一种鸡金银羽位点基因型的分子鉴定方法
【专利摘要】本发明公开了一种鸡金银羽位点基因型的分子鉴定方法，其步骤：A、根据鸡SLC45A2基因的DNA序列设计引物；B、以引物对M4-S/A为扩增引物建立15μL体系；C、琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物；D、限制性内切酶酶切；E、聚丙烯酰胺凝胶电泳检测酶切产物；F、银染显示电泳结果，根据条带的大小和数目判定结果；G、在公鸡中，条带为64bp和16bp则为金羽纯合子（ZsZs）；条带为64bp、55bp和16bp则为银羽杂合子（ZSZs）；条带为55bp和16bp则为银羽纯合子（ZSZS）；H、在母鸡中，条带为64bp和16bp则为金羽半合子（ZsW）；条带为55bp和16bp则为银羽半合子（ZSW）。方法易行，操作简便，不受遗传背景的限制，应用范围广泛。能够鉴定出不同个体在金银羽位点上的基因型。
【专利说明】—种鸡金银羽位点基因型的分子鉴定方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及鸡遗传育种中分子标记应用领域，具体涉及一种鸡金银羽位点基因型的分子鉴定方法。
【背景技术】
[0002]初生雏鸡的雌雄鉴别在养鸡生产中有着重要的意义，在肉鸡生产中雏鸡出壳时鉴别雌雄有利于公母分养，便于根据公母不同的生长发育速度、营养需求给予不同的饲料和饲养管理条件，避免公雏发育快，抢食而影响母雏发育；在商品蛋鸡生产中雏鸡出壳时即淘汰公雏可节省饲养公雏的空间和成本，提高母鸡的成活率和整齐度；对于种鸡可通过鉴别雌雄、只出售不同品系单一性别的雏鸡保护育种成果。雏鸡的性别鉴定方法大体分为两类:一类根据雌雄雏鸡的生殖器官的差异，通过对生殖突起或性腺的直接观察来鉴定，包括器械鉴别法、翻肛鉴别法等；另一类利用鸡性连锁基因的伴性交叉遗传现象，使用带有特定伴性基因基因型的品种或品系进行杂交生产自别雌雄配套系，通过杂交后代雏鸡绒羽的颜色、浅色斑块的大小或不同的羽毛生长速度来鉴别雏鸡性别。自别雌雄相对直接观察法(如翻肛法，器械鉴别法)有鉴别速度快，准确率高，不需要对鉴别人员进行专门的技术培训，对雏鸡损伤小，交叉感染疾病的可能性小的优点。目前在自别雌雄配套系生产中应用的伴性基因有快慢羽基因、金银羽基因和横斑基因。在利用这些基因的自别雌雄方法中，利用金银羽基因自别雌雄可直接通过雏鸡绒羽颜色区分雌雄，更为简单直观，没有时间的限制，而且准确率更高，具有更好的利用价值。利用金银羽基因进行自别雌雄时，使用金羽公鸡与银羽母鸡交配，所生后代公雏绒羽为白色，母雏绒羽为红色。目前金银羽自别雌雄配套系已广泛应用于来源于洛岛红一洛岛白遗传背景的褐壳蛋鸡配套系中，但在其他遗传背景的鸡群中罕见应用，一个重要原因是金银羽位点上等位基因的表达很大程度上受其他位点(如E位点等)上的修饰基因影响，因而在一些遗传背景下很难准确鉴定个体金银羽表型(进而鉴定基因型)。采用本发明的金银羽位点基因型分子鉴定方法，可以在不同鸡种群体中挑选出在金银羽位点基因型不同的公鸡和母鸡进行繁育，从而达到在其他遗传背景下也能利用金银羽基因进行自别雌雄的目的。本发明建立的方法可以快速、简便、准确的鉴定不同个体金银羽位点上的基因型，有助于金银羽自别雌雄技术更广泛的推广和应用。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供了一种鸡金银羽位点基因型的分子鉴定方法，方法易行，操作简便，在金银羽自别雌雄配套系中，雏鸡的绒羽颜色仅凭肉眼观察确定，而银羽杂合子和银羽纯合子表型相同，肉眼无法区分，而此分子鉴定方法可以区分杂合子和纯合子。目前金银羽自别雌雄配套系已广泛应用于来源于洛岛红一洛岛白遗传背景的褐壳蛋鸡配套系中，但在其他遗传背景的鸡群中罕见应用，一个重要原因是金银羽位点上等位基因的表达很大程度上受其他位点上的修饰基因影响，因而在一些遗传背景下很难准确鉴定个体金银羽表型(进而鉴定基因型)。而此分子鉴定方法不受遗传背景的限制，应用范围广泛。能够鉴定出不同个体在金银羽位点上的基因型。
[0004]为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施:
一种鸡金银羽位点基因型的分子鉴定方法，其步骤是:
A、利用软件primer premier 5.0,根据鸡SLC45A2基因的DNA序列设计引物对 M4-S/A，引物长度为 22bp:M4-S:5’ ATCCCATTATCGCTGTCTGCAT 3’，M4-A:5’AATCCGTGAAGAAGAGCATAGT 3’ ；一种分离的DNA序列，其序列为SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
[0005]B、以引物对M4-S/A为扩增引物建立15yL体系如下:1.5yL IOXEasyTaqBuffer (+Mg2+), 0.3 μ L 正反引物(10 μ Μ)，0.15 μ L 的 dNTP (2.5mM), 0.5U 的 Taq 聚合酶，I μ L的基因组DNA，加超纯水补齐至15 μ L ;反应程序为94°C预变性5min，94°C变性30s，53°C退火30s，72。。延伸30s，35个循环，72°C再延伸5min，15°C，lmin，4°C下保存备用；
C、电泳检测PCR产物:取6 yL PCR产物，加3μ L 6 X Loading Buffer，制备浓度为1.2 %的琼脂糖凝胶，点样后，在120V电压下电泳40min，溴化乙锭染色，凝胶成像仪检测，根据条带的有无及大小判定是否扩增成功。
[0006]D、限制性内切酶酶切:酶切的反应体系为:超纯水3.6μ L，IOXbufferG 0.5 μ L,内切酶4U，PCR产物I μ L。于37°C酶切16h。
[0007]E、聚丙烯酰胺凝胶电泳检测酶切产物:采用40%、交联度为19:1的聚丙烯酰胺，配制为16%聚丙烯酰胺的凝胶，体系为:聚丙烯酰胺18 mL,5XTBE 9 mL，超纯水18 mL, 10%AP350 μ L, TEMED 35 μ L。先 300V 电泳 IOmin,再 120V 电泳 5.5h。
[0008]F、银染显示电泳结果，根据条带的大小和数目判定结果:银染步骤如下:超纯水漂洗两遍，10%的无水乙醇漂洗IOmin ;超纯水漂洗两遍，1%的硝酸漂洗IOmin ;超纯水漂洗两遍，为0.2%的硝酸银加750 μ L甲醒避光漂洗20min ;超纯水漂洗两遍,3%的氢氧化钠加ImL甲醛漂洗直至出现清晰条带；超纯水漂洗两遍，3%乙酸终止显色；换超纯水，拍照记录分析结果。
[0009]G、在公鸡中，若条带为64bp和16bp则为金羽纯合子(ZsZs);若条带为64bp、55bp和16bp则为银羽杂合子(ZsZs);若条带为55bp和16bp则为银羽纯合子(ZsZs)；
H、在母鸡中，若条带为64bp和16bp则为金羽半合子(ZsW);若条带为55bp和16bp则为银羽半合子(ZsW)。
[0010]atcccattat cgctgtctgt gtgtgagcca cctctttgga tggatggctt tcctgtccaa 60
catgctcttc ttcacggatt80
下划线标注的为SNP位点。
[0011]在公鸡中，若基因型为金羽纯合子，则该位点为C/C;若为银羽纯合子，则该位点为A/A ;若为银羽杂合子，则该位点为C/A。
[0012]在母鸡中，若基因型为金羽半合子，则该位点为C/-;若为银羽半合子，则该位点为 A/-。
[0013]采用苯?)—氯仿法提取待鉴定鸡的DNA，也可采用盐析法等其他方法提取DNA。所提取的DNA用于扩增基因SLC45A2的部分序列。
[0014]SLC45A2所编码的蛋白 为膜相关转运蛋白，含有12个跨膜区，与色素的合成有关。可能与TYR、TYRPl从高尔基体转运到II期的黑色素小体这个过程有关。SLC45A2的突变可能会影响上述转运过程，进而影响伪黑色素的合成但对真黑色素的合成没有影响，最终导致鸡的红黄色羽毛变成白色。
[0015]本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果:
可以在不同鸡种群体中挑选出在金银羽位点基因型不同的公鸡和母鸡进行繁育，从而达到在其他遗传背景下也能利用金银羽基因进行自别雌雄的目的。本发明建立的方法可以快速、简便、准确的鉴定不同个体金银羽位点上的基，有助于金银羽自别雌雄技术更广泛的推广和应用。
[0016]在金银羽自别雌雄配套系中，使用金羽公鸡与银羽母鸡交配，所生后代公雏绒羽为白色，母雏绒羽为红色。雏鸡绒羽的颜色仅通过肉眼观察确定，银羽纯合子和银羽杂合子的表型一致，无法通过肉眼区别。而此分子鉴定方法可区分杂合子与纯合子。目前金银羽自别雌雄配套系已广泛应用于来源于洛岛红一洛岛白遗传背景的褐壳蛋鸡配套系中，但在其他遗传背景的鸡群中罕见应用，一个重要原因是金银羽位点上等位基因的表达很大程度上受其他位点上的修饰基因影响，因而在一些遗传背景下很难准确鉴定个体金银羽表型(进而鉴定基因型)。而分子鉴定方法不受遗传背景的限制。在除洛岛红一洛岛白以外的遗传背景下，可先利用此分子鉴定方法确定个体的基因型，然后在相同基因型的个体之间找出表型上的共同点，并找出影响其表型的修饰基因，从而达到在其他的遗传背景条件下也能够采用金银羽自别雌雄。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1为一种鸡金银羽位点基因型的分子鉴定方法流程图。
[0018]图2为一种金 银羽配套系京红鸡DNA的PCR扩增结果电泳图。
[0019]编号说明如下:
1-4:雌性，金羽，ZsW ； 5-8:雌性，银羽，ZsW 9-12:雄性，金羽，ZsZs ; 13-16:雄性，银羽，ZsZs NC:阴性对照
除阴性对照外，均扩增出80bp的条带。DNA Marker为marker I。
[0020]图3为一种酶切产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染的结果示意图。
[0021]编号说明如下:
1-4:雌性，金羽，ZsW ； 5-8:雌性，银羽，ZsW 9-12:雄性，金羽，ZsZs ； 13-16:雄性，银羽，ZsZs NC:阴性对照
DNA Marker 为 low ladder。
[0022]1-4的条带为64bp和16bp,5_8的条带为55bp和16bp 9-12 的条带为 64bp 和 16bp, 13-16 的条带为 64bp、55bp 和 16bp。
【具体实施方式】
[0023]实施例1:
一种鸡金银羽位点基因型的分子鉴定方法，其步骤是:
1.试样的制备与保存:采集中国湖北省武汉市天牧养殖场的罗曼褐父母代公母鸡及其商品代雏鸡(公母鸡)血样，柠檬酸抗凝剂抗凝，置冰盒带回实验室保存于_20°C冰箱中备用。取60 μ L抗凝血样，采用常规的苯酚-氯仿抽提法提取血样中的0應，将DNA样品保存于4°C冰箱中备用。
[0024]2、引物设计:利用软件primer premier 5.0,根据鸡的SLC45A2基因的DNA序列的8821位到9781位设计引物对M4-S/A，引物长度为22bp:M4_S:5’ATCCCATTATCGCTGTCTGCAT 3’，M4-A:5’ AATCCGTGAAGAAGAGCATAGT 3’；
一种分离的DNA序列，其序列为SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
[0025]3、PCR 扩增:
以引物对M4-S/A为扩增引物建立15μ L体系如下:1.5μ L IOXEasyTaqBuffer (+Mg2+), 0.3 μ L 正反引物(10 μ Μ)，0.15 μ L 的 dNTP (2.5mM), 0.5U 的 Taq 聚合酶，I μ L的基因组DNA，加超纯水补齐至15 μ L ;反应程序为94°C预变性5min，94°C变性30s，53°C退火30s，72。。延伸30s，35个循环，72°C再延伸5min，15°C，lmin，4°C下保存备用；
4、电泳检测PCR产物:
取6 yL PCR产物，加3μ L 6 X Loading Buffer，制备浓度为1.2 %的琼脂糖凝胶，点样后，在120V电压下电泳40min，溴化乙锭染色，凝胶成像系统检测，根据条带的有无及大小判定是否扩增成功。
[0026]5、限制性内切酶酶切:
酶切的反应体系为:超纯水3.6 μ L，10XbufferG 0.5yL，内切酶4U，PCR产物I μ L。于37°C酶切16h。
[0027]6、聚丙烯酰胺凝胶电泳检测酶切产物:
采用浓度为40%、交联度为19:1的聚丙烯酰胺，配制浓度为16%聚丙烯酰胺的凝胶，体系为:聚丙烯酰胺 18 mL,5XTBE 9 mL，超纯水 18 mL, 10%AP 350 μ L, TEMED 35 μ L。先 300V电泳IOmin,再120V电泳5.5h。
[0028]7、银染显示电泳结果，根据条带的大小和数目判定结果:
银染步骤如下:超纯水漂洗两遍，浓度为10%的无水乙醇漂洗IOmin ;超纯水漂洗两遍，1%的硝酸漂洗IOmin ;超纯水漂洗两遍，0.2%的硝酸银加750 μ L甲醛避光漂洗20min ;超纯水漂洗两遍，3%的氢氧化钠加ImL甲醛漂洗直至出现清晰条带；超纯水漂洗两遍，3%乙酸终止显色；换超纯水，拍照记录分析结果。
[0029]8、基因型鉴定:
按照本发明的方法鉴定不同个体的基因型，结果显示:所检测的91只金羽母鸡(商品代)全为金羽半合子(ZSW)，准确率为100% ；71只银羽公鸡(商品代)全为银羽杂合子(ZSZS)，准确率为100% ;65只银羽母鸡(父母代)中64只为银羽半合子(ZSW)，I只为金羽半合子(ZSW)，准确率为98.5% ；71只金羽公鸡(父母代)全为金羽纯合子(ZsZs),准确率为100%。
[0030]实施例2:
一种鸡金银羽位点基因型的分子鉴定方法，其步骤是:
1.试样的制备与保存:
采集中国湖北省荆州市峪口禽业有限公司的京红父母代公母鸡及其商品代雏鸡(公母鸡)血样，柠檬酸抗凝剂抗凝，置冰盒带回实验室保存于-20°C冰箱中备用。取60 μ L抗凝血样，采用常规的苯酚-氯仿抽提法提取血样中的DNA，将DNA样品保存于4°C冰箱中备用。[0031]2、引物设计:利用软件primer premier 5.0，根据鸡SLC45A2基因的DNA序列设计引物对 M4-S/A，引物长度为 22bp:M4_S:5’ ATCCCATTATCGCTGTCTGCAT 3’，M4-A:5’AATCCGTGAAGAAGAGCATAGT 3，；
一种分离的DNA序列，其序列为SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
[0032]3、PCR 扩增:
以引物对M4-S/A为扩增引物建立15μ L体系如下:1.5μ L IOXEasyTaqBuffer (+Mg2+), 0.3 μ L 正反引物(10 μ Μ)，0.15 μ L 的 dNTP (2.5mM), 0.5U 的 Taq 聚合酶，I μ L的基因组DNA，加11.65 μ L超纯水补齐至15 μ L ;反应程序为94°C预变性5min，94°C变性30s, 53°C退火30s, 72°C延伸30s, 35个循环，72°C再延伸5min, 15。。，lmin, 4°C下保存备用。
[0033]4、电泳检测PCR产物
取6 yL PCR产物，加3μ I 6 X Loading Buffer，制备浓度为1.2 %的琼脂糖凝胶，在120V的电压下电泳40min，溴化乙锭染色，凝胶成像系统检测，根据条带的有无及大小判定是否扩增成功。
[0034]5、限制性内切酶酶切
酶切的反应体系为: 超纯水3.6 μ L，10XbufferG 0.5yL，内切酶4U，PCR产物I μ L。于37°C酶切16h。
[0035]6、聚丙烯酰胺凝胶电泳检测酶切产物
采用40%、交联度为19:1的聚丙烯酰胺，配制16%的凝胶，体系为:聚丙烯酰胺18 mL,5 X TBE 9 mL，超纯水 18 mL, 10%AP 350 μ L, TEMED 35 μ L。先 300V 电泳 lOmin，再 120V 电泳 5.5h。
[0036]7、银染显示电泳结果，根据条带的大小和数目判定结果
银染步骤如下:超纯水漂洗两遍，10%无水乙醇漂洗IOmin ;超纯水漂洗两遍，1%硝酸漂洗IOmin ;超纯水漂洗两遍,0.2%硝酸银加750 μ L甲醒避光漂洗20min ;超纯水漂洗两遍，3%氢氧化钠加ImL甲醛漂洗直至出现清晰条带；超纯水漂洗两遍，3%乙酸终止显色，换超纯水。拍照记录分析结果。
[0037]8、基因型鉴定。
[0038]按照本发明的方法鉴定不同个体的基因型，结果显示:所检测的42只金羽母鸡(商品代)全为金羽半合子(Zsw)，准确率为100% ；37只银羽公鸡(商品代)全为银羽杂合子(ZsZs),准确率为100% ；40只银羽母鸡(父母代)全为银羽半合子(ZSW)，准确率为100% ； 40只金羽公鸡(父母代)全为金羽纯合子(ZsZs),准确率为100%。
[0039]实施例3:
一种鸡金银羽位点基因型的分子鉴定方法，其步骤是:
1.试样的制备与保存:
采集中国湖北省恩施市的景阳鸡(景阳鸡羽色:不论雏鸡还是成年鸡，均有两种类型，一种是粟麻，一种是黄麻。粟麻公母鸡项羽、主翼羽、主尾羽末端羽毛为黑色，其他为粟麻色，背羽、腹羽，鞍羽为浅粟麻色。黄麻羽公鸡羽色红亮，项羽、主翼羽、主尾羽末端为黑色，背羽、腹羽、鞍羽等其他部位为黄麻色，母鸡全身羽毛为浅黄麻色。)血样，柠檬酸抗凝剂抗凝，置冰盒带回实验室保存于_20°C冰箱中备用。取60 μ L抗凝血样，采用常规的苯酚-氯仿抽提法提取血样中的DNA，将DNA样品保存于4°C冰箱中备用。
[0040]2、引物设计:利用软件primer premier 5.0,根据鸡SLC45A2基因的DNA序列设计引物对 M4-S/A，引物长度为 22bp:M4_S:5’ ATCCCATTATCGCTGTCTGCAT 3’，M4-A:5’AATCCGTGAAGAAGAGCATAGT 3’。一种分离的DNA序列，其序列为SEQ ID N0.1所示的核苷
酸序列。
[0041]3、3、PCR 扩增:
以引物对M4-S/A为扩增引物建立15μ L体系如下:1.5μ L IOXEasyTaqBuffer (+Mg2+), 0.3 μ L 正反引物(10 μ Μ)，0.15 μ L 的 dNTP (2.5mM), 0.5U 的 Taq 聚合酶，I μ L的基因组DNA，加11.65 μ L超纯水补齐至15 μ L ;反应程序为94°C预变性5min，94°C变性30s, 53°C退火30s, 72°C延伸30s, 35个循环，72°C再延伸5min, 15。。，lmin, 4°C下保存备用;
4、电泳检测PCR产物:
取6 μ L PCR产物，加3 μ I 6XLoading Buffer, 1.2 %的琼脂糖凝胶电泳，120V,40min，溴化乙锭染色，凝胶成像系统(美国伯乐公司)检测，根据条带的有无及大小判定是否扩增成功。
[0042]5、限制性内切酶酶切:
酶切的反应体系为:超纯水3.6 μ L，10XbufferG 0.5yL，内切酶4U，PCR产物I μ L。于37°C酶切16h。
[0043]6、聚丙烯酰胺凝胶电泳检测酶切产物:
采用40%、19:1的聚丙烯酰胺，配制16%的凝胶，体系为:聚丙烯酰胺18 mL,5XTBE 9mL,超纯水 18 mL, 10%AP 350 μ L, TEMED 35 μ L。先 300V 电泳 lOmin,再 120V 电泳 5.5h。
[0044]7、银染显示电泳结果，根据条带的大小和数目判定结果:
银染步骤如下:超纯水漂洗两遍，10%无水乙醇漂洗IOmin ;超纯水漂洗两遍，1%硝酸漂洗IOmin ;超纯水漂洗两遍,0.2%硝酸银加750 μ L甲醒避光漂洗20min ;超纯水漂洗两遍，3%氢氧化钠加ImL甲醛漂洗直至出现清晰条带；超纯水漂洗两遍，3%乙酸终止显色；换超纯水，拍照记录分析结果。
[0045]8、基因型鉴定。
[0046]按照本发明的方法鉴定不同个体的基因型，结果显示:所检测的17只黄麻公鸡全为金羽纯合子(ZsZs) ；24只黄麻母鸡全为金羽半合子(ZsW) ；27只粟麻公鸡中，13只为银羽杂合子(ZsZs), 13只为银羽纯合子(ZSZS)，I只为金羽纯合子(ZsZs) ；30只粟麻母鸡中，23只为银羽半合子(ZsW)，7只为金羽半合子(ZsW)。
[0047]实施例4:
一种鸡金银羽位点基因型的分子鉴定方法，其步骤是:
1.试样的制备与保存:
采集中国湖北省安陆市欣华鸡血样，柠檬酸抗凝剂抗凝，置冰盒带回实验室保存于_20°C冰箱中备用。取60 μ L抗凝血样，采用常规的苯酚-氯仿抽提法提取血样中的DNA，将DNA样品保存于4 C冰箱中备用。
[0048]2、引物设计:利用软件primer premier 5.0,根据鸡基因的DNA序列设计引物对 M4-S/A，引物长度为 22bp:M4_S:5’ ATCCCATTATCGCTGTCTGCAT 3’，M4-A:5’AATCCGTGAAGAAGAGCATAGT 3’ ；一种分离的DNA序列，其序列为SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
3、PCR扩增:
以引物对M4-S/A为扩增引物建立15μ L体系如下:1.5μ L IOXEasyTaqBuffer (+Mg2+), 0.3 μ L 正反引物(10 μ Μ)，0.15 μ L 的 dNTP (2.5mM), 0.5U 的 Taq 聚合酶，
Iμ L的基因组DNA，加11.65 μ L超纯水补齐至15 μ L ;反应程序为94°C预变性5min，94°C变性30s, 53°C退火30s, 72°C延伸30s, 35个循环，72°C再延伸5min, 15。。，lmin, 4°C下保存备用;
4、电泳检测PCR产物:
取6 yL PCR产物，加3μ I 6 X Loading Buffer, 1.2 %的琼脂糖凝胶电泳，120V，40min，溴化乙锭染色，凝胶成像系统检测，根据条带的有无及大小判定是否扩增成功。
[0049]5、限制性内切酶酶切:
酶切的反应体系为:超纯水3.6 μ L，10 XbufferG 0.5 μ L ，内切酶4U, PCR产物I μ L。于37°C酶切16h。
[0050]6、聚丙烯酰胺凝胶电泳检测酶切产物
采用40%、19:1的聚丙烯酰胺，配制16%的凝胶，体系为:聚丙烯酰胺18 mL,5XTBE 9mL,超纯水 18 mL, 10%AP 350 μ L, TEMED 35 μ L。先 300V 电泳 lOmin,再 120V 电泳 5.5h。
[0051]7、银染显示电泳结果，根据条带的大小和数目判定结果:
银染步骤如下:超纯水漂洗两遍，10%无水乙醇漂洗IOmin ;超纯水漂洗两遍，1%硝酸漂洗IOmin ;超纯水漂洗两遍,0.2%硝酸银加750 μ L甲醒避光漂洗20min ;超纯水漂洗两遍，3%氢氧化钠加ImL甲醛漂洗直至出现清晰条带；超纯水漂洗两遍，3%乙酸终止显色；换超纯水，拍照记录分析结果。
[0052]8、基因型鉴定: 按照本发明的方法鉴定不同个体的基因型，结果显示:所检测的40只欣华鸡全部为金羽纯合子(ZsZs)或金羽半合子(ZsW)。
[0053]实施例5:
一种鸡金银羽位点基因型的分子鉴定方法，其步骤是:
1.试样的制备与保存:
采集中国湖北省十堰市的郧阳白羽乌鸡公鸡(产于湖北省郧县，羽色为全白，均为隐性白羽纯合子)精液，用精液保存液保存，置冰盒带回实验室保存于_20°C冰箱中备用。取60 μ L抗凝血样，采用常规的苯酚-氯仿抽提法提取血样中的DNA，将DNA样品保存于4°C冰箱中备用。
[0054]2、引物设计:利用软件primer premier 5.0,根据鸡基因的DNA序列设计引物对 M4-S/A，引物长度为 22bp:M4_S:5’ ATCCCATTATCGCTGTCTGCAT 3’，M4-A:5’AATCCGTGAAGAAGAGCATAGT 3’ ；一种分离的DNA序列，其序列为SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
[0055]3、PCR 扩增:
以引物对M4-S/A为扩增引物建立15μ L体系如下:1.5μ L IOXEasyTaqBuffer (+Mg2+), 0.3 μ L 正反引物(10 μ Μ)，0.15 μ L 的 dNTP (2.5mM), 0.5U 的 Taq 聚合酶，Iμ L的基因组DNA，加11.65 μ L超纯水补齐至15 μ L ;反应程序为94°C预变性5min，94°C变性30s, 53°C退火30s, 72°C延伸30s, 35个循环，72°C再延伸5min, 15。。，lmin, 4°C下保存备用。
[0056]4、电泳检测PCR产物:
取6 μ L PCR产物，加3 μ I 6XLoading Buffer, 1.2 %的琼脂糖凝胶电泳，120V,40min，溴化乙锭染色，凝胶成像系统检测，根据条带的有无及大小判定是否扩增成功。
[0057]5、限制性内切酶酶切:
酶切的反应体系为:超纯水3.6 μ L，10XbufferG 0.5yL，内切酶4U，PCR产物I μ L。于37°C酶切16h。
[0058]6、聚丙烯酰胺凝胶电泳检测酶切产物:
采用40%、19:1的聚丙烯酰胺，配制16%的凝胶，体系为:聚丙烯酰胺18 mL,5XTBE 9mL,超纯水 18 mL, 10%AP 350 μ L, TEMED 35 μ L。先 300V 电泳 lOmin,再 120V 电泳 5.5h。
[0059]7、银染显示电泳结果，根据条带的大小和数目判定结果:
银染步骤如下:超纯水漂洗两遍，10%无水乙醇漂洗IOmin ;超纯水漂洗两遍，1%硝酸漂洗IOmin ;超纯水漂洗两遍,0.2%硝酸银加750 μ L甲醒避光漂洗20min ;超纯水漂洗两遍，3%氢氧化钠加ImL甲醛漂洗直至出现清晰条带；超纯水漂洗两遍，3%乙酸终止显色；换超纯水，拍照记录分析结果。
[0060]8、基因型鉴定:
按照本发明的方法鉴定不同个体的基因型，结果显示:所检测的36只雄性郧阳白羽乌鸡中，33只为金羽纯合子(ZsZs )，3只为银羽杂合子(ZsZs)。
【权利要求】
1.一种分离的DNA序列，其序列为SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
2.权利要求1所述的一种鸡金银羽位点基因型的分子鉴定方法，其步骤是: 利用软件primer premier 5.0,根据鸡基因的DNA序列设计引物对M4-S/Α，引物长度为 22bp，引物序列为:M4-S:5’ ATCCCATTATCGCTGTCTGCAT 3’，M4-A:5’AATCCGTGAAGAAGAGCATAGT 3，； 以引物对M4-S/A为扩增引物建立15μ L体系如下:1.5μ L IOXEasyTaqBuffer (+Mg2+), 0.3 μ L 正反引物(10 μ Μ)，0.15μ L 的 dNTP (2.5mM),0.5U 的 Taq 聚合酶，.1 μ L的基因组DNA，加超纯水补齐至15 μ L ;反应程序为94°C预变性5min，94°C变性30s，53°C退火30s，72。。延伸30s，35个循环，72°C再延伸5min，15°C，lmin，4°C下保存备用； 电泳检测PCR产物:取6 μ L PCR产物，加3μ L 6 X Loading Buffer，制备浓度为1.2%的琼脂糖凝胶，点样后，在120V电压下电泳40min，溴化乙锭染色，凝胶成像系统检测，根据条带的有无及大小判定是否扩增成功； 限制性内切酶酶切:酶切的反应体系为:超纯水3.6μ L，IOXbufferG 0.5 μ L,内切酶4U, PCR 产物 I μ L，于 37°C酶切 16h ； 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测酶切产物:采用浓度为40%、交联度为19:1的聚丙烯酰胺，配制浓度为16%的聚丙烯酰胺凝胶，体系为:聚丙烯酰胺18 mL，5XTBE 9 mL，超纯水18 mL,10%AP 350 μ L, TEMED 35 μ L，先 300V 电泳 lOmin，再 120V 电泳 5.5h ； 银染显示电泳结果，根据条带的大小和数目判定结果:银染步骤如下:超纯水漂洗两遍，10%的无水乙醇漂洗1Omin ;超纯水漂洗两遍，1%的硝酸漂洗IOmin ;超纯水漂洗两遍，.0.2%的硝酸银加750 μ L甲醒避光漂洗20min ;超纯水漂洗两遍,3%的氢氧化钠加ImL甲醛漂洗直至出现清晰条带；超纯水漂洗两遍，3%乙酸终止显色；换超纯水，拍照记录分析结果; 在公鸡中，条带为64bp和16bp则为金羽纯合子:ZSZS ;条带为64bp、55bp和16bp则为银羽杂合子=ZsZs ;条带为55bp和16bp则为银羽纯合子:ZSZS ； 在母鸡中，条带为64bp和16bp则为金羽半合子:ZSW ;条带为55bp和16bp则为银羽半合子-.ZsI
【文档编号】C12Q1/68GK103789305SQ201410032115
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年1月23日 优先权日:2014年1月23日
【发明者】龚炎长, 王莹, 彭秀丽, 李世军, 俸艳萍 申请人:华中农业大学