桑螟β-呋喃果糖苷酶、编码基因、基因载体、菌株及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种来自桑螟的β-呋喃果糖苷酶、编码基因、基因载体、菌株及应用。本发明提供的桑螟β-FFase是序列表中SEQ?ID?NO.1所示的由488个氨基酸残基组成的蛋白质。本发明从桑树重要害虫桑螟的中肠转录产物中克隆得到DpSuc1a，该基因在桑螟的中肠高量表达，与表达载体pET-24b连接，转化到BL21（DE3）感受态细胞，经诱导表达，获得了可溶性融合蛋白DpSUC1a，经酶学特性鉴定，重组DpSUC1a具有β-FFase的活性，说明β-FFase是桑螟为害桑树，避免桑树生物碱毒害作用的重要酶蛋白。本发明的基因及其编码蛋白对食桑害虫抵抗桑树生物碱的分子机制研究，以及进一步利用植物转基因RNAi等技术开发新型抗虫靶标具有重要的理论及实际意义，将在桑园害虫防治和增强桑树抗虫性的研究中发挥重要的作用，应用前景广阔。
【专利说明】桑螟β-呋喃果糖苷酶、编码基因、基因载体、菌株及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于昆虫分子生物学和植物生物化学领域，具体涉及桑螟β-FFase基因DpSucla的扩增、全长cDNA的克隆和鉴定及其编码蛋白的体外表达与酶活性分析。
【背景技术】
[0002]多种植物在机械性损伤或者昆虫取食的部位渗出乳液或其他分泌物。大量研究表明这些乳液富含多种化学防护物质，如萜类、生物碱、类黄酮、类固醇等，其通过昆虫的中肠发生作用，阻碍昆虫的摄食或成长，进而在防御植食性昆虫食害方面起重要作用。乳液因此被认为是与植物的抗虫防御功能密切相关。
[0003]另一方面，植食性昆虫进化出对植物的复杂的适应性，从分子、生理、行为方面抵御各种乳液的损害。桑树是迄今为止被发现含有脱氧野尻霉素(DNJ)等糖类似生物碱的几种高等植物之一，桑叶的乳液中含有高浓度的次生代谢产物生物碱。Konno等人的研究发现，桑叶乳液中所含的生物碱对一些鳞翅目昆虫如寡食性的蓖麻蚕和多食性的甘蓝夜蛾幼虫具有强烈的毒害作用。
[0004]蔗糖水解酶有两种:一种是从葡萄糖基一侧起催化作用的α-葡萄糖苷酶，另一种是从果糖基一侧水解鹿糖的β -呋喃果糖苷酶(β-fructofuranosidase, β-FFase,在动物中鲜有报道)。研究表明，生物碱是α-葡萄糖苷酶的强效抑制剂，而对β-FFase没有抑制作用。^mBombyx是以桑叶为唯一食物和糖营养来源的经济昆虫，家蚕的基因组中存在β-FFase基因(汝?5i/c7)，其在幼虫中肠中特异表达并被证实具有不受生物碱抑制的酶活性质。研究认 为家蚕正是利用β-FFase的功能充分分解吸收桑叶中的蔗糖营养，从而成功地避开了桑叶生物碱的毒害作用。
[0005]针对当前蚕桑产业的多元化发展趋势和要求，桑树不仅可以作为蚕的饲料来源，更为广阔的是，桑树还可以作为生态桑，用于治理石漠化，起到防沙护林和保护环境等多方面的作用。桑螟imaphania pyloalis)是桑树重要害虫之一，对我国多省份夏秋季的桑树为害相当严重。我们发现桑螟的中肠组织蛋白中含有β-FFase的酶活性，桑螟的基因组中同样存在β-FFase的同源基因(Z05i/c7a)，该基因在桑螟的中肠被大量转录表达。本发明对桑螟的β -FFase基因的cDNA进行扩增、克隆和序列分析，通过体外表达重组DpSUCla酶蛋白，鉴定了酶的活性功能。本发明的基因及其编码蛋白对食桑害虫抵抗桑树生物碱的分子机制研究，以及进一步利用植物转基因RNAi等技术开发新型抗虫靶标具有重要的理论及实际意义，将在桑园害虫防治和增强桑树抗虫性的研究中发挥重要的作用，应用前景广阔。
【发明内容】
[0006]本发明的目的之一是提供一种新的桑螟β -FFase基因的编码基因、扩增方法及扩增引物组，其编码基因办5^7<3的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0007]为实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案:本发明提供了用于扩增桑螟β -FFase基因的引物组，由如下引物组成:
简并引物:正向引物SUCdgpF如SEQ ID N0.3所示；
反向引物SUCdgpR如SEQ ID N0.4所示。
[0008]RACE 引物:5’ RACE 外引物 DpSucla_5RAgsp，如 SEQ ID N0.5 所示；
5’ RACE 内引物 DpSucla-5RAngsp，如 SEQ ID N0.6 所示；
3，RACE 外引物 DpSucla-3RAgsp，如 SEQ ID N0.7 所示；
3’ RACE 内引物 DpSucla-3RAngsp，如 SEQ ID N0.8 所示。
[0009]本发明还提供了桑螟β -FFase基因的制备方法，包括如下步骤:
步骤1:获得桑螟中肠的总RNA ；
步骤2:反转录合成cDNA ；
步骤3:以cDNA为模版， 用简并引物SUCdgpF和SUCdgpR为引物进行PCR，扩增得到中间序列；
步骤4:用RACE引物组扩增获得桑螟β -FFase基因片段的5’端和3’端片段；
步骤5:将所述β -FFase基因cDNA序列的中间片段、所述β -FFase基因的5’端和3’端片段拼接，即得桑螟β -FFase基因的全长cDNA片段。
[0010]作为优选，步骤4所述扩增为套式两轮PCR。
[0011]本发明的目的之二是提供含有新的桑螟β-FFase基因的重组质粒pET_24b/DpSucla及其构建方法。
[0012]为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案:
利用含有酶切位点的引物DpSuclaF和DpSuclaR WlDpSucla的ORF进行PCR扩增，扩增引物DpSuclaF和DpSuclaR分别如SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.10所示；PCR扩增反应条件为:94°C预变性5 min，然后94°C变性40s、58°C退火40s、72°C延伸lmin30s，共30个循环，最后72°C延伸lOmin。将扩增产物和载体pET_24b分别经过及丽Y I和沿ο I双酶切6h，连接后转化到大肠杆菌DH5 α感受态细胞中，挑取单克隆培养后提取重组质粒，即为原核表达质粒 pET_24b/DpSucla。
[0013]本发明的目的之三是提供一种新的来自桑螟的β-FFase，其氨基酸序列如SEQID N0.1所示，其编码基因的核苷酸如SEQ ID N0.2所示。其通过含有新的桑螟β-FFase基因的重组质粒pET-24b/DpSucla转化大肠杆菌BL21之后获得工程菌所实现的。
[0014]为解决上述技术问题的技术方案如下:
构建了一种含有桑螟β-FFase基因的重组质粒pET-24b/DpSucla。将重组质粒转化到大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，挑取单克隆于10 ml LB培养基中，37°C，220rpm，培养12h即获得含有新的桑螟β -FFase基因的重组质粒pET_24b/DpSucla的工程菌。取4ml菌液接种于250ml的LB液体培养基中扩大培养，37°C，220rpm，振荡培养至OD6tltl~0.6-0.8，加入IPTG至终浓度0.5mM，30°C诱导表达10h。将诱导后的菌液于4°C，5000rpm离心5min，收集菌体，超声破碎后SDS-PAGE检测，发现重组蛋白稳定表达并大量存在于可溶性的上清蛋白中。
[0015]本发明还提供了新的来自桑螟的β-FFase的应用，其主要依赖于对新的来自桑螟的β -FFase进行酶活性测试之后对酶活性的确认，该酶活性可以用于对具有β -FFase底物结构的物质进行转化。[0016]本发明还提供了桑螟P -FFase的氨基酸序列与家蚕BmSUCl氨基酸序列进行比对，二者的同源性高达66%，且具有相同预测的酶活性位点，说明桑螟也可以利用体内的^ -FFase来避开桑树乳液中的高浓度生物碱的毒害作用，为利用P -FFase防治桑园害虫提供了重要的理论依据。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1为桑螟P -呋喃果糖苷酶的办5^7<3和家蚕同源基因汝的编码蛋白序列比对。黑色区域为相同的氨基酸，灰色区域为类似性氨基酸，预测的活性位点以向下的箭头标出。
[0018]图2为用含有酶切位点的引物DpSucIaF和DpSucIaR进行PCR扩增得到的含DpSucla ORF的电泳图。
[0019]图3为含有桑螟0 -FFase基因的重组质粒pET_24b/DpSucla酶切验证图。泳道I:pET-24b空载体；泳道2:pET-24b空载体双酶切产物；泳道3:重组质粒；泳道4:重组质粒双酶切产物；M:DNA分子量Marker。
[0020]图4为体外表达重组蛋白DpSUCla的SDS-PAGE电泳图。泳道1:pET_24b空载质粒转化BL21 (DE3)菌诱导表达后的上清蛋白；泳道2:重组质粒pET_24b/DpSucla转化BL21(DE3)菌诱导表达后的上清蛋白；M:蛋白分子量Marker ;箭头所示为目的重组蛋白。
[0021]图5为体外表达重组蛋白DpSUCla的Western blot图。泳道1:pET_24b空载质粒转化BL21 (DE3)菌诱导表达后的上清蛋白；泳道2:重组质粒pET-24b/DpSucla转化BL21 (DE3)菌诱导表达后的未纯化的上清蛋白；泳道3:纯化后的重组蛋白；M:蛋白分子量Marker。箭头所示为 目的重组蛋白。
[0022]图6为重组蛋白DpSUCla在不同pH条件下的酶活性。
【具体实施方式】
[0023]下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，所举实例只用于解释本发明，并非限定本发明的范围。
[0024]下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
[0025]实施例1.桑螟中肠组织总RNA的提取
桑螟iDiaphania py1alis)在安徽农业大学农业园桑园(大杨店)采集,并经过形态学鉴定为桑螟{Diaphania pyloalis) 0将幼虫解剖,取中肠,放入预冷的研钵中,研磨至粉末状，加入Iml的Trizol，混匀后转移到1.5mL离心管中，剧烈震荡。加入200 的氯仿，剧烈震荡30s，室温静置5min ;4° C下12000 X g离心15min，取上清约400 移到新的去RNA酶管，加入等体积的异丙醇，上下颠倒几次混匀，冰上静置15-20min ;4° C下12000Xg离心15 min,去尽上清后加入Iml预冷的75%的乙醇清洗2次后4° C，12000 X g离心5min得到沉淀，使其自然干燥后，加入适量DEPC水溶解RNA沉淀即得到桑螟中肠组织总RNA，-80°C保存。
[0026]实施例2.桑螟P-FFase编码基因的克隆及氨基酸序列分析
2.1桑螟中肠cDNA的获得
以实施例1获得的桑螟中肠组织总RNA为模版，利用逆转录合成cDNA第一链(以下各逆转录所用试剂均来自于试剂盒TransScript II First-Strand cDNA SynthesisSuperMix,购自北京全式金生物技术有限公司)。
[0027]在微量离心管中配置下列模版RNA/Primer反应液:
总 RNAI Ug
Oligo (dT) 2。引物(0.5 μ g/μ l)1μl
2 X TS II Reaction MIX1μl
TransScript II RT/RI Enzyme Mix1μl
RNase-free Waterto 20 μl
混合后 55°C孵育 30min,再 85°C加热 5 min 失活 TransScript II RT。
[0028]2.2桑螟β -FFase基因的克隆
依据蔗糖水解酶32家族的保守性，设计一对简并引物SUCdgpF (如SEQ ID N0.3所示)和SUCdgpR (如SEQ ID N0.4所示)进行PCR扩增。
[0029]用逆转录的cDNA为模版，使用简并引物SUCdgpF和SUCdgpR为引物，PCR其反应条件为:94°C预变性5min，然后94°C变性40s、48°C退火lmin、72°C延伸lmin30s，共30个循环，最后72°C延伸IOmin。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(Sangon)回收。将该DNA片段连接到pMD19_T载体(TaKaRa)，转化到大肠杆菌DH5a感受态细胞中，挑取阳性克隆送到上海立菲生物技术有限公司测序，得到557bp桑螟β -FFase基因的保守序列片段。
[0030]根据已经获得的保守片段设计基因特异性引物。
[0031]RACE 引物:5’ RACE 外引物 DpSucla_5RAgsp，如 SEQ ID N0.5 所示，
5’ RACE 内引物 DpSucla-5RAngsp，如 SEQ ID N0.6 所示，
3，RACE 外引物 DpSucla-3RAgsp，如 SEQ ID N0.7 所示，
3’ RACE 内引物 DpSucla-3RAngsp，如 SEQ ID N0.8 所示。
[0032]按照GeneRacer ? Kit (Invitrogen)的要求进行桑螟 β-FFase 基因的 5’ RACE和3’ RACE操作。以逆转录获得的cDNA为模板，用设计的5’ RACE和3’ RACE外引物分别进行第一轮PCR扩增。第一次反应体系为20ul，反应条件如下表:
【权利要求】
1.一种桑螟P -呋喃果糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.编码权利要求1所述的一种桑螟P-呋喃果糖苷酶的基因。
3.如权利要求2所述的一种编码桑螟(6-呋喃果糖苷酶的基因，其特征为所述基因序列如SEQ ID N0.2所示。
4.权利要求2或者3所述的一种编码桑螟(6-呋喃果糖苷酶基因在制备重组(6-呋喃果糖苷酶中的应用。
5.权利要求2或者3所述的一种编码桑螟(6-呋喃果糖苷酶基因的制备方法，该方法包括:提取桑螟中肠的总RNA，并反转录成cDNA作为模板，用简并引物克隆获得部分基因序列，然后用RACE方法获得长度为1762bp的cDNA全长基因，序列如SEQ ID N0.2所示，包含一个1467bp完整开放阅读框ORF。
6.如权利要求5所述的一种编码桑螟(6-呋喃果糖苷酶基因的制备方法，其特征在于，所述简并引物和RACE方法用到的RACE引物如下: 简并引物:正向引物SUCdgpF如SEQ ID N0.3所示， 反向引物SUCdgpR如SEQ ID N0.4所示； RACE 引物:5’ RACE 外引物 DpSucla-5RAgsp，如 SEQ ID N0.5 所示，
5’ RACE 内引物 DpSucla-5RAngsp，如 SEQ ID N0.6 所示， 3，RACE 外引物 DpSucla-3RAgsp，如 SEQ ID N0.7 所示，`
3’ RACE 内引物 DpSucla-3RAngsp，如 SEQ ID N0.8 所示。
7.一种含有权利要求2或者3所述的一种编码桑螟P -呋喃果糖苷酶基因办ORF的重组质粒pET-24b/DpSucla，其特征在于，由含有双酶切位点的引物DpSucIaF和DpSuclaR对ORF进行PCR扩增后，将扩增产物和载体pET_24b分别经过及丽7 I和通o I双酶切6h后进行连接获得；所述PCR方法中设计的两种扩增引物DpSuclaF和DpSuclaR分别如 SEQ ID N0.9 和 SEQ ID N0.10 所示。
8.由权利要求7所述的重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞得到的基因工程菌株。
9.一种含有如权利要求1所述的桑螟P -呋喃果糖苷酶的重组蛋白DpSUCla，其特征在于，该重组蛋白是将重组质粒pET-24b/DpSucla转化至BL21感受态细胞，经扩大培养和诱导表达，超声破碎后纯化获得可溶性的重组蛋白。
10.如权利要求1所述的桑螟(6-呋喃果糖苷酶的应用，所述应用为利用桑螟(6-呋喃果糖苷酶的活性对具有3-呋喃果糖苷酶底物结构的物质进行转化。
【文档编号】C12N9/26GK103773748SQ201410031951
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2014年1月23日 优先权日:2014年1月23日
【发明者】孟艳, 李静, 高俊山, 戴伟宏, 张蕾 申请人:安徽农业大学