来源于嗜热踝节菌的脂肪酶突变体及应用的制作方法

来源于嗜热踝节菌的脂肪酶突变体及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种来源于嗜热踝节菌(Talaromyces thermophilus)的脂肪酶突变体，所述脂肪酶的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示，所述脂肪酶突变体是将SEQ ID No.2所示氨基酸序列第83位的丝氨酸突变成苏氨酸，或者将第83位的丝氨酸突变成苏氨酸的同时将第58位的丝氨酸突变成蛋氨酸；本发明提供的嗜热踝节菌脂肪酶突变体较亲本活力2～5倍，可用于工业化生产(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸，用于进一步合成普瑞巴林。
【专利说明】来源于嗜热踝节菌的脂肪酶突变体及应用 (一）

【技术领域】
[0001] 本发明涉及脂肪酶编码基因的克隆和利用基因突变技术制备脂肪酶突变体的方 法，所获得的突变体及其在普瑞巴林手性中间体（3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸制 备中的应用。 (二）

【背景技术】
[0002] 脂肪酶（lipase，EC 3. I. 1. 3)，系统名称为三脂酰甘油酰基水解酶 (triacylglycerol acylhydrolase)，是一类既能催化酯水解，又具有催化酯合成、转酯化、 氨解、醇解等反应的酶，在食品、洗涤、饲料、有机合成和生物能源等领域应用广泛（ Curr. Opin. Biotech. 2002, 13:390-397)。脂肪酶催化的反应除具有选择性高、副反应少，产物光 学纯度高等特点外，还具有催化反应条件温和、绿色环保等优势。这使得脂肪酶在光学纯化 合物特别是手性药物的制备中具有独特的优势，已成为制备光学纯手性药物的重要技术手 段（Coord. Chem. Rev. 2008, 252:659-701.)。
[0003] 普瑞巴林（Pregabalin)是一种新型Y-氨基丁酸（GABA)受体激动剂，能有效阻 断电压依赖性钙通道，减少神经递质的释放，具有良好的抗焦虑和神经痛治疗效果（Angew. Chem. Int. Edit. 2008, 47:3500-3504)。由于疗效显著和适应症的扩大，普瑞巴林的销售额 逐年递增，2013年达到45. 95亿美元，列全球最畅销药物榜第13位，市场潜力巨大。2-羧 乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯（CNDE)被脂肪酶/酯酶选择性水解，其产物（3S)-2-羧 乙基-3-氰基-5-甲基己酸是制备普瑞巴林的重要手性中间体。该中间体经脱羧、碱性水 解、氢化即得到普瑞巴林（〇rg. Process Res. Dev. 2008,12:392-398)。但目前只有来源于 Novozymes公司的Lipo丨ase''，即商品化Thermomyces Ianuginosus脂肪酶能满足工业化生 产的需要。因此，开发能够高效拆分CNDE的新催化剂具有重要意义。
[0004] 热稳定酶一般具有较强的溶剂稳定性，具有很好的生物技术和工业应用潜力 (Environ. Technol. 2010, 31:1159-1167)。近年来，从嗜热菌中获得热稳定酶已成为学术和 工业界的研究热点。嗜热踝节菌（Talaromyces thermophilus)是一类分布广泛，生长温度 上限较高的嗜热真菌，已成为具有工业应用价值热稳定酶的重要来源。
[0005] 随着蛋白质工程技术和分子生物学的发展，运用分子改造的手段对酶分子进行改 造已成为当前酶工程领域研究的热点。到目前为止，这项技术已被成功用于改造各种各样 的酶，取得了令人瞩目的进展（Curr. Opin. Struct. Biol. 2011，21:473-480)。分子改造广泛 应用于脂肪酶催化活力、底物特异性、热稳定性和对映体选择性等性质的改造。 (三）


【发明内容】

[0006] 本发明目的在于通过定点饱和突变技术对嗜热踝节菌的脂肪酶进行改造，提供脂 肪酶突变体，其对2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯的水解活力明显提高，从而有利于 该脂肪酶在普瑞巴林中间体制备中的应用。本发明的另一目的还在于提供含有编码本发明 所述的脂肪酶突变体的氨基酸序列。本发明的再一目的在于将本发明的突变体应用于选择 性水解外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯（CNDE)制备普瑞巴林关键手性中间体 (3S) _2_羧乙基_3_氰基-5-甲基己酸。
[0007] 本发明采用的技术方案是：
[0008] 本发明通过对来源于T.thermophilus ATCC 20186脂肪酶基因进行克隆表达， 利用全质粒PCR技术对含有脂肪酶基因的表达载体进行定点饱和突变，构建突变文库， 利用基于真实底物的96孔板高通量筛选方法进行筛选，获得了一系列对CNDE活力明 显提高且对映体选择性严格的脂肪酶突变体，这些突变体能以外消旋2-羧乙基-3-氰 基-5-甲基己酸乙酯为底物，在室温和较高的温度下高效生物催化生产普瑞巴林关键手 性中间体（3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸。最终本发明提供一种来源于嗜热踝 节菌（Talaromyces thermophilus)ATCC 20186的脂肪酶突变体，所述来源于嗜热踝节菌 (T. therm〇philus)ATCC 20186的脂肪酶的氨基酸序列为SEQ ID No. 2所示，核苷酸序列为 SEQ ID No. 1所示，所述脂肪酶突变体是将SEQ ID No. 2所示氨基酸序列第83位的丝氨酸 突变成苏氨酸（氨基酸序列为SEQ ID No. 4所示，核苷酸序列为SEQ ID No. 3所示），或者 将第83位的丝氨酸突变成苏氨酸的同时将第58位的丝氨酸突变成蛋氨酸（氨基酸序列为 SEQ ID No. 6所示，核苷酸序列为SEQ ID No. 5所示），优选所述脂肪酶突变体是将SEQ ID No. 2所示氨基酸序列将第83位的丝氨酸突变成苏氨酸的同时将第58位的丝氨酸突变成蛋 氨酸（氨基酸序列为SEQ ID No. 6所示，核苷酸序列为SEQ ID No. 5所示）。
[0009] 本发明还涉及一种所述来源于嗜热踝节菌ATCC 20186的脂肪酶突变体在制备普 瑞巴林关键手性中间体中应用，具体所述的应用以脂肪酶突变体工程菌经发酵培养后的 培养液离心获得的湿菌体或者湿菌体分离提取的酶作为酶源，以外消旋2-羧乙基-3-氰 基-5-甲基己酸乙酯为底物，以Ca (OAc) 2为螯合剂（用于解除产物抑制剂），以水或缓冲液 (优选Tris-HCl缓冲液）为反应介质构成pH值为6. 0?8. 0 (优选pH值为7. 0)的转化 体系，30?60°C、150?500r/min条件下（优选40°C、500r/min)进行转化反应，反应结束 后，取反应液分离纯化，获得（3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸。所述底物的初始浓度 为0. 1?3. Omol/L转化体系（优选lmol/L)，所述催化剂的用量以湿菌体质量计，终浓度为 10?50g/L转化体系（优选50g/L), Ca (OAc) 2终浓度为50?180mmol/L转化体系（优选 150mmol/L)〇
[0010] 本发明所述湿菌体按如下方法制备：将含脂肪酶突变体编码基因的工程菌接种到 含有终浓度50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37°C、150r/min培养12h，再以体积浓度 1 %接种量转接到新鲜的含有终浓度50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37°C培养至菌体 浓度OD6tltl为0. 4?0. 8,再向培养液中加入终浓度为0. 1?I. OmM(优选0. ImM)的IPTG， 28°C诱导培养10h，取培养物离心，收集沉淀即获得湿菌体。LB液体培养基组成为（g/L):蛋 白胨10,酵母提取物5, NaCl 10,溶剂为去离子水，pH值为7. 0 ;LB平板培养基组成为（g/ U :蛋白胨1〇,酵母提取物5, NaCl 10,琼脂15,溶剂为去离子水，pH值为7.0。
[0011] 本发明所述分离纯化的方法为：反应结束后，将反应液离心除去菌体，取上清液 减压蒸馏至原1/3体积，将浓缩物离心后收集上清液并加入1/3体积的甲苯进行萃取（除 去残留底物），取萃取层减压蒸馏至干（去除残留甲苯和水），得到目标产物（3S)-2-羧乙 基-3-氰基-5-甲基己酸。
[0012] 本发明所述的脂肪酶突变体可以以工程菌全细胞形式使用，也可以是未经纯化的 粗酶形式使用，也可以是经部分纯化的或完全纯化的酶的形式使用。如果需要，还可以利用 本领域已知的固定化技术将本发明的脂肪酶突变体制成固定化酶或者固定化细胞形式的 固化酶。
[0013] 此外，本发明的突变体较亲本活力大幅提高，即使使用该酶的粗提物或者工程菌 全细胞，反应也会以较高的速率进行。此外，本发明的突变体可以在相对较高的温度例如 40-60°C下用于工业化生产（3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸，从而进一步合成普瑞巴 林。
[0014] 本发明的有益效果主要体现在：本发明提供的嗜热踝节菌脂肪酶突变体较亲本活 力提高2?5倍，可用于工业化生产（3S) -2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸，用于进一步合 成普瑞巴林。 (四）

【专利附图】

【附图说明】
[0015] 图1为实施例4中工程菌诱导表达的SDS-PAGE分析；其中泳道M为蛋白质分子 量 Marker，泳道 1 ?3 分别为未诱导的 E. coli BL21(DE3)/pET28-TTL，E. coli BL21(DE3)/ PET28-S83T 和 E. coli BL21 (DE3)/pET28-S58T/S83T，泳道 4 ?6 为 IPTG 诱导的 E. coli BL21(DE3)/pET28-TTL，E. coli BL21(DE3)/pET28-S83T和E. coli BL21(DE3)/pET28-S58T/ S83T。
[0016] 图2为实施例6中脂肪酶突变体S63M/S83T全细胞催化2-羧乙基-3-氰基-5-甲 基己酸乙酯（I. 0M)制备（3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸反应进程曲线图。 (五）

【具体实施方式】
[0017] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0018] 实施例1 :亲本基因的扩增及表达载体的构建
[0019] 米用 RT-PCR 的方法从 Talaromyces thermophilus ATCC 20186 (购自美国典型 微生物菌种保藏中心，American Type Culture Collection)中获得脂肪酶基因。根据 文献报道的 Talaromyce thermophilus CTM10. 103 脂肪酶基因序列（GenBank accession no. JF414585)设计引物 TTL-F 和 ITL-R(见表 1)，采用 RT-PCR 的方法从 T. thermophilus ATCC 20186 中分离脂肪酶基因。采用 TRIzol 法提取 T. thermophilus ATCC 20186 总 RNA， 使用Promega公司的GoScript?逆转录试剂盒进行cDNA第一链的的制备，反应体系及条件 均参照试剂盒的使用说明。以cDNA第一链为模板，在引物TTL-F和TTL-R作用下，利用PCR 方法扩增脂肪酶cDNA序列。PCR反应体系各组分加入量（总体积IOOiiL) :10XPfu DNA polymerase buffer 10 ii L，IOmM dNTP mixture (dATP、dCTP、dGTP 和 dTTP 各 2. 5mM) I ii L， 浓度为50 ii M的引物TTL-F和TTL-R各0? 5 ii L，cDNA I ii L，Pfu DNA聚合酶2 ii L，无核酸 水 85 ii L。采用 Biometra 的 TProfessional PCR 仪，PCR 反应条件为：预变性 94°C 3min，然 后进入温度循环941：3〇8,581：3〇8,721：1111111，共30个循环，最后721：延伸1〇111111。0.9% 琼脂糖凝胶电泳表明PCR产物大小约800bp。利用Axygen的PCR Cleanup Kit回收该 PCR产物，经限制性内切酶Nco I和Xho I双酶切与经同样限制性内切酶酶切处理的表达 载体pET-28b (+)连接，构建含有脂肪酶基因的表达重组质粒pET28-TTL，转化感受态细胞 E. coli BL21(DE3)，涂布于含有终浓度50mg/L卡那霉素的LB平板，37°C培养过夜。随机挑 取10个单克隆进行菌落PCR鉴定，挑取一个阳性克隆进行测序证实。经DNA测序证实，确 定该被克隆的亲本脂肪酶的核苷酸序列，即序列表中的SEQ ID No. 1，相应的氨基酸序列为 序列表中的SEQ ID No. 2,获得脂肪酶工程菌E. coli BL21(DE3)/pET28-TTL。
[0020] 实施例2 :脂肪酶位点83的定点饱和突变
[0021] 定点饱和突变技术参考（Current Protocols in Protein Science26.6. 1-26.6. 10,2011 ；Appl.Microbiol. BiotechnoI. 2014, 98:2473-2483) 的描述，阳性突变子的高通量筛选技术参考（Appl. Microbiol. Biotechnol. 2014, 98:2473-2483)的描述。具体过程如下：
[0022] 为了将亲本氨基酸序列中的第83位点的Ser进行饱和突变，设计突变引物S83-F 和S83-R (见表1)，以实施例1构建的质粒pET28-TTL为模板，进行全质粒PCR。PCR扩增体 系为：5XPS buffer lOiiL，dNTP(2.5mM each)4iiL，突变引物 S83-F 和 S83-R 各 0.5iiL， 质粒 PET28-ITL 0.5 iiL，PrimeSTAR DNA 聚合酶 0.5 iiL，补水至 50 iiL。PCR 条件为 98°C预 变性 2min，25 个循环：98°C 10s，65°C 10s，72°C6min，最后 72°C lOmin。经 0.9%琼脂糖凝 胶电泳分析PCR为阳性后，取PCR反应液20 ii L，加入I ii L Dpn I，37°C酶切2h去除模板质 粒DNA，65°C灭活10min，转化感受态细胞E. coli BL21(DE3)，涂布含终浓度50mg/L卡那霉 素的LB平板，37°C培养过夜，获得约500个克隆的突变体库。挑取单菌落于装有LB培养基 的96孔培养板，37°C培养至OD 6tltl约为0. 6,加入终浓度0. ImM IPTG，28°C诱导10h。96孔 板离心机上4, 000g，15min离心，弃上清，加入100 ii L磷酸钾缓冲液（pH 7. 2, IOmM)重悬菌 体。以外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯为底物，以0. 01 %溴百里香酚蓝为指示 齐U，以突变前的工程菌细胞为参照，在96孔板上初筛活力提高的阳性克隆，根据反应体系 颜色变化（蓝色一黄色）的速度进行粗筛，筛选出变色速度快于对照菌株的克隆。筛选出 的阳性克隆再经活力测定验证，从阳性克隆中抽提质粒，经DNA测序确定引入的点突变，活 力最高的阳性克隆DNA测序显示83位的Ser突变成了 Thr (S83T)，获得脂肪酶突变体工程 菌E. coli BL21(DE3)/pET28-S83T。突变体S83T的氨基酸序列见序列表中的SEQ ID No. 3， 其中一种编码基因序列见序列表中的SEQ ID No. 4。
[0023] 实施例3 :对脂肪酶突变体S83T位点58的定点饱和突变
[0024] 定点饱和突变技术参考（Current Protocols in Protein Science26.6. 1-26.6. 10,2011 ；Appl.Microbiol. BiotechnoI. 2014, 98:2473-2483) 的描述，阳性突变子的高通量筛选技术参考（Appl. Microbiol. Biotechnol. 2014, 98:2473-2483)的描述。具体过程如下：
[0025] 在脂肪酶突变体S83T的基础上对位点58的Ser进行饱和突变，设计突变引物 S58-F和S58-R (见表1)，以质粒pET28-S83T为模板（见实施例2)，进行全质粒扩增。PCR 体系为：5XPS buffer 10iiL，dNTP(2.5mM each)4iiL，突变引物 S58-F 和 S58-R 各 0.5iiL， 质粒 PET28-S83T 0? 5 ii L，PrimeSTAR DNA 聚合酶 0? 5 ii L，补水至 50 ii L。PCR 条件为 98°C 预变性21^11，25个循环：981：1〇8,651：1〇8,721：6111111，最后721：1〇111111。经0.9%琼脂糖 凝胶电泳分析PCR为阳性后，取PCR溶液20 ii L，加入I ii L Dpn I，37 °C酶切2h去除模板 质粒DNA，65°C灭活10min，转化感受态细胞E. coli BL21(DE3)，涂布含卡那霉素（终浓度 50 ii g/ml)的LB平板，37°C培养过夜，获得约500个克隆的突变体库。位点58的饱和突变 库的筛选同实施例2,不同是所用对照为实施例2获得的S83T突变体细胞。筛选出的阳性 克隆再经活力测定证实后从阳性克隆中抽提质粒，经DNA测序确定引入的点突变，活力最 高的阳性克隆DNA测序显示58位的Ser突变成了 Met (S58M)，获得脂肪酶突变体工程菌 E. coli BL21 (DE3)/pET28-S58T/S83T。突变体S58M/S83T的氨基酸序列见序列表中的SEQ ID No. 5,其编码基因序列见序列表中的SEQ ID No. 6。
[0026] 表1:引物
[0027]

【权利要求】
1. 一种来源于嗜热踝节菌（Talaromyces thermophilus)ATCC 20186的脂肪酶突变 体，所述脂肪酶的氨基酸序列为SEQ ID No. 2所示，其特征在于所述脂肪酶突变体是将SEQ ID No. 2所示氨基酸序列第83位的丝氨酸突变成苏氨酸，或者将第83位的丝氨酸突变成苏 氨酸的同时将第58位的丝氨酸突变成蛋氨酸。
2. 如权利要求1所述的脂肪酶突变体，其特征在于所述脂肪酶突变体是将SEQ ID No. 2所示氨基酸序列第83位的丝氨酸突变成苏氨酸的同时将第58位的丝氨酸突变成蛋氨 酸。
3. -种权利要求1或2所述来源于嗜热踝节菌ATCC 20186的脂肪酶突变体在制备 普瑞巴林关键手性中间体中应用，其特征在于所述的应用以脂肪酶突变体工程菌经发酵 培养后的培养液离心获得的湿菌体或者湿菌体分离提取的酶作为酶源，以外消旋2-羧乙 基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯为底物，以Ca(0Ac) 2为螯合剂，以水或缓冲液为反应介质构 成pH值为6. 0?8. 0的转化体系，30?60°C、150?500r/min条件下进行转化反应，反应 结束后，取反应液分离纯化，获得（3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸。
4. 如权利要求3所述的应用，其特征在于所述底物的初始浓度为0. 1?3. Omol/L反应 体系，所述催化剂的用量以湿菌体质量计，终浓度为10?50g/L反应体系，Ca (OAc) 2终浓度 为50?180mmol/L反应体系。
5. 如权利要求3所述的应用，其特征在于所述湿菌体按如下方法制备：将含脂肪酶 突变体编码基因的工程菌接种到含有终浓度50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37°C、 150r/min培养12h，再以体积浓度1%接种量转接到新鲜的含有终浓度50mg/L卡那霉素 的LB液体培养基中，37°C培养至菌体浓度0D_为0. 4?0. 8,再向培养液中加入终浓度为 0. 1?ImM的IPTG，28°C诱导培养10h，取培养物离心，收集沉淀即获得湿菌体。
6. 如权利要求3所述的应用，其特征在于所述分离纯化的方法为：反应结束后，将反应 液离心，取上清液减压蒸馏至原1/3体积，将浓缩物离心后收集上清液并加入1/3体积的甲 苯进行萃取，取萃取层减压蒸馏至干，得到目标产物（3S) -2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己 酸。
【文档编号】C12R1/19GK104293744SQ201410409072
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年8月19日 优先权日:2014年8月19日
【发明者】郑裕国, 郑仁朝, 黎小军, 吴欣玮, 沈寅初 申请人:浙江工业大学