疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体、编码基因及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体、编码序列及其应用。所述一种疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体，由序列如SEQ?ID?No.1的肽段经点突变获得，所述的点突变为下列之一或两者结合：（1）第63位的S突变为L或M；（2）第232位的D突变为A。本发明提供的疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体较亲本活力大幅提高，可用于工业化生产(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸，从而进一步合成普瑞巴林。
【专利说明】疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体、编码基因及其应用
(-)【技术领域】
[0001]本发明涉及一组疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体、编码基因，及其在水解外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯制备普瑞巴林关键手性中间体(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸中的应用。
(二)【背景技术】
[0002]普瑞巴林(Pregabalin,简称PGB),化学名为(S) -(+) _3_氨甲基_5_甲基己酸(I )，属 Y -氨基丁酸的 3 位异丁基取代物(Angew.Chem.1nt.Ed.2008, 47:3500-3504)。普瑞巴林是一种钙离子通道调节剂，能够有效抑制与神经病理性疼痛、癫痫相关的神经元过度兴奋及神经递质释放增加(Curr.0pin.Pharmacol.2006, 6:108-113)，已被FDA批准用于带状疱疹后神经痛、糖尿病外周神经痛、癫痫、纤维肌痛等。与传统药物相比，普瑞巴林的剂量更低、服用次数少、副作用小、持续时间长、耐受性强(Curr.Med.Res.0pin.2006, 22:375-384)，因此被国际疼痛学会(IASP)、欧洲神经病学学会联盟(EFNS)和英国NICE等多个国际指南推荐为一线治疗药物。自上市以来，普瑞巴林全球销售额快速增长，成为全球畅销药市场的“重磅炸弹”，2012年全球销售额已突破40亿美元，市场前景十分广阔。
[0003]国内外报道了大量有关普瑞巴林及其中间体化学合成工艺，可归为、不对称催化法、手性拆分法手性配体法和手性化合物直接合成法等四大类。化学法由于工艺步骤冗长、手性拆分试剂昂贵 、反应条件苛刻、有毒有害溶剂用量大，而无法实现规模化生产。生物催化法由于反应条件温和、立体选择性高、环境友好等优点成为最受瞩目的医药及精细化学品合成技术之一。辉瑞公司开发的普瑞巴林生产工艺引入脂肪酶Lipolase催化拆分外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯生成(S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸
(II)。该手性中间体经脱羧、碱性水解、氢化等步骤制得普瑞巴林(I) (Org.Process Res.Dev.2008，12:392-398 ；US20050283023 ；US8134023B2)。
[0004]
【权利要求】
1.一种疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体，由序列如下的肽段经点突变获得:RPVRRAVPQD LLDQFELFSQ YSAAAYCAAN NHAPVGSDVT CSENVCPEVD AADATFLYSF EDSGLGDVTGLLALDNTNKL IVLSFRGTRS VENWIANLNA DLTEISDICS GCEGHDGFVT SffRSVADTIR EQVQNAVNEHPDYRVVFTGH SLGGALATIA AAALRGNGYN IDVFSYGAPR VGNRAFAEFL TAQTGGTLYR ITHTNDIVPRLPPRDffGYSH SSPEYffVTSG NDVPVTANDI TVVEGIDSTD GNNQGNIPDI PSHLffYFGPI SECD ;所述的点突变为下列之一或两者结合:(I)第63位的S突变为L或M ; (2)第232位的D突变为A0
2.如权利要求1所述的疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体，其特征在于所述嗜热丝孢菌脂肪酶突变体序列如下:RPVRRAVPQD LLDQFELFSQ YSAAAYCAAN NHAPVGSDVT CSENVCPEVDAADATFLYSF EDLGLGDVTG LLALDNTNKL IVLSFRGTRS VENWIANLNA DLTEISDICS GCEGHDGFVTSffRSVADTIR EQVQNAVNEH PDYRVVFTGH SLGGALATIA AAALRGNGYN IDVFSYGAPR VGNRAFAEFLTAQTGGTLYR ITHTNDIVPR LPPRDffGYSH SSPEYffVTSG NAVPVTANDI TVVEGIDSTD GNNQGNIPDIPSHLffYFGPI SECD。
3.如权利要求1所述的疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体，其特征在于所述嗜热丝孢菌脂肪酶突变体序列如下:RPVRRAVPQD LLDQFELFSQ YSAAAYCAAN NHAPVGSDVT CSENVCPEVDAADATFLYSF EDLGLGDVTG LLALDNTNKL IVLSFRGTRS VENWIANLNA DLTEISDICS GCEGHDGFVTSffRSVADTIR EQVQNAVNEH PDYRVVFTGH SLGGALATIA AAALRGNGYN IDVFSYGAPR VGNRAFAEFLTAQTGGTLYR ITHTNDIVPR LPPRDffGYSH SSPEYffVTSG NDVPVTANDI TVVEGIDSTD GNNQGNIPDIPSHLffYFGPI SECD。
4.如权利要求1所述的疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体，其特征在于所述嗜热丝孢菌脂肪酶突变体序列如下:RPVRRAVPQD LLDQFELFSQ YSAAAYCAAN NHAPVGSDVT CSENVCPEVDAADATFLYSF EDMGLGDVTG LLALDNTNKL IVLSFRGTRS VENWIANLNA DLTEISDICS GCEGHDGFVTSffRSVADTIR EQVQNAVNEH PDYRVVFTGH SLGGALATIA AAALRGNGYN IDVFSYGAPR VGNRAFAEFLTAQTGGTLYR ITHTNDIVPR LPPRDffGYSH SSPEYffVTSG NAVPVTANDI TVVEGIDSTD GNNQGNIPDIPSHLffYFGPI SECD。
5.编码权利要求1~4之一所述疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体的基因。
6.如权利要求5所述的基因，其特征在于所述基因为下列之一:SEQ ID N0.4，SEQ IDN0.6，SEQ ID N0.8。
7.如权利要求1所述的疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体在水解外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯制备普瑞巴林关键手性中间体(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸中的应用。
【文档编号】C12P13/00GK103981160SQ201410032400
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年1月23日 优先权日:2014年1月23日
【发明者】郑裕国, 郑仁朝, 黎小军, 马红叶, 沈寅初 申请人:浙江工业大学