具有抑菌作用的沙棘籽多肽及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种具有抑菌作用的沙棘籽多肽溶液及其制备方法和应用。制备步骤：将沙棘籽渣经浸泡处理后，用ProteAX蛋白酶离心取上清液，用截留孔径为5000Da的超滤膜浓缩分离离心上清液，得到沙棘籽抑菌多肽溶液。抑菌培养试验表明，该多肽溶液在10～20mg/mL浓度范围内对沙门氏菌、金黄葡萄球菌和绿脓杆菌等常见的肠道致病菌具有明显的抑制作用。以上沙棘籽多肽可作为饲料添加剂使用。
【专利说明】具有抑菌作用的沙棘籽多肽及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及沙棘多肽的制备，具体涉及沙棘籽提油后残渣的再利用，是一种具有 抑菌作用的沙棘籽多肽溶液及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 沙棘籽渣为沙棘油加工生产后的废弃物，通常只有少量用作饲料，大部分都是作 为垃圾废弃掉。而经过提取沙棘油的沙棘籽渣中的蛋白含量达27-30%，蛋白资源被浪费 掉。目前对于沙棘籽渣的开发利用极少，主要是关于提取其中原花青素及黄酮，但是由于 其开发成本较高，而未被广泛利用。关于沙棘籽多肽的研究有，黄鹏、苏宁等人发表的《沙 棘生物活性肽的制备及功效研究》，此研究通过酶解法制备出一种具有抗氧化作用多肽，采 用的蛋白酶为细菌Neutrase中性蛋白酶。连伟帅、高英、王常青等人发表的《用沙棘籽渣 加工饲料级活性肽》文章中，制备沙棘籽多肽采用的蛋白酶为碱性蛋白酶，多肽用截留分子 量2000Da和3500Da的超滤膜超滤分离出分子量为2000?3500Da的多肽，该多肽对大肠 杆菌，金黄色葡萄球菌具有一定的抑制作用。申请号为201310337183. 1的专利申请《一种 具有抑菌作用的沙棘籽多肽的制备方法》，通过酶解法制备出一种具有抑菌作用的多肽，所 用的酶为酸性蛋白酶-木瓜蛋白酶复合水解，水解液用500Da的纳滤膜纳滤，截留分子量为 500Da的以上的多肽。其主要分离出的是小分子盐类，一些没有抑菌效果的大分子物质仍然 留在沙棘籽多肽溶液中，干扰抑菌效果。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供的一种具有更好抑菌作用的沙棘籽多肽溶液及其制备方 法，以及该多肽溶液在饲料添加剂中应用。
[0004] 本发明提供的一种具有抑菌作用的沙棘籽多肽溶液的制备方法，以沙棘籽渣（沙 棘籽脱脂后的残渣）为原料，经过浸泡预处理后，用Prote AX蛋白酶水解，然后经过离心、 超滤和浓缩后制得，具体包括以下步骤：
[0005] 将沙棘籽渔加水浸泡后，加入ProteAX蛋白酶水解,将水解液放入密闭容器中置 于家用微波炉中灭酶4?10分钟；然后离心，取上清液，用孔径为5000Da的超滤膜分离得 到沙棘籽多肽溶液，浓缩到多肽含量2%保存；沙棘籽渣中的蛋白与ProteAX蛋白酶的质量 比为 1 : 0· 02 ?0· 05。
[0006] 所述的水解条件为，在ρΗ5· 5?7. 5,温度45?55 °C条件下水解1?5h。
[0007] 沙棘籽多肽溶液在10?20mg/mL浓度条件下，对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和绿 脓杆菌等致病菌具有抑制作用。该沙棘籽多肽溶液可用作饲料添加剂，抑制畜禽肠道疾病 的产生，同时还可以补充动物日常所需要的蛋白等营养物质。
[0008] 本发明的优点在于：
[0009] ProteAX蛋白酶是我国允许用于食品工业的进口蛋白酶，该酶是通过米曲霉发酵 制成的复合蛋白酶，2008年引入中国，主要用于植物蛋白水解物如大豆蛋白、鱼蛋白苦味的 去除等工业领域。本发明首次将ProteAX蛋白酶用于沙棘籽多肽的制备。ProteAX蛋白酶 制备的沙棘籽多肽溶液不但对沙门氏菌和金黄色葡萄球菌具有良好的抑制作用，比专利申 请201310337183. 1中公开的酸性蛋白酶+木瓜蛋白酶解多肽的效果好，抑菌圈更大，而且 对绿脓杆菌也有较好的抑菌作用，而酸性蛋白酶+木瓜蛋白酶解多肽对绿脓杆菌没有抑菌 作用。
[0010] 本发明的沙棘籽多肽去除了 5000Da以上的大分子多肽和蛋白对抑菌作用的干 扰，而专利申请201310337183. 1中公开的沙棘籽多肽未采用该工序。凝胶G50分析表明， 5000Da超滤滤出液的主要多肽为2000Da以下的小分子肽和4000至5000Da中短分子多肽； 凝胶柱层析分离后的抑菌实验对比表明，在分子量为2000Da以下的小分子沙棘籽多肽与 4000-5000Da多肽分子协同作用下，对沙门氏菌、金黄葡萄球菌和绿脓杆菌有广谱的抑菌效 果。
[0011] 实验表明，通过超滤分离得到的该多肽只有在1〇?20mg/mL浓度条件下，才具有 良好的抑菌效果，高于或低于该浓度范围抑菌效果较差。原因可能是浓度较低时，溶液中有 效多肽含量少，无法达到抑菌作用；浓度偏高时，溶液中糖类等营养物质含量增多，营养物 质促进微生物生长作用掩盖了多肽的抑菌作用，故只有在10?20mg/mL浓度下才有显著的 抑囷效果。
[0012] 采用微波加热灭酶，即将水解液放入密闭塑料容器中，用1000W家用微波炉加 热4-10分钟即可达到酶灭活的作用。常规沸水浴灭酶时间长，预热和沸水浴的时间往往 要在20分钟以上，而长时间处于高温条件下，会使溶液中多肽与游离氨基酸、游离糖类等 发生美拉德反应，另外，多肽在高温长时间作用下易发生聚合，使溶液中有效多肽成分下 降。本方法的密闭容器的微波灭酶方法，具有灭酶时间短，对溶液中有效抑菌多肽成分破 坏少。实验表明，密闭容器中微波灭酶的多肽水解液其抑菌圈大于煮沸灭酶。而专利申请 201310337183. 1中公开的沙棘籽多肽采用的是常规敞口容器的水浴灭酶。
【专利附图】
【附图说明】
[0013] 图1实施例1沙棘籽多肽样品对金黄色葡萄球菌的抑菌效果图
[0014] 图2实施例1沙棘籽多肽样品对沙门氏菌的抑菌效果图
[0015] 图3实施例2沙棘籽多肽样品抑制沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌浓度梯度 曲线
[0016] 图4微波灭酶和煮沸灭酶的沙棘籽多肽溶液抑菌效果对比图
【具体实施方式】
[0017] 实施例1
[0018] 取20g粉碎好的脱脂沙棘籽渣（蛋白含量为30% )，加入300ml蒸馏水，于25°C 下放置8小时后，调pH至6. 5,加入0. 18g Prote ΑΧ蛋白酶于50°C下水解3h ;装入玻璃瓶 中，拧紧盖子，用1000W的家用微波炉微波灭酶5min，将酶解液以4000r/min离心取上清液， 用截留孔径5000Da的超滤膜超滤，取滤出液浓缩到多肽含量达到2%保存。
[0019] 将以上浓缩液稀释到20mg/ml做抑菌试验，采用的细菌为金黄色葡萄球菌和沙门 氏菌，培养基为营养琼脂培养基。培养基煮沸并冷却至50?60°C时倒入培养皿中，凝固后 将金黄色葡萄球菌及沙门氏菌分别接种至培养基表面。在培养基表面打直径3mm的小孔， 孔中点样品20?30 μ 1，37°C培养48h后观察到，样品对金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的抑菌 圈直径为9. 8mm(见图1)和7. 4mm(见图2)，说明本样品对以上菌有抑制作用。
[0020] 实施例2
[0021] 取50g粉碎好的脱脂沙棘籽渣（蛋白含量为30% )，加入1000ml蒸馏水，于25°C 下放置10小时后，调pH至7. 0,加入0. 45g Prote ΑΧ蛋白酶于46°C下水解4. 5h，装入密封 的玻璃瓶中，用1000W的家用微波炉微波灭酶7min，将酶解液以4000r/min离心取上清液， 用截留孔径5000Da的超滤膜超滤，取滤出液浓缩到多肽含量达到16%。
[0022] 将浓缩液稀释到5、10、20、40、80、160mg/ml做抑菌试验，采用的细菌为沙门氏菌、 金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌，培养基为营养琼脂培养基。培养与观察方法同实施例1中所 述，得到浓度抑制曲线（图3)。由浓度抑制曲线可以看出，对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和 绿脓杆菌的最佳多肽抑制浓度为1 〇-20mg/ml。
[0023] 实施例3
[0024] 取100g粉碎好的脱脂沙棘籽渣（蛋白含量30%)，加入1500ml蒸馏水，于25°C下 放置8小时后，调pH至7. 0,加入0. 63g Prote AX蛋白酶于55°C下水解1.5h，装入密封的 玻璃瓶中，用1200W的家用微波炉加热灭酶lOmin，将酶解液以4000r/min离心取上清液，用 截留孔径5000Da的超滤膜超滤，取滤出液再用截留孔径4000Da的超滤膜超滤，取浓缩液分 离出4000至5000Da中短分子多肽，另取滤出液用截留孔径2000Da的超滤膜超滤，取滤出 液，得到2000Da以下的小分子肽。将不同分子量多肽浓缩到达到15mg/ml。
[0025] 将以上不同分子量多肽溶液进行抑菌试验，采用的细菌为金黄色葡萄球菌和沙 门氏菌，培养基为营养琼脂培养基。培养与观察方法同实施例1中所述。该样品对金黄 色葡萄球菌的抑菌圈直径为5000Da以下是8. 9mm、5000Da?4000Da是5. 4mm、2000Da 以下是6. 3mm ;对沙门氏菌的抑菌圈直径为5000Da以下是7. 2mm、5000Da?4000Da是 4. 7mm、2000Da以下是3. 4mm，说明本样品分子量在2000Da以下的小分子沙棘籽多肽与 4000-5000Da多肽分子协同作用下抑菌效果最佳。
[0026] 实施例4
[0027] 取20g粉碎好的沙棘籽渣，加入300ml蒸馏水，于25°C下放置8小时后，调pH至 6. 5,加入0. 18g Prote AX蛋白酶于50°C下水解3h，煮沸灭酶15min，将酶解液以4000r/min 离心取上清液，用截留孔径5000Da的超滤膜超滤，取滤出液浓缩到多肽含量达到2%。
[0028] 将煮沸灭酶后得到的沙棘多肽溶液与实施例1中微波灭酶得到的沙棘多肽溶液 做抑菌对比试验，采用的细菌为金黄色葡萄球菌，培养基为营养琼脂培养基。培养与观察方 法同实施例1中所述，得到煮沸灭酶、微波灭酶的多肽水解液对金黄色葡萄球菌抑菌圈直 径分别为6. 8mm(见图4A)和9. 4mm(见图4B)，说明微波灭酶的多肽水解液其抑菌作用优于 煮沸灭酶。
【权利要求】
1. 一种具有抑菌作用的沙棘籽多肽溶液的制备方法，其特征在于，将沙棘籽渣加水浸 泡后，加入ProteAX蛋白酶水解，将水解液放入密闭容器中置于家用微波炉中灭酶4?10 分钟；然后离心，取上清液，用孔径为5000Da的超滤膜分离得到沙棘籽多肽溶液，浓缩到多 肽含量2%保存；所述的沙棘籽渣中的蛋白与ProteAX蛋白酶的质量比为1 : 0.02?0.05。
2. 如权利要求1所述的一种具有抑菌作用的沙棘籽多肽溶液的制备方法，其特征在 于，所述的水解条件为，在PH5. 5?7. 5,温度45?55 °C条件下水解1?5h。
3. 如权利要求1或2所述方法制备的沙棘籽多肽溶液。
4. 如权利要求3所述的沙棘籽多肽溶液用作饲料添加剂。
【文档编号】C12P21/06GK104099393SQ201410352663
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年7月23日 优先权日:2014年7月23日
【发明者】王常青, 陈彤 申请人:山西大学