一种快速鉴别1型和3型鸭甲肝病毒的双重荧光定量方法
【专利摘要】本发明提供了一种检测1型和3型鸭甲肝病毒的双重荧光定量RT-PCR特异性引物，是对GenBank上已发表的DHAV-1、DHAV-3的序列进行比对，在两种病毒基因序列的保守但相互之间差异又较大的区域，分别设计一对针对DHAV-1的特异性检测引物SEQ1、SEQ2，一条Taqman探针Probe1；一对针对DHAV-3的特异性检测引物SEQ3、SEQ4，一条Taqman探针Probe2；确定了针对DHAV-1和DHAV-3的双重荧光定量RT-PCR的特异性引物及Taqman探针浓度；利用该组引物建立的双重荧光定量RT-PCR检测方法，特异性好、灵敏度高，可以用于1型和3型鸭甲肝病毒的快速血清型鉴定和实时定量分析。
【专利说明】-种快速鉴别1型和3型鸭甲肝病毒的双重荧光定量方法 (一）
【技术领域】
[0001] 本发明所涉及一种快速鉴别1型鸭甲肝病毒和3型鸭甲肝病毒混合感染的双重荧 光定量RT-PCR方法，属于病毒分子生物学领域。 (二）
【背景技术】
[0002] 鸭肝炎病毒包括鸭甲肝病毒（Duck hepatitis A virus, DHAV)、鸭星状病毒（Duck astrovirus，DAstV)l型（DAstV-1)和2型（DAstV_2)3个不同的血清型，相互之间无抗原交 叉性。DHAV作为小RNA病毒科禽肝病毒属的唯一成员，目前又分为三个基因型和血清型 ： DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3,三个血清型之间几乎无交叉保护，我国主要流行的是DHAV-1和 DHAV-3。近年来，DHAV-1和DHAV-3混合感染情况日益严重，导致许多地区针对某型鸭病毒 性肝炎采取主动或被动免疫后仍不能有效控制鸭病毒性肝炎的发生和流行，给养鸭业生产 造成严重的经济损失。
[0003] 目前鸭病毒性肝炎的鉴定主要依靠流行病学调查、临床症状和病理变化，但不同 鸭肝炎病毒引起的鸭病毒性肝炎在流行病学、临床症状和病理变化方面极为相似，特别是 两种或多种病毒混合感染时，依靠上述方法和手段难以确定病毒类型。有效控制鸭病毒性 肝炎的前提是要明确鸭肝炎病毒的血清型并确定其在体内的分布和含量，因此，加强鸭病 毒性肝炎病毒不同血清型鉴定和定量技术的研究对预防和控制鸭病毒性肝炎具有重要的 现实意义。传统的病毒血清型鉴定需要分离培养获得纯化的病毒，通过单因子血清进行鉴 定，这种方法费事费力，且无法对病毒进行定量分析，对于双重感染难以进行鉴定。荧光 定量PCR方法在以其快速、精确、高灵敏度、特异的优点，已在多种病毒的鉴定与检测中得 到了广泛应用，与常规RT-PCR技术相比，该方法不仅可以对病毒基因型进行鉴定，还可对 病毒在体内的分布进行精确定量。PCR方法鉴定的基础是依据病原的基因型来进行的，目 前的研究表明，不同鸭病毒性肝炎病毒的基因型与血清型相对应，因此可以通过基因型的 检测来完成对鸭肝炎病毒血清型的鉴定。目前我国鸭群中1型鸭甲肝病毒DHAV-1 (Duck hepatitis A virus typel, DHAV-l)，3 型鸭甲肝病毒 DHAV_3(Duck hepatitis A virus type3, DHAV-3)的单重及混合感染现象非常普遍，这给实际生产中的防治带来了极大不便， 而且对二者混合感染后在鸭体内的含量及动态分布尚未见报道。 (三）
【发明内容】
[0004] 为了解决上述问题，本发明提供了一种快速鉴定1型和3型鸭甲肝病毒的双重荧 光定量RT-PCR方法，主要是设计并筛选了新的特异性引物和探针，优化了反应过程中的各 种参数，确定了针对DHAV-1和DHAV-3的双重荧光定量RT-PCR的特异性引物及Taqman探 针浓度，能够快速准确地进行DHAV-1和DHAV-3的血清型鉴定和定量分析。
[0005] -种检测1型和3型鸭甲肝病毒的双重荧光定量RT-PCR特异性引物，是对 GenBank上已发表的DHAV-1、DHAV-3的序列进行比对，在两种病毒基因序列的保守但相互 之间差异又较大的区域，分别设计一对针对DHAV-1的特异性检测引物SEQ1、SEQ2, 一条 Taqman探针Probel ; -对针对DHAV-3的特异性检测引物SEQ3、SEQ4, 一条Taqman探针 Probe2,引物序列如下：
[0006] SEQ1 :5, -AGACACATGTTGCTGAAAAACT-3，，
[0007] SEQ2 :5' -AGAACCAGTTGTCGTTTGGTC-3'，
[0008] SEQ3 :5 ' -CTTGAACGTAATAGAGCTTGG-3 '，
[0009] SEQ4 :5 ' -AAAGTCTTTTGGTAGAGTCTTAGC-3，，
[0010] SEQ5 :Probel:5' CY5-ATGCCATGACACTATCTCATATGAGTCAGC-3' BHQ2，
[0011] SEQ6: Probe2 :5，FAM-ACACTTGGCACCATTGTGTCCCTCATAAC-3，TAMRA，
[0012] 所有引物以无菌ddH20(Rnase free)配成lOpmol/μ 1的浓度备用。
[0013] 上述引物、探针的使用方法为：
[0014] A、常规方法提取待测鸭肝组织总RNA作为模板，进行反转录反应。反应体系为：模 板 RNA4 μ 1，SEQ2/SEQ4 引物各 0· 5 μ 1，5XM-MLV Buffer2 μ 1，dNTPs (10. OmM) 2 μ 1，Rnase InhibitionO. 25μ 1，RTase M-MLV(5U/y 1)0. 5μ 1，ddH20(Rnase free)0. 75μ 1。反应程序 为：42°C反应 50min，70°C 15min，获得病毒 cDNA。
[0015] B、以病毒cDNA为模板进行荧光定量RT-PCR反应。反应体系为：3. 45yL ddH20(Rnase free)，12. 5μ L Premix Ex Taq，SEQ1、SEQ2、SEQ3 和 SEQ4 各 1 μ 1，R0X Reference Dye ΙΙ0· 25 μ 1，ProbelO. 5 μ 1 和 Probe20. 3 μ 1，2 μ 1 cDNA 模板。
[0016] PCR 反应条件为：95°C 5min ;95°C 15s，60°C 45s，40 个循环；于 60°C时收集荧光。
[0017] C、用标准曲线计算出测得Ct值所对应的样品浓度：反应最终输出的Ct值可用标 准曲线换算出对应的样品浓度，纵坐标为所得Ct值，横坐标为样品浓度的对数值。（见图 1)。
[0018] 利用本发明设计的特异性引物及探针进行双重实时荧光定量RT-PCR检测DHAV-1 和DHAV-3,最低可检测到7拷贝/ μ 1的DHAV-lcDNA和11拷贝/ μ 1的DHAV-3cDNA，表明 本方法具有很高的灵敏性。
[0019] 用本发明建立的双重荧光定量RT-PCR方法对山东、河南、四川、广东四个省12个 鸭场送检的50只病死雏鸭的肝组织中分离到DHAV-1、DHAV-3进行检测，结果发现所有样 品的检测结果与常规RT-PCR的检测结果符合率为100%，说明本发明建立的双重荧光定量 RT-PCR方法适合于1型和3型鸭甲肝病毒的血清型鉴定。本方法可以通过一次荧光定量 RT-PCR在同一反应体系中完成对DHAV-1和DHAV-3的血清型鉴定和定量，因此可用于快速 鉴定鸭甲肝病毒的血清型并对其进行定量检测。 (四）【专利附图】
【附图说明】
[0020] 图1双重荧光定量RT-PCR的标准曲线
[0021] 纵坐标（Ct值）代表PCR循环数；横坐标（2-7)，分别为102?10 7拷贝的标准品 模板。反应最终所输出的Ct值可用标准曲线换算出相应的模板浓度。
[0022] 图2双重荧光定量RT-PCR针对DHAV-1和DHAV-3的扩增结果
[0023] 纵坐标（Delta Rn)代表荧光强度；横坐标（1-40)，分别为1?40个PCR循环数。 该图显示了双重荧光定量RT-PCR的扩增曲线，曲线与横坐标交点即为Ct值，Ct值是指在荧 光PCR扩增过程中，当扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。在 荧光信号指数扩增起始阶段（即荧光信号达到阈值之前），PCR产物量的对数值与起始模板 量之间存在线性关系，可以选择在这个阶段绘制标准曲线进行定量分析。
[0024] 图3双重荧光定量RT-PCR针对DHAV-1和DHAV-3扩增的重复性检测结果
[0025] 纵坐标（Delta Rn)代表荧光强度；横坐标（1-40)分别为1?40个循环数。该图 显示该双重荧光定量RT-PCR方法重复性良好。 (五）【具体实施方式】
[0026] 1引物设计
[0027] 本发明通过对参考GenBank上已发表的DHAV-1、DHAV-3的序列进行比对，选择在 这两种病毒基因序列的保守区，分别设计一条针对DHAV-1的Taqman探针Probel、一对针对 DHAV-1的特异性检测引物SEQ1/SEQ2 ;-条针对DHAV-3的Taqman探针Probe2、一对针对 DHAV-3的特异性检测引物SEQ3/SEQ4。为了对建立的3双重荧光定量RT-PCR方法进行灵 敏度测定，分别设计了一对DHAV-1的标准品引物SEQ5、SEQ6 (用以制备DHAV-1核酸模板标 准品以检测建立方法的灵敏度）和一对DHAV-3的标准品引物SEQ7、SEQ8 (用以制备DHAV-3 核酸模板标准品以检测建立方法的灵敏度）。
[0028] SEQ1 :5，-AGACACATGTTGCTGAAAAACT-3，，
[0029] SEQ2 :5, -AGAACCAGTTGTCGTTTGGTC-3，，
[0030] SEQ3 :5，-CTTGAACGTAATAGAGCTTGG-3，，
[0031] SEQ4 :5 ' -AAAGTCTTTTGGTAGAGTCTTAGC-3，，
[0032] SEQ5 :5，-AGACACATGTTGCTGAAAACT-3，，
[0033] SEQ6 :5' -CCTCTTCAAGAATTTGGGCACT-3，，
[0034] SEQ7 :5，-ACTTGTAGATGAGATC-3，，
[0035] SEQ8 :5, -CATACTTGCCACCAACTGCCA-3，，
[0036] SEQ9 :Probel:5' CY5-ATGCCATGACACTATCTCATATGAGTCAGC-3' BHQ2，
[0037] SEQ10 :Probe2 :5, FAM-ACACTTGGCACCATTGTGTCCCTCATAAC-3, TAMRA，
[0038] DHAV-1检测引物扩增片段位于DHAV-1基因组的6241?6391bp，大小为112bp， 标准品引物扩增片段位于6241?6732bp，大小为492bp。DHAV-3检测引物扩增片段位于 DHAV-3基因组的5303?5449bp，大小为147bp，标准品引物扩增片段位于5058?5600bp， 大小为542bp。所有引物以无菌ddH 20(Rnase free)配成lOpmol/μ 1的浓度备用。
[0039] 2标准品的制备
[0040] 取实验室所保存DHAV-1和DHAV-3鸭胚尿囊液，并分别对其提取DHAV-1和 DHAV-3基因组RNA,用DHAV-1和DHAV-3的检测引物SEQ6、SEQ8分别对提取的DHAV-1RNA 和DHAV-3RNA做RT-PCR反应，反应体系为：模板RNA4 μ 1，SEQ6/SEQ8引物各0. 5 μ 1， 5XM-MLV Buffer2y 1, dNTPs(10. OmM) 2 μ 1, Rnase InhibitionO. 25 μ M, RTase M-MLV(5U/ μ 1)0. 5μ 1，ddH20(Rnase free)0. 75μ 1。反转录条件：42°C 60min，72°C 15min，4°C保存； 以上述产物cDNA为模板，分别使用DHAV-1标准品引物SEQ5、SEQ6和DHAV-3标准品引物 SEQ7、SEQ8对DHAV-1和DHAV-3的目的基因进行PCR扩增，DHAV-1的PCR反应体系为： ddH2016. 3μ 1，2· 5μ llOXTaq PCR Buffer(With Mg2.)，2μ 12. 5mM dNTP，1 μ 1 SEQ5 弓| 物， 1 μ 1SEQ6 引物，2 μ 1 DHAV-lcDNA模板，0· 2 μ 1 Taq DNA Polymerase (5U/ μ 1) ;DHAV-3 的PCR 反应体系为：ddH2016. 3μ 1，2· 5μ llOXTaq PCR Buffer(With Mg2+)，2μ 12. 5mM dNTP，1 μ 1L SEQ7 引物，1 μ 1 SEQ8 引物，2μ 1 DHAV-3cDNA 模板，0· 2μ 1 Taq DNA Polymerase(5U/y 1)。 PCR扩增条件均为：94°C预变性5min ;94°C变性30s，55°C退火45s，72°C延伸45s，30个循 环；72°C延伸lOmin，4°C保存。分别将PCR所得产物连接至pMD18-T构建重组质粒，对重组 质粒用EcoR I单酶切线性化后进行回收纯化并测定其含量，得到含有DHAV-1和DHAV-3目 的基因片段的线性化质粒作为检测标准品用于标准曲线的制作和灵敏度、重复性评价。
[0041] 3双重荧光定量RT-PCR条件的优化
[0042] 对引物、dNTPs、Buffer的浓度，及退火温度等参数进行优化，得到多重RT-PCR最 佳反应体系和反应程序。
[0043] (1)分别将含有DHAV-1和DHAV-3目的基因片段的线性化质粒作为检测标准品进 行十倍梯度稀释（1〇 7?1〇2拷贝/ μ 1)，以各个梯度标准品作为模板进行荧光定量RT-PCR 反应。最终优化的反应体系为：3·45μ 1 ddH20(Rnase free)，12.5y 1 Premix Ex Taq， SEQ1、SEQ2、SEQ3 和 SEQ4各 1μ 1，ROXReferenceDye ΙΙ0·25μ 1，Probel(SEQ9)0.5y 1 和 Probe2 (SEQ10) 0· 3 μ 1，2 μ 1 标准品模板。
[0044] 优化的PCR反应条件为：95°C 5min ;95°C 15s，60°C 458,40个循环；于601：时收集 荧光（见图2)。结果显示，1型鸭甲肝病毒标准曲线为y = -3. 2850x+40. 812,相关系数为 0· 9985,循环效率为101. 5 % ;3型鸭甲肝病毒标准曲线为y = -3. 2791+39. 216,相关系数 为0· 9994,循环效率为10L 8%。
[0045] 4特异性试验
[0046] 以1型鸭甲肝病毒强毒株（DHAV-1LY0801株）、3型鸭甲肝病毒毒株 (DHAV-3SD1201株）、1型鸭星状病毒1 (DAstV-Ι)、鸭疫里默杆菌（RA)，鸭源致病性大肠杆菌 (Escherichia coli，046)、鸭瘟病毒（DPV)、新城疫病毒（NDV)、禽流感病毒H9N2(H9N2AIV)、 禽网状内皮增殖症病毒（REV)、正常鸭胚胚体和正常鸭胚尿囊液样本进行检测，并分别以 本实验室分离鉴定的10株DHAV-1阳性和10株DHAV-3阳性样本（分离方法参照已公开 文献《鸭甲肝病毒3型山东分离株的分离鉴定及VP1基因的序列分析》）为阳性对照，正 常鸭胚尿囊液样本为阴性对照，按常规方法提取病毒基因组RNA模板（DHAV-1、DHAV-3、 DAstV-l、NDV、H9N2AIV、REV)并进行反转录反应，反应体系为：模板RNA4y 1，SEQ2/SEQ4引 物各 〇· 5μ l，5XM-MLVBuffer2y l，dNTPs(10. 0πιΜ)2μ l，Rnase Inhibition。· 25μ l，RTase M-MLV(5U/y 1)0. 5μ l，ddH20(Rnase free)0. 75μ 1。反转录条件：42°C 60min，72°C 15min， 4°C保存；用步骤3)所述的体系及条件进行双重荧光定量RT-PCR反应，同时用健康鸭肝提 取的RNA做阴性对照进行特异性试验。用常规方法提取RA、大肠杆菌046、DPV的基因组DNA 直接用步骤3)所述体系及条件进行双重荧光定量PCR反应，用健康鸭肝提取的RNA反转录 后所得的cDNA做阴性对照。结果显示，建立的双重荧光定量RT-PCR方法只能针对DHAV-1 和DHAV-3进行特异性扩增，对其他家禽常发病的病原扩增为阴性，说明本发明可作为特异 性鉴定DHAV-1和DHAV-3的方法。
[0047] 5敏感性试验
[0048] 以含有DHAV-1和DHAV-3目的基因片段的线性化质粒作为检测标准品对单重和双 重荧光定量RT-PCR检测灵敏度进行测定。用紫外分光光度计对DHAV-1和DHAV-3标准品 进行0D值的测定，计算出纯度和含量，将模板10倍梯度稀释，取每个稀释度的模板分别进 行单重和双重荧光定量RT-PCR反应。结果显示，该双重荧光定量RT-PCR方法最低可分别 检测到7拷贝/ μ 1和11拷贝/ μ 1的模板DNA，与单重荧光定量RT-PCR方法的检测灵敏度 一致。
[0049] 6重复性试验
[0050] 为评价建立的双重荧光定量RT-PCR方法的可重复性，将已知浓度的标准品阳性 模板用RNase-Free Water进行连续10倍梯度稀释（107?102拷贝/ μ 1)，取不同梯度样本 的RNA在同一次扩增中进行3次重复测定，计算出DHAV-1和DHAV-3的组内变异系数分别 为0· 28%?1. 24%和0· 28%?1. 81 %，组间变异系数分别为0· 29%?2. 23%和0· 22%? 1.43% (见图 3)。
[0051] 7临床样本检测
[0052] 用建立的双重荧光定量RT-PCR方法对10份人工感染样本的检测结果发现所有样 品的检测结果与普通RT-PCR的检测结果阳性率均为100%，用建立的双重荧光定量RT-PCR 方法对山东、河南、四川、广东四个省12个鸭场送检的50只病死雏鸭的肝组织中分离到 DHAV-UDHAV-3进行检测，本发明的荧光定量RT-PCR检出DHAV-1和DHAV-3阳性样本分别 为46份和34份，而普通RT-PCR的分别检出38和25份，说明本发明建立的双重荧光定量 RT-PCR方法更适合于DHAV-1和DHAV-3的临床检测和血清型鉴定，且该方法的灵敏度要高 于普通RT-PCR。
[0053] 本发明的优点
[0054] 本发明针对我国1型鸭甲肝病毒和3型鸭甲肝病毒混合感染日益严重的现状，根 据荧光定量RT-PCR技术原理和鸭病毒性肝炎病毒基因型与血清型相对应的特点，针对1型 和3型鸭甲肝病毒设计了特异性引物和Taqman探针，建立了快速鉴别1型和3型鸭甲肝病 毒的双重荧光定量RT-PCR检测方法，该方法精确、快速、特异性好、灵敏度高，可以用于临 床样品中鸭甲肝病毒的快速血清型鉴定及实时定量分析。
[0001] <110〉山东农业大学 <120>-种快速鉴别1型和3型鸭甲肝病毒的双重荧光定量方法 <160>6 <210>1 <211>22 <212>DNA <213>人工序列 <220> <400>1 agacacatgt tgctgaaaaa ct 22 <210>2 <211>21 <212>DNA <213>人工序列 <220> <400>2 agaaccagt t gtcgtttggt c 21 <210>3 <211>21 <212>DNA <213〉人工序列 <220〉 <400>3 cttgaacgta atagagcttg g 21 <210>4 <211>24 <212>DNA <213>人工序列 <220〉 <400>4 aaagtctttt ggtagagtct tagc 24
[0002] <210>5 <211>21 <212>DNA <213>人工序列 <220> <400>5 agacacatgt tgctgaaaac t 21 <210>6 <211>22 <212>DNA <213>人工序列 <220> <400>6 cctcttcaag aatt tgggca ct 22 <210>7 <211>16 <212>DNA <213>人工序列 <220> <400>7 acttgtagat gagatc 16 <210>8 <211>21 <212>DNA <213>人工序列 <220> <400>8 caiactlgcc accaacLgcc a 21 <210>9 <211>30
[0003] <212>DNA <213>人工序列（Probel ) <220> <400>9 atgccatgac actatctcat atgagtcagc 30 <210>10 <211>29 <212>DNA <213〉人工序列（Probe2) <220> <400>10 acacttggca ccattgtgtc cctcataac 29
【权利要求】
1. 一种检测1型和3型鸭甲肝病毒的双重荧光定量RT-PCR特异性引物，其特征在于 是对GenBank上已发表的DHAV-1、DHAV-3的序列进行比对，在两种病毒基因序列的保守但 相互之间差异又较大的区域，分别设计一对针对DHAV-1的特异性检测引物SEQ1和SEQ2, 一 条Taqman探针Probel ; -对针对DHAV-3的特异性检测引物SEQ3和SEQ4, 一条Taqman探 针Probe2,引物序列如下： SEQ1 :5' -AGACACATGTTGCTGAAAAACT-3'， SEQ2 :5' -AGAACCAGTTGTCGTTTGGTC-3'， SEQ3 :5' -CTTGAACGTAATAGAGCTTGG-3'， SEQ4 :5' -AAAGTCTTTTGGTAGAGTCTTAGC-3'， Probel:5' CY5-ATGCCATGACACTATCTCATATGAGTCAGC-3' BHQ2， Probe2 :5, FAM-ACACTTGGCACCATTGTGTCCCTCATAAC-3, TAMRA， 所有引物以无菌ddH20配成lOpmol/μ 1的浓度备用； 上述引物、探针的使用方法为： A、 常规方法提取待测鸭肝组织总RNA作为模板，进行反转录反应；反应体系为：模板 RNA4y 1，SEQ2/SEQ4 引物各 0· 5μ 1，5XM-MLV Buffer2y 1，浓度为 10. OmM 的 dNTPs2y 1， Rnase InhibitionO. 25μ 1，浓度为 5υ/μ 1 的 RTaseM-MLVO. 5μ l，ddH200. 75μ 1 ;反应程序 为：42°C反应 50min，70°C 15min，获得病毒 cDNA ; B、 以病毒cDNA为模板进行荧光定量RT-PCR反应；反应体系为：3. 45yL ddH20， 12. 5 μ L Premix Ex Taq，SEQ1、SEQ2、SEQ3 和 SEQ4 各 1 μ 1，ROX Reference Dye 110. 25μ l，ProbelO. 5μ 1 和 Probe20. 3μ 1，2μ 1 cDNA模板； PCR反应条件为：95°C 5min ;95°C 15s，60°C 45s，40个循环；于60°C时收集荧光； C、 用标准曲线计算出测得Ct值所对应的样品浓度：反应最终输出的Ct值可用标准曲 线换算出对应的样品浓度，纵坐标为所得Ct值，横坐标为样品浓度的对数值。
【文档编号】C12Q1/68GK104046704SQ201410317515
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2014年7月4日 优先权日:2014年7月4日
【发明者】姜世金, 林少莉, 张瑞华 申请人:山东农业大学