工程，大连)进行PCR反应:PCR总反应体系50 μ L，其中含PrimerStar PCR Μ?χ25 μ L、上下游引物各0.2 μ mol/L、cDNA模板I μ L,超纯水补至50 μ L ;并以不加模板(超纯水)设置阴性对照。反应条件:98°C3min ;98°C 5sec、60°C 15sec、72°C lmin，30个循环；72°C 5min。琼脂糖凝胶电泳检测后，通过酚氯仿抽提对PCR产物进行纯化，得到RAB5基因。[0062](2) LE-pro-1L-Ιβ-DN-Gluc重组质粒的构建:将(一)中构建的pro-1L-Ι β -DN-Gluc和步骤(1)中制备的RAB5基因分别用KpnI和BamHI酶切，37°C水浴1min ;酶切产物使用胶回收试剂盒(Omega公司)纯化。双酶切后pro-1L-Ι β -DN-Gluc与RAB5基因PCR产物进行连接反应，体系为:10XT4bufferl μ L、T4DNA酶I μ L、双酶切后的pro-1L-Ι β -DN-Gluc载体2 μ L、双酶切后的RAB5基因6 μ L ;混匀后置于16°C过夜；然后进行转化:①将连接产物(5yL)加入100 μ L感受态大肠杆菌TOPlO (天根，北京)中，置冰中30min ;@42°C热休克90s后，迅速置冰中3min ;③加入LB培养基400 μ L，置干燥恒温振荡箱中37°C 180~200rpm振摇60min ;④菌液用玻璃推铺于LB固体培养基(含卡那霉素30μ g/mL)上，置37°C孵箱过夜培养；挑选阳性菌落，扩增培养后抽提质粒DNA，用Kpn I和BamHI酶切鉴定，测序鉴定，证实序列正确后扩增阳性克隆并提取质粒，获得LE-pro-1L-Ι β -DN-Gluc 重组质粒，_20°C冻存备用。
[0063](六)所述的LYS-pro-1L-Ιβ -DN-Gluc重组质粒的构建:
[0064](1)LAMP2基因的获得:根据LAMP2基因的序列设计引物，以人类鼻咽癌细胞系CNE-1的总RNA反转录所得的cDNA为模板，利用带有KpnI酶切位点的上游引物(SEQ ID Nο.29)5’-TAGGGGTACCGCCACCATGGTGTGCTTCCG-3’和带有BamHI 酶切位点的下游引物(SEQ IDN0.30) 5’-CGCGGATCCAAATTGCTCATATCC-3’进行 PCR，扩增获得 LAMP2 ;按 PrimerStar2XPCRMix(宝生物工程，大连)进行PCR反应:PCR总反应体系50 μ L，其中含PrimerStar PCRΜ?χ25 μ L、上下游引物各0.2 μ mol/L、cDNA模板I μ L，超纯水补至50 μ L ;并以不加模板(超纯水)设置阴性对照。反应条件:98°C 3min ；98°C 5sec、60°C 15sec、72°C lmin，30个循环；72°C 5min。琼脂糖凝胶电泳检测后，通过酚氯仿抽提对PCR产物进行纯化，得到LAMP2基因。
[0065](2) LYS-pro-1L-Ιβ-DN-Gluc重组质粒的构建:将(一)中构建的pro-1L-Ι β -DN-Gluc和步骤(1)中制备的LAMP2基因分别用KpnI和BamHI酶切，37°C水浴1min ;酶切产物使用胶回收试剂盒(Omega公司)纯化。双酶切后pro-1L-Ι β -DN-Gluc与LAMP2基因PCR产物进行连接反应，体系为:10XT4bufferl μ L、T4DNA酶I μ L、双酶切后的pro-1L-Ι β -DN-Gluc载体2 μ L、双酶切后的LAMP2基因6 μ L ;混匀后置于16°C过夜；然后进行转化:①将连接产物(5 μ L)加入100 μ L感受态大肠杆菌Τ0Ρ10 (天根，北京)中，置冰中30min ?’②42°C热休克90s后，迅速置冰中3min ;③加入LB培养基400 μ L，置干燥恒温振荡箱中37°C 180~200rpm振摇60min ;④菌液用玻璃推铺于LB固体培养基(含卡那霉素30 μ g/mL)上，置37°C孵箱过夜培养；挑选阳性菌落，扩增培养后抽提质粒DNA，用Kpn I和BamHI酶切鉴定，测序鉴定，证实序列正确后扩增阳性克隆并提取质粒，获得LYS-pro-1L-Ι β -DN-Gluc 重组质粒，_20°C冻存备用。
[0066](七)所述的GA-pro-1L-Ιβ -DN-Gluc重组质粒的构建:
[0067] (1)APOE基因的获得:根据APOE基因的序列设计引物，以人类鼻咽癌细胞系CNE-1的总RNA反转录所得的cDNA为模板，利用带有KpnI酶切位点的上游引物(SEQ ID N0.31)5’-ATGGGGTACCATGAAGGTTCTGTGGG-3’和带有 BamHI 酶切位点的下游引物(SEQ ID N0.32)5’-ACGGGATCCGTGATTGTCGCTG-3’ 进行 PCR，扩增获得 APOE ;按 PrimerStar2XPCR Mix (宝生物工程，大连)进行PCR反应:PCR总反应体系50 μ L，其中含PrimerStar PCR Mix25 μ L、上下游引物各0.2 μ mol/L、cDNA模板I μ L,超纯水补至50 μ L ;并以不加模板(超纯水)设置阴性对照。反应条件:98°C 3min ；98°C 5sec、60°C 15sec、72°C lmin，30 个循环；72°C 5min。琼脂糖凝胶电泳检测后，通过酚氯仿抽提对PCR产物进行纯化，得到APOE基因。
[0068](2)GA-pro-1L-1P-DN-Gluc重组质粒的构建:将(一)中构建的pro-1L-Ι β -DN-Gluc和步骤(1)中制备的APOE基因分别用KpnI和BamHI酶切，37°C水浴1min ;酶切产物使用胶回收试剂盒(Omega公司)纯化。双酶切后pro-1L-Ι β -DN-Gluc与APOE基因PCR产物进行连接反应，体系为:10XT4bufferl μ L、T4DNA酶I μ L、双酶切后的pro-1L-Ι β -DN-Gluc载体2 μ L、双酶切后的APOE基因6 μ L ;混匀后置于16°C过夜；然后进行转化:①将连接产物(5yL)加入100 μ L感受态大肠杆菌TOPlO (天根，北京)中，置冰中30min ;@42°C热休克90s后，迅速置冰中3min ;③加入LB培养基400 μ L，置干燥恒温振荡箱中37°C 180~200rpm振摇60min ;④菌液用玻璃推铺于LB固体培养基(含卡那霉素30 μ g/mL)上，置37°C孵箱过夜培养；挑选阳性菌落，扩增培养后抽提质粒DNA，用Kpn I和BamHI酶切鉴定，测序鉴定，证实序列正确后扩增阳性克隆并提取质粒，获得GA-pro-1L-Ι β -DN-Gluc 重组质粒，_20°C冻存备用。
[0069](八)所述的Actin-pro-1L-lβ -DN-Gluc重组质粒的构建:
[0070](I)Actin基因的获得:根据Actin基因的序列设计引物，以人类鼻咽癌细胞系CNE-1的总RNA反转录所得的cDNA为模板，利用带有HindIII酶切位点的上游引物(SEQ ID N0.33) 5’ -CCCAAGCTTATGGATGATGATATCGCCG-3’ 和带有 BamHI 酶切位点的下游引物(SEQ ID N0.34)5’ -ACGGGATCCGAAGCATTTGCGGTGGA-3’ 进行 PCR，扩增获得 Actin ;按PrimerStar2XPCR Mix (宝生物工程，大连)进行PCR反应:PCR总反应体系50 μ L，其中含PrimerStar PCR Μ?χ25 μ L、上下游引物各 0.2 μ mol/L、cDNA 模板 I μ L,超纯水补至 50 μ L ；并以不加模板(超纯水)设置阴性对照。反应条件:98°C 3min ；98°C 5sec、60°C 15sec、72°C lmin，30个循环；72°C 5min。琼脂糖凝胶电泳检测后，通过酚氯仿抽提对PCR产物进行纯化，得到Actin基因。
[0071](2) Actin-pro-1L-l β-DN-Gluc重组质粒的构建:将(一)中构建的pro-1L-Ι β -DN-Gluc和步骤(1)中制备的Actin基因分别用KpnI和BamHI酶切，37°C水浴1min ;酶切产物使用胶回收试剂盒(Omega公司)纯化。双酶切后pro-1L-Ι β -DN-Gluc与Actin基因PCR产物进行连接反应，体系为:10XT4bufferlyL、T4DNA酶I μ L、双酶切后的pro-1L-Ι β -DN-Gluc载体2 μ L、双酶切后的Actin基因6 μ L ;混匀后置于16°C过夜；然后进行转化:①将连接产物(5 μ L)加入100 μ L感受态大肠杆菌Τ0Ρ10 (天根，北京)中，置冰中30min ;@42°C热休克90s后，迅速置冰中3min ;③加入LB培养基400 μ L，置干燥恒温振荡箱中37 °C 180~200rpm振摇60min ;④菌液用玻璃推铺于LB固体培养基(含卡那霉素30 μ g/mL)上，置37°C孵箱过夜培养；挑选阳性菌落，扩增培养后抽提质粒DNA，用Kpn I和BamHI酶切鉴定，测序鉴定，证实序列正确后扩增阳性克隆并提取质粒，获得Actin-pro-1L-l β -DN-Gluc 重组质粒，_20°C冻存备用。
[0072]实施例2
[0073]融合蛋白的表达及定位检测
[0074 ](一)质粒转染:分别接种293T至铺有细胞爬片的12孔板中，密度为4X105/cm2。24小时后，每孔转染0.8 μ g质粒，转染试剂为Lipofectamine2000 (invitrogene公司)。24小时后，收细胞分别进行免疫突光染色和Western Blot。[0075]( 二)免疫荧光染色和激光共聚焦显微镜观察:线粒体染色组加入MitoTracker，继续培养2h。PBS洗两遍；加入固定液，室温孵育1min ;PBS洗两遍；加入穿孔液，室温孵育1min ;加入封闭液，室温孵育Ih ；PBS洗两遍；一抗按照说明书所述的滴度溶于相应溶液(V/V为0.1 % BSA的PBS溶液)，室温孵育Ih ；PBS洗3遍；二抗按照说明书所述的滴度和溶解方式，溶于相应溶液(V/V为0.1 % BSA的PBS溶液)，室温孵育Ih ；PBS洗3遍；Hoechst按照说明书所述的滴度和溶解方式，溶于相应溶液(V/V为0.1 % BSA的PBS溶液)，室温孵育1min ;PBS洗4遍，并用去离子水漂洗I遍，封片。待晾干后即使用激光共聚焦显微镜观察。结果表明Mito-pro-1L-1 β -DN-Gluc与Mitotracker共定位于线粒体，而 ER-pro-1L-Ι β -DN-Gluc 与 PDI 定位于内质网(图 2Α-Η)。
[0076](三)WesternBlot:细胞弃去上清，PBS洗去残留培养基，按照每1*106细胞使用50ul加入RIPA裂解液，用细胞刮刮下；4度裂解30min ;在4度20000g离心10min，取上清；参照Thermo BCA蛋白定量试剂盒说明对蛋白浓度进打定量；向每管蛋白样品中加入1/3体积的4*Loading Buffer ;每孔上样30~40ug总蛋白，80V电泳30min压缩蛋白，120V电泳60min ;切下含有目的片段的胶，进行转膜，从正极到负极依次为塑料纤维层，滤纸，胶，NC膜(或PVDF膜)，滤纸，塑料纤维层，外侧用夹子固定，200mA恒流转膜2h ;使用1ml封闭液(含V/V为5%脱脂牛奶的TBS)，室温封闭1-2h ;将一抗(Ant1-1L-Ι β和Ant1-β-Actin)按照说明书所述的滴度和溶解方式，溶于相应溶液(V/V为5%脱脂牛奶的TBST溶液)，4度孵育过夜；用TBST洗膜3~5遍；将二抗按照说明书所述的滴度和溶解方式，溶于相应溶液(V/V为5%脱脂牛奶的TBST溶液)，室温孵育I~2h ;用TBST洗膜3~5遍；使用Odyssey双色红外成像仪进行成像。证实3种蛋白都可高效表达(图21)。
[0077]实施例3
[0078]不同检测试 剂/报告系统对TPA刺激和转染Caspase-1的方法诱导的炎症小体激活的反应
[0079](一)质粒转染:分别接种293T至12孔板中，密度为4X1Vcm2。24小时后，每孔转染0.4 μ g报告质粒及pCMV-3myc-Caspase_120ng,对照组共转染pCMV_3myc20ng,转染试剂为Lipofectamine2000 (invitrogene公司)。30小时后，收集细胞上清检测突光素酶活性，收细胞进行Western Blot。
[0080]( 二 )细胞刺激:转染24小时后，弃去细胞培养液换为新鲜的DMEM(无血清，含100ng/mL TPA)，对照组换液为无TPA和无血清的新鲜DMEM。
[0081](三)WesternBlot同实施例2。结果表明TPA和转染Caspase-Ι均可引起融合蛋白切割的增加(图3A和3B)。
[0082](四)荧光检测:取细胞上清液，在4°C12000rpm离心5min去除细胞碎片；在不透光384孔板中每孔加入1uL上清液，30ul Renilla突光工作液(Promega),通过Berthlod化学发光仪检测荧光读数。检测对应上清液中的荧光素酶活性，获得与Western Blot—致的结果(图3C和3D)。
[0083]结果表明TPA刺激和转染Caspase-1均可引起融合蛋白切割的增加(图3A和3B)。检测对应上清液中的荧光素酶活性，获得与Western Blot 一致的结果(图3C和3D)，差异有统计学意义(C，F = 463.69，P〈0.01 ;D，F = 161.56，Ρ〈0.01)。并且发现TPA处理时内质网定位的报告系统表现出更明显的激活作用(图3Α和3C)，显示出内质网更多地参与TPA对炎症小体的激活。
[0084]实施例4
[0085]不同检测试剂/报告系统对多种炎症小体激活剂刺激肿瘤细胞的反应
[0086](一 )质粒转染:分别接种CNE-1至12孔板中，密度为4X 105/cm2。24小时后，每孔转染0.4 μ g报告质粒,转染试剂为Lipofectamine2000 (invitrogene公司)。30小时后，收集细胞上清检测荧光素酶活性。
[0087](二)细胞刺激:转染24小时后，弃去细胞培养液换为新鲜的DMEM(无血清，含5 μ M的Nigericin、10 μ g/mL的MDP或MOI = I的HSV-1)，对照组换液为无TPA和无血清的新鲜DMHM。
[0088](三)荧光检测:取细胞上清液，在4°C12000rpm离心5min去除细胞碎片；在不透光384孔板中每孔加入1uL上清液，30ul Renilla突光工作液(Promega),通过Berthlod化学发光仪检测荧光读数。 [0089]结果表明Nigericin、MDP和HSV-1 (人类单纯性疱疹病毒)均可激活三种不同定位的炎症小体报告系统。以细胞质分布的PlL-1 β -DNGluc作为参照，Nigericin和MDP对线粒体定位报告系统的激活程度明显更高，而HSV对线粒体定位和内质网定位的报告系统的激活程度相同(图4)。
【权利要求】
1.一种重组基因，其特征在于核苷酸序列选自SEQ ID N0.2~SEQ ID N0.8。
2.一种融合蛋白，其特征在于氨基酸序列选自SEQ ID N0.10~SEQ ID N0.16。
3.如权利要求1所述的基因在制备检测或报告炎症小体活性的试剂方面的应用。
4.如权利要求2所述的蛋白在制备检测或报告炎症小体活性的试剂方面的应用。
5.内质网定位蛋白-白介素-1β前体-分泌型Gaussia突光素酶的编码基因或如SEQID N0.3所示的基因在制备TPA相关的炎症小体活性检测试剂/报告系统中的应用。
6.内质网定位蛋白-白介素-1β前体-分泌型Gaussia突光素酶融合蛋白或如SEQID N0.11所示的蛋白在制备TPA相关的炎症小体活性检测试剂/报告系统中的应用。
7.线粒体定位蛋白-白介素-1β前体-分泌型Gaussia突光素酶的编码基因或如SEQID N0.2所示的基因在制备Nigericin或MDP相关的炎症小体活性检测试剂/报告系统中的应用。
8.线粒体定位蛋白-白介素-1β前体-分泌型Gaussia荧光素酶融合蛋白或如SEQID N0.10所示的蛋白在制备Nigericin或MDP相关的炎症小体活性检测试剂/报告系统中的应用。
9.内质网定位蛋白-白介素-1β前体-分泌型Gaussia荧光素酶或线粒体定位蛋白-白介素_1β前体-分 泌型Gaussia荧光素酶的编码基因或融合蛋白在制备HSV相关的炎症小体活性检测试剂/报告系统中的应用。
10.SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.11、SEQ ID N0.2 或 SEQ ID N0.10 所示的序列在制备 HSV 相关的炎症小体活性检测试剂/报告系统中的应用。
【文档编号】C12Q1/37GK104017818SQ201410290959
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年6月24日 优先权日:2014年6月24日
【发明者】况二胜, 李宇清 申请人:中山大学