一种动物核酸样本常温保存试剂及其应用的制作方法

一种动物核酸样本常温保存试剂及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种动物核酸样本常温保存试剂及其应用，这种动物核酸样本常温保存试剂，包含酸性细胞裂解剂、核酸酶抑制剂、表面活性剂、柠檬酸钠和醋酸钠，其中，所使用的细胞裂解剂为异硫氰酸胍，所使用的核酸酶抑制剂为8-羟基喹啉和β-巯基乙醇，所使用的表面活性剂为十二烷基硫酸钠；另一方面，本发明公开了使用上述动物核酸样本常温保存试剂处理滤纸的方法，包括如下步骤:1)将滤纸在所述动物核酸样本常温保存试剂中浸泡；2)将滤纸在37～50℃下烘烤；3)灭菌，备用。
【专利说明】一种动物核酸样本常温保存试剂及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及核酸样本保存试剂，尤其涉及一种动物核酸样本常温保存试剂及其应用。
【背景技术】
[0002]核酸是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一。核酸大分子可分为两类:脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)，在蛋白质的复制和合成中起着储存和传递遗传信息的作用。核酸不仅是基本的遗传物质，而且在蛋白质的生物合成上也占重要作用，因而在生长、遗传、变异等一系列重大生命现象中起决定性的作用。随着分子遗传中心法则揭示了核酸与蛋白质间的关系，对于核酸的分析研究实验如PCR、SNP等应用的范围日益广泛，其中在动物学、生物学上的应用研究尤甚。
[0003]目前针对核酸普遍采用的技术仍然是低温贮藏，采用该方法通常需要高要求的低温冰箱(如_80°C )，通过低温防止核酸酶降解抑制核酸酶活性，来实现低温保存。但是，保存条件要求过高，同时也不利于核酸样本的采集及运输。
[0004]传统的核酸提取和保存途径主要有一下两种途径:一，现场采集组织核酸样本，立即提取核酸并低温保存；二，现场采集样本，低温冻存防止核酸酶降解，然后运送至实验室提取核酸后低温冻存。采用方法一的缺陷是采集现场需要离心机、超净工作台等实验室设备，对于野外采集样本或者不具备实验室条件的场所无法使用该方法提取和保存核酸。采用方法二对于组织样本的运输有着严格的低温要求，必须一直低温贮藏，成本较高。
[0005]同时，针对传统的动物核酸样本的采集方式一般是由政府检测机构上门检测，或者是由养殖企业进行送检。近年来，出现了跨地区病死动物病料、血样的邮寄、递送。这些病料的现场采集，均需要专门的检疫人员进行操作，成本高、效率低、运输需要冷链等，且存在着如病原随运输的扩散等多因素的生物安全隐患因素。随着生物基因工程技术的发展，越来越需要一种简便的采集方式，以及一种保存条件温和，能够常温下抑制核酸酶活性的核酸保存试剂，便于长期保存动物核酸样本的保存方法。

【发明内容】

[0006]本发明中，常温是指20-25 °C。
[0007]本发明中，所称核酸包括:脱氧核糖核酸DNA以及核糖核酸RNA。
[0008]本发明中所涉及的动物核酸样本包括:动物组织样本、血液、粪便、尿液、唾液、以及相关组织液等。
[0009]本发明中，英文缩写如下:
[0010]DNA指脱氧核糖核酸；RNA只核糖核酸；
[0011]PCR 指聚合酶链式反应，即 Polymerase Chain Reaction ；
[0012]SNP 指单核苷酸多态性测序，即 single nucleotide polymorphism ；
[0013]SDS指十二烷基硫酸钠；RNase指核酸酶；[0014]APP指猪传染性胸膜肺炎放线杆菌，即Actinobacillus pIeuropneumoniae ；
[0015]TE 指含 EDTA 的 Tris-HCl (PH8.0)缓冲液。
[0016]本发明的目的是提供一种动物核酸样本常温保存试剂以及该试剂在动物核酸样本常温保存中的应用。
[0017]为实现上述目的，一方面，本发明提供了一种动物核酸样本常温保存试剂，包含酸性细胞裂解剂，核酸酶抑制剂，表面活性剂，柠檬酸钠和醋酸钠，其中，所述细胞裂解剂为异硫氰酸胍，能够迅速破碎细胞，并且能够抑制细胞释放出来的核酸酶的活性；所述核酸酶抑制剂为8-羟基喹啉和β -巯基乙醇能够抑制核酸酶活性，所述表面活性剂为十二烷基硫酸钠(SDS)，SDS是一种已知的能够使蛋白质变性的表面活性剂，它可以用于核酸抽提操作中破坏细胞壁并裂解核酸-蛋白复合物。在较高的温度下破坏蛋白质与DNA结合，使DNA释放出来。柠檬酸钠和醋酸钠的主要作用是作为调节试剂的PH值。
[0018]优选地，所述动物核酸样本常温保存试剂的pH值为7.0~9.5。
[0019]优选地，酸性细胞裂解剂的质量浓度为0.125~0.250g/L。
[0020]优选地，8-羟基喹啉的质量分数为0.1%~0.5%，β-巯基乙醇的质量分数为
0.5% ~1%。
[0021]优选地,十二烷基硫酸钠的质量分数为5%~10%。
[0022]优选地，醋酸钠的摩尔浓度为0.01~0.05mol/Lo
[0023]另一方面，本发明提`供了一种使用上述动物核酸样本常温保存试剂处理滤纸的方法，包括以下步骤:
[0024]I)将滤纸在上述动物核酸样本常温保存试剂中浸泡；
[0025]2)将滤纸在37~50°C下烘烤；
[0026]3)灭菌，备用。
[0027]优选地，其中所选用的滤纸为903#滤纸。
[0028]另一方面，本发明提供了一种动物核酸样本采集/保存卡，其中样本采集/保存区铺设有使用上述方法处理过的滤纸。
[0029]另一方面，本发明提供了一种常温保存动物核酸样本的方法，包括以下步骤:
[0030]I)将动物样本涂抹于上述动物核酸样本采集/保存卡的滤纸上；
[0031 ] 2)将动物核酸样本采集/保存卡折叠，常温保存。
[0032]本发明中的动物样本包括动物组织样本、粪样、血样、尿样、唾液、以及相应的器官分泌物。
[0033]本发明的试剂中的动物核酸样本保存试剂，用于动物核酸样本的现场临床采集，在使得样本细胞进行快速裂解，同时可抑制细胞内所释放的核酸酶，被本发明的核酸酶活性抑制用化合物抑制活性的优选的核酸酶为核糖核酸内切酶，具体为RNase A、RNase H、RNase I,RNase III,Rnase L、RNase P 等；此外，作为核酸外切酶包括:PNPase、RNase I1、RNase R,RNase D、寡核糖核酸酶、核酸外切，酶I以及核酸外切酶II等。使得核酸可于常温下长期保存，并且有着较高的核酸产出率，既满足了现场的快速采集，降低了操作难度，有效地保障了现场操作人员的人身安全，同时为后期下游实验如PCR、SNP等复检、分析，给予了支持。
[0034]本发明提供的动物核酸样本常温保存试剂，以及动物核酸样本采集/保存卡，可以很方便的进行样本的远距离运输，克服了此前样本多呈液态较难进行长距离运输的难题，更加达到了对核酸常温下的长期保存，便于以后对样本的复检分析。同时本发明的试剂和相应的采集/保存卡片具有工艺简单，成本低廉的特点，在很大程度上降低了以往的贮运成本的同时，还为临床对于动物样本直接采集的实际操作带来极大的便利。同时大大降低了临床传染病发生的几率，很好的保护了操作人员的安全。
【专利附图】

【附图说明】
[0035]图1是经过PCR核酸扩增实验得到的DNA片段的琼脂凝胶电泳图。M为DNA标记；I为实施例7中的PCR核酸扩增实验得到的DNA片段；2为实施例8中的PCR核酸扩增实验得到的DNA片段；3为实施例9中的PCR核酸扩增实验得到的DNA片段。
【具体实施方式】
[0036]本发明中使用的滤纸为903#滤纸，采购于3M公司。
[0037]本发明中采用的实验方法如下:
[0038]实施例1
[0039]动物核酸样本常温保存试剂I的配制:在293ml水中，依次加入250g异硫氰酸胍、17.6ml浓度为0.75mol/L的柠檬酸钠、26.7ml质量分数为10%的十二烷基硫酸钠水溶液以及50ml浓度为2mol/L醋酸钠溶液，得到的混合物与500ml苯酚混合，搅拌均匀，并用
0.lmmol/L的盐酸滴定至pH值为7.0。
[0040]实施例2
[0041]动物核酸样本常温保存试剂2的配制:在293ml水中，依次加入250g异硫氰酸胍、17.6ml0.75mol/L的柠檬酸钠、14.5g0.1%的8-羟基喹啉，3.9g0.5%的β -巯基乙醇，36.7mll0%的十二烷基硫酸钠水溶液、以及50ml2mol/L醋酸钠溶液，得到的混合物与500ml苯酹混合，搅拌均匀，并用浓度为0.lmmol/L的氢氧化钠溶液滴定至pH值为9.5。
[0042]实施例3
[0043]动物核酸样本采集/保存卡中样本采集/保存区所用的滤纸的处理:
[0044]步骤I):将903#滤纸在实施例1中配制的动物核酸样本常温保存试剂中浸泡I分钟；
[0045]步骤2):将步骤I)中浸泡过的滤纸在37~50°C下烘烤I~3分钟；灭菌；
[0046]然后将处理过的滤纸置于动物核酸样本采集/保存卡中的样本采集/保存区备用。
[0047]实施例4
[0048]动物核酸样本采集/保存卡中所用滤纸的处理:
[0049]步骤I):将3M公司的903#滤纸在实施例2中配制的动物核酸样本常温保存试剂中浸泡I分钟；
[0050]步骤2):将步骤I)中浸泡过的滤纸在37~50°C下烘烤I~3分钟；灭菌；
[0051]然后将处理过的滤纸置于动物核酸样本采集/保存卡中的样本采集/保存区备用。
[0052]实施例5[0053]用棉签将感染了APP-传染性胸膜肺炎放线杆菌患病猪只的前腔静脉血液样本均匀涂抹于按照实施例3中的步骤处理过的动物核酸样本采集/保存卡中的滤纸上，将动物核酸样本采集/保存卡折叠，常温下保存5天。然后使用500ml TE洗涤液将滤纸上的血斑洗脱，重复洗涤三次，达到将滤纸上的血细胞洗脱并将核酸贮存在滤纸上的目的，从而得到含有猪胸膜肺炎放线杆菌DNA样本的滤纸，再按照检测所需DNA样本的量裁取所需的滤纸大小。剩余的滤纸可继续常温保存，留待后续检测。
[0054]实施例6
[0055]用棉签将感染了APP-传染性胸膜肺炎放线杆菌患病猪只的前腔静脉血液样本均匀涂抹于按照实施例4中的步骤处理过的动物核酸样本采集/保存卡中的滤纸上，将动物核酸样本采集/保存卡折叠，常温下保存5天。然后使用500ml TE洗涤液将滤纸上的血斑洗脱，重复洗涤三次，达到将滤纸上的血细胞洗脱并将核酸贮存在滤纸上的目的，从而得到含有猪胸膜肺炎放线杆菌DNA样本的滤纸，再按照检测所需DNA样本的量裁取所需的滤纸大小。剩余的滤纸可继续常温保存，留待后续检测。
[0056]实施例7
[0057]从实施例5中得到的含有猪胸膜肺炎放线杆菌DNA样本的滤纸上裁取一张直径为2mm2圆片，放入1.5ml离心管中，加入IOOul超纯水，在水平震荡器上震荡2分钟，静置5分钟后，将圆片取出，放入PCR管中，然后再依次加入IOul PCRmix、引物上游片段(其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示)lul、引物下游片段(其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示)Iul以及超纯水8ul，再将PCR管放入PCR核酸扩增仪中，按照PCR反应步骤，变性、退火、延伸、检测同时设置相应的循环参数，进行PCR核酸扩增反应实验得到所需扩增的目的核酸。
[0058]将所得的扩增核酸进行琼脂凝胶电泳实验即可完成其阳性率的检出及病症的确认，所得电泳照片如图1所示。`
[0059]实施例8
[0060]从实施例6中得到的含有猪胸膜肺炎放线杆菌DNA样本的滤纸上裁取一张直径为2mm2圆片，放入1.5ml离心管中，加入IOOul超纯水，在水平震荡器上震荡2分钟，静置5分钟后，将圆片取出，放入PCR管中，然后再依次加入IOul PCRmix、引物上游片段(其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示)lul、引物下游片段(其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示)Iul以及超纯水8ul，再将PCR管放入PCR核酸扩增仪中，按照PCR反应步骤，变性、退火、延伸、检测同时设置相应的循环参数，进行PCR核酸扩增实验得到扩增核酸。
[0061]将所得的扩增核酸进行琼脂凝胶电泳实验，所得电泳照片如图1所示。
[0062]实施例9
[0063]利用试剂盒提取猪胸膜肺炎放线杆菌DNA的过程，采用商品化核酸提取试剂盒提取的DNA凝胶电泳图如图1所示。
[0064]由图1可以看出，实施例7 (如泳道I所示)、实施例8 (如泳道2所示)和实施例9 (如泳道3所示)中的猪胸膜肺炎放线杆菌DNA样本均在360bp处分离出光亮条带，证明所采集的血液样本中猪胸膜肺炎放线杆菌呈阳性。由此可知，利用含有经过实施例1和实施例2中配制的动物核酸样本常温保存试剂处理过的滤纸的核酸样本采集/保存卡能够在常温下保存试剂，即实施例1和实施例2中配制的动物核酸样本常温保存试剂具有常温下保存核酸样本的功效。[0065]以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本【技术领域】中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
【权利要求】
1.一种动物核酸样本常温保存试剂，包含酸性细胞裂解剂，核酸酶抑制剂，表面活性齐?，柠檬酸钠和醋酸钠，其中，所述细胞裂解剂为异硫氰酸胍，所述核酸酶抑制剂为8-羟基喹啉和β-巯基乙醇，所述表面活性剂为十二烷基硫酸钠。
2.如权利要求1所述的动物核酸样本常温保存试剂，pH值为7.0~9.5。
3.如权利要求1所述的动物核酸样本常温保存试剂，其中所述酸性细胞裂解剂的质量浓度为 0.125 ~0.250g/L。
4.如权利要求1所述的动物核酸样本常温保存试剂，其中8-羟基喹啉的质量分数为0.1%~0.5%，β -巯基乙醇的质量分数为0.5%~1%。
5.如权利要求1所述的动物核酸样本常温保存试剂，其中十二烷基硫酸钠的质量分数为5%~10% ο
6.如权利要求1所述的动物核酸样本常温保存试剂，其中醋酸钠的摩尔浓度为0.01~0.05mol/L。
7.使用权利要求1~7中任一项所述的动物核酸样本常温保存试剂处理滤纸的方法，包括如下步骤: 1)将滤纸在所述动物核酸样本常温保存试剂中浸泡； 2)将滤纸在37~50°C下烘烤； 3)灭菌，备用。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述滤纸为903#滤纸。
9.一种动物核酸样本采集/保存卡，其中样本采集/保存区铺设有经权利要求7所述的方法处理过的滤纸。
10.一种常温保存动物核酸样本的方法，包括如下步骤: 1)将采集到的动物核酸样本涂抹于如权利要求9所述的动物核酸样本采集/保存卡中的滤纸上； 2)将所述动物核酸样本采集/保存卡折叠，常温保存。
【文档编号】C12M1/00GK103756998SQ201410032095
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年1月23日 优先权日:2014年1月23日
【发明者】崔立, 刘雨潇, 赖 志, 马晶晶, 王春艳, 高俊锋 申请人:上海交通大学, 上海创宏生物科技有限公司