一种构建TAL效应子和TALENs的简化方法及质粒的制作方法【专利摘要】本发明公开了一种构建TAL效应子和TALENs的简化方法及质粒，具体是通过研究发现dTALE的半个重复(LHR)是可以省略的，因而设计并构建了一个通用的RAR质粒pSK-RAR-U。由于通用RAR质粒pSK-RAR-U能够接受任何一个通过单元装配法组装的dTALE重复区，进而构建dTALEs表达载体的方法简化为：第一步为dTALE重复区序列组装，第二步为将dTALE重复区序列克隆到pSK-RAR-U中。本发明优点是为dTALEs和TALENs的构建提供了更简便的方法，节约时间和成本。【专利说明】—种构建TAL效应子和TALENs的简化方法及质粒【
技术领域：
】[0001]本发明属于生物【
技术领域：
】，涉及一种构建TAL效应子和TALENs的构建方法及其相应的质粒。【
背景技术：
】[0002]黄单胞杆菌属(Xanthomonas)的多个致病变种，在多种作物上造成严重的病害，包括辣椒和番茄的细菌性斑点病、水稻的白叶枯病和细菌性条斑病[I]。TAL效应子(TranscriptionactivatorLikeeffector,TALE)作为黄单胞杆菌的蛋白类效应子之一，能够通过三型分泌系统(TypeIIIsecretionsystem,TTSS)进入植物的细胞核,并与特定基因启动子DNA结合，类似于真核生物转录因子，启动植物基因的表达，以控制植物的生理生化进程，促进病害发生[2]。黄单胞杆菌通过进化产生一系列的TAL效应子以利于在寄主上的定殖和传播，而寄主植物亦进化出一系列的抗病策略以抑制该病原菌引起的病害。因此针对不同的寄主植物的基因型，TAL效应子既有可能是毒性因子，也可能是无毒因子。近年来关于黄单胞杆菌TAL效应子的研究有许多新进展，尤其是TAL效应子与寄主DNA特异性识别的分子密码的破解，并由此研发出的可对生物基因组进行定点激活、敲出或修饰的dTALEs(designerTALEs)和TALENs(TALEnuclease)技术，已成为生物技术研究和利用的前沿热点之一[3]。[0003]天然的TALEs家族蛋白具有结构的相似性:1)N端高度保守，其mRNA水平上存在着TTSS分泌信号；2)C端含有亮氨酸拉链结构(Leucinezipper,LZ)、核定位信号(Nuclearlocalizationsignals,NLSs)和酸性转录激活域(Acidicactivationdomain,AD)；3)中间为多个串联重复单元组成的串联重复区，每个重复单元含有34个氨基酸，其中第12和13位氨基酸高度可变，被称为重复可变区(Repeat-variablediresidue,RVD)[I]。目前鉴定的TALEs的34个氨基酸的重复单元数目变幅为1.5到33.5个，重复单元的数目和顺序决定了TALEs的特异性。每一个重复单元识别一个特异的DNA碱基，且这种识别由每一个重复单元的第12和第13个氨基酸残基决定[4，5]。第12和13位双连氨基酸识别DNA碱基的规律为:NG识别T，HD识别C，NI识别A，NK或NN识别G[5，6]。TALEs通过结合目标基因的启动子激活寄主基因的表达。[0004]根据天然TALEs的DNA识别密码，用TALE的34个氨基酸重复单元模块就可以装配组建成一个TALE的中间重复区或DNA结合域[7]。根据需要在基因组中选择一段DNA序列作为靶点，设计者就可以装配出能够识别这段DNA序列的TALE(dTALE)，也可进一步将dTALE的转录激活域(AD)换成非特异性核酸内切酶FokI从而构建成反因子核酸酶TALENs(TALEnucleases)[8,9]。dTALE技术和TALENs技术已分别成为基因定点激活与基因组定点编辑的有力工具[10，11，12]。这种基因的定点编辑已经在酵母、果蝇、蛔虫、斑马鱼、老鼠、猪、牛、拟南芥、水稻、蚕、人类躯体及干细胞等中得到证明[13]。[0005]奇怪的是所有天然的TALEs在重复可变区末端都含一个仅有19-20个氨基酸的半个重复单元，称之为LHR(last-half-repeat)[3],LHR的存在可能意味着既是进化的原点也可能是TALEs生物功能的必需。因为每一个天然的TALEs都有一个LHR，导致每一个报道的dTALE或TALEN在装配的DNA结合区也都含有一个LHR[6,8，9，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27]。因此，从此前的研究及报道来看，研究人员似乎都认为这半个重复(LHR)在DNA结合与基因激活中是必需的。为了使dTALE或TALEN含有LHR，在重复模块装配过程中，需要单独合成4个LHRs(分别带有RVDs以识别‘A’，‘C’，‘T’和‘G’)[22]，或是构建4种分别含有编码LHRs(分别带有识别‘A’，‘C’，‘T’和‘G’的RVDs)之一的骨架载体[25，26，28]。这显然增加了构建dTALEs或TALENs的复杂性及费用。[0006]参考文献[0007][I]BochJjBonasU(20IO)XanthomonasAvrBs3family-typeIIIeffectors:discoveryandfunction.AnnualReviewofPhytopathology48(I):419-436.[0008][2]李岩强，王春连，赵开军(2011)病原细菌TAL效应子与寄主靶基因识别的分子密码，生物工程学报，27(8):1132-1141。[0009][3]赵开军杨兵，(2012)TALENs:植物基因组定点编辑的分子剪，中国农业科学，45(14):2787-2792.[0010][4]DoyleELjStoddardBLjVoytasDFjBogdanoveAJ.(2013)TALeffectors:highlyadaptablephytobacterialvirulencefactorsandreadilyengineeredDNA-targetingproteins.TrendsCellBiol.23(8):390-398.[0011][5]MoscouMJjBogdanoveAJ(2009)AsimpleciphergovernsDNArecognitionbyTALeffectors.Science326:1501.[0012][6]BochJjScholzeHjSchornackSjLandgrafA,HahnS，etal.(2009)BreakingthecodeofDNAbindingspecificityofTAL-typeIIIeffectors.Science326:1509-1512.[0013][7]MorbitzerRjRomerP，BochJjLahayeT(2010)Regulationofselectedgenomelociusingdenovo-engineeredtranscriptionactivator-1ikeeffector(TALE)-typetranscriptionfactors.ProcNatlAcadSciUSA107:21617-21622.[0014][8]ChristianMjCermakTjDoyleELjSchmidtC，ZhangF，etal.(2010)TargetingDNAdoubIe-strandbreakswithTALeffectornucleases.Genetics186:757-761.[0015][9]LiT，HuangS，JiangWZjWrightD，SpaldingMH，etal.(2011)TALnucleases(TALNs):HybridproteinscomposedofTALeffectorsandFokIDNA-cleavagedomain.NucleicAcidsResearch39(I):359-372.[0016][10]MakAN,BradleyPjBogdanoveAJjStoddardBL(2013)TALeffectors:function,structure,engineeringandapplications.CurrOpinStructBiol23(l):93-99(do1:10.1016/j.sb1.2012.11.001).[0017][11]LiT，HuangS，ZhouJ，YangB(2013)DesignerTALeffectorsinducediseasesusceptibilityandresistancetoXanthomonasoryzaepv.0ryzaeinrice.MolPlant6(3):781-789(do1:10.1093/mp/sst034).[0018][12]RichterA，BochJ(2013)DesignerTALEsteamupforhighlyefficientgeneinduction.NatMethodslO(3):207-208(do1:10.1038/nmeth.2373).[0019][13]JoungJK，SanderJD(2013)TALENs:awidelyapplicabletechnologyfortargetedgenomeediting.NatRevMolCellBiol14(I):49-55(do1:10.1038/nrm3486).[0020][14]LiuJjLiC，YuZ，HuangPjWuH，etal.(2012)EfficientandspecificmodificationsoftheDrosophilagenomebymeansofaneasyTALENstrategy.JGenetGenom39:209-215.[0021][15]WoodAJjLoTWjZeitlerB，PickleCS，RalstonEJjetal.(2011)TargetedgenomeeditingacrossspeciesusingZFNsandTALENs.Science333:307.[0022][16]SanderJD，CadeLjKhayterCjReyonDjPetersonRTjetal.(2011)TargetedgenedisruptioninsomaticzebrafishcellsusingengineeredTALENs.NatureBiotechnology29:697-698.[0023][17]HuangP，XiaoA，ZhouMG，ZhuZYjLinS，etal.(2011)HeritablegenetargetinginzebrafishusingcustomizedTALENs.NatureBiotechnology29:699-700.[0024][18]DahlemTJ，HoshijimaKjJurynecMJjGuntherDjStarkerCGjetal.(2012)SimpleMethodsforGeneratingandDetectingLocus-SpecificMutationsInducedwithTALENsintheZebrafishGenome.PLoSGenet8(8):e1002861,do1:10.1371/journal,pgen.1002861.[0025][19]BedelIVM.WangY，CampbellJM，PoshustaTL,StarkerCGjetal.(2012)Invivogenomeeditingusingahigh-efficiencyTALENsystem.Nature491:114-118(do1:10.1038/naturell537).[0026][20]TessonLjUsalCjMenoretS，LeungE，NilesBJjetal.(2011)KnockoutratsgeneratedbyembryomicroinjectionofTALENs.NatureBiotechnology29:695-696.[0027][21]CarlsonDF，TanWjLillicoSG,StverakovaDjProudfootC，etal.(2012)EfficientTALEN—mediatedgeneknockoutinlivestock.ProcNatlAcadSciUSA109:17382-17387[0028][22]CermakTjDo`yleELjChristianMjWangL，ZhangY，etal.(2011)EfficientdesignandassemblyofcustomTALENandotherTALeffector-basedconstructsforDNAtargeting.NucleicAcidsResearch39:1-1L[002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发明内容】[0039]本发明人通过一系列实验证明上述半个重复是可以省略的，因此可以简化dTALEs或TALENs的装配技术，为dTALEs和TALENs的构建提供了更简便且节约成本的方法。[0040]本发明提供的技术方案是:一种通用载体pSK-RAR-U的构建方法，包括以下步骤:[0041]第一步，以pSK-avrXa23质粒DNA为模板，分别用引物对TalenFl/TalenRl、TalenF2-U/TalenR2进行PCR扩增，将扩增出的两个PCR产物混合作模板，再用引物对TalenFl/TalenR2进行搭桥PCR；[0042]第二步，将扩增出的片段回收，与pEASY-Blunt载体重组连接，测序正确的克隆用SphI酶切；[0043]第三步，将酶切片段克隆到中间载体pSK-avrXa23ΔSphF-XH载体，构建成通用的重复可变区受体质粒载体，命名为pSK-RAR-U；[0044]其中，所述TalenFl、TalenRl、TalenF2-U、TalenR2的序列分别是SEQIDN0.6、SEQIDN0.7、SEQIDN0.11、SEQIDN0.15。[0045]本发明提供所述方法构建获得的通用载体pSK-RAR-U。[0046]本发明还提供所述的通用载体pSK-RAR-U用于构建dTALEs表达载体的方法，包括如下步骤:[0047]第一步，dTALE重复区序列组装；[0048]第二步，将dTALE重复区序列克隆到pSK-RAR-U中。[0049]进一步地，所述的方法，第一步，装配识别A、T、G和/或C的dTALE重复区于中间载体中；第二步，将中间载体用Spe1-NheI双酶切，并将含Spe1-NheI酶切片段回收，再克隆到pSK-RAR-U的NheI位点，即构建成dTALEs表达质粒载体。[0050]本发明还提供所述的通用载体pSK-RAR-U或所述的方法在对生物基因组进行定点激活、敲除或修饰的dTALEs和TALENs方法中的应用。[0051]上述的应用，其用于黄单胞杆菌属造成的作物病害；其中的所述作物是水稻，所述病害为白叶枯病，或细菌性条斑病。[0052]本发明具有以下有益效果:[0053]本发明人通过研究发现dTALE的半个重复(LHR)是可以省略的，因而设计并构建了一个通用的RAR质粒pSK-RAR-U。由于通用RAR质粒pSK-RAR-U能够接受任何一个通过单元装配法组装的dTALE重复区，进而构建dTALEs表达载体的方法简化为:第一步为dTALE重复区序列组装，第二步为将dTALE重复区序列克隆到pSK-RAR-U中。相对于现有技术而言，本发明为dTALEs和TALENs的构建提供了一种全新的更简便的方法，可以大大节约时间和和降低成本。【专利附图】【附图说明】[0054]图1现有技术中构建dTALE表达质粒载体的程序。[0055]图2avrXa23部分序列及设计引物位置。[0056]图3dTALE设计和瞬时表达系统的激活分析。[0057]图4装配重复序列载体示意图。[0058]图5dTALEs激活水稻感病基因xa27表达并诱导抗病反应。[0059]图6本发明简化的构建dTALE表达质粒载体的程序。[0060]图7dTEl_0Plus和dTE2_0Plus的激活分析。【具体实施方式】[0061]实施例1工程效应子蛋白(dTALE)表达质粒载体的设计与构建[0062]为了证明dTALE的半个重复(LHR)是可以省略的，首先设计和构建了一系列dTALEs表达质粒及中间载体。[0063]利用具有本申请人:拥有专利的来自水稻白叶枯病菌的天然TALEs之一AvrXa23(专利号为ZL201010256332.8)为构建dTALEs提供骨架载体。dTALEs重复序列模块的装配采用“单元模块装配方法”(参见参考文献[17])。[0064]首先构建pSK_avrXa23质粒载体:[0065]根据avrXa23(专利号为:ZL201010256332.8)的C端BamHl酶切(GGATCC)位点至终止子(TGA)的序列(序列长度175bp)设计引物，弓丨物AvrXa23F05’端引入CTGAT和XbaI酶切位点(AvrXa23R):5’-TCTAGACTGATGGATCCTGGTACGCCCATCGC),AvrXa23R05>端引入HindIII酶切位点(AvrXa23R0:5’-AAGCTTTCAGATCGTCCCTCCGACTGAGCCTG)，扩增P99ACo45克隆(专利号为:ZL201010256332.8)，扩增出180bp,连接到pEASY-Blunt(北京全式金生物技术有限公司)载体上，测序正确的克隆用Xbal/Hindlll双酶切，回收180bp片段，与pBluescriptIIsk(Xbal/Hindlll双酶切)线性载体连接,命名为pSK_180bp。[0066]将pSK_180bp质粒DNA用BamHl酶切,碱性磷酸酶脱磷(Shrimp),脱磷后无水乙醇沉淀，备用。将P99ACo45克隆用BamHl酶切，回收4.3Kb的DNA片段，与pSK_180bp(BamHl酶切)连接，转化后在含有氨苄青霉素(100μg/ml)LB固体培养基上生长，随机挑取单克隆，提质粒，PCR检测方向正确的，命名为PSK-avrXa23。[0067]其次,按下述步骤构建dTALEs表达质粒载体:[0068]1.将含有avrXa23基因的pBluescriptSK+质粒DNA(pSK_avrXa23)(参见参考文献[29])，用SphI酶切，去除SphI酶切的DNA片段(包含重复可变区)，将含有avrXa23的N端和C端DNA序列的载体在T4连接酶作用下自连，形成一个中间质粒载体,命名为pSK-avrXa23ΔSphF(即avrXa23没有SphI片段)[图1:⑴]。[0069]2.根据avrXa23DNA序列在N端和C端设计引物，在N端引物的5’加入XbaI酶切位点(引物avrXa23F6，表1)，在C端引物的5’加入HindIII酶切位点(avrXa23R6)，以pSK-avrXa23ΔSphF质粒DNA为模板进行PCR扩增，扩增片段重组到pBluescriptIISK(SmaI酶切线性DNA)载体上，形成一个中间载体，命名为PSK_avrXa23ΔSphF-XH[图1:⑵]。[0070]3.引入NheI酶切位点及pSK-RAR中间载体构建[0071]根据avrXa23序列设计引物，具体位置及序列如图2和表1。以pSK_avrXa23质粒DNA为模板，分别用引物对TalenFl/TalenRl、Talen(HD,NG、NN)F2/TalenR2、TalenFl/TalenRl和TalenF2_0N(N代表A、T、C)/TalenR2进行PCR扩增，将扩增出的PCR产物再进行搭桥PCR，引入NheI酶切位点([图1:(3)])。即TalenFl/TalenRl的PCR产物与Talen(HD、NG、NN)F2/TalenR2的PCR产物搭桥扩增片段(含有LHR)；TalenFl/TalenRl的PCR产物与TalenF2-0N/TalenR2的PCR产物搭桥扩增片段(缺失LHR)，将扩增出的片段分别胶回收，与pEASY-Blunt(北京全式金生物技术有限公司)载体重组连接，测序正确的克隆用SphI酶切[图1:(4)]。将酶切片段分别克隆到上述构建的中间载体PSK-avrXa23ΔSphF-XH载体，构建成重复可变区受体(repeat-array-receptor,RAR)质粒载体，分别命名为pSK-RAR,pSK-RAR-Ο[图1:(5)]。[0072]4.重复可变区(RVD)中间载体构建[0073]根据潮霉素基因HptII(GenBank:AF354045.1)的开放阅读框的序列选择了2个DNA片段作为dTALEs的结合兀件(EBE,TALeffectorbindingelement),其中EBEl的序列为5’-TCTCGTGCTTTCAGCTTC-3’;EBE2的序列为5’-TATTTACCCGCAGGACAT-3(图3b)。根据水稻材料IR24含有的感病基因位点xa27的启动子序列，选择一段DNA片段作为EBE3，其序列为5’-TATAAATAGAAGAGACCAATAGAG-3’(图5a)。根据重复可变区(RVD)结构特点，每一个重复含有34个氨基酸，每个重复的第12和13位双连氨基酸识别DNA碱基的规律即:N1、HD、NG和NN分别识别A、C、T和G，构建RVD载体。[0074]根据HuangPeng等的装配方法(参见参考文献[17])，先合成4个分别识别核酸碱基A、C、T和G的102bp(编码34个氨基酸)的DNA重复单元，分别连接到pUC19载体上，命名为pA、pC、pT和pG(图1)，依此单元载体分别装配含有15、16重复单元的识别EBEl和EBE2的中间载体TN-KJl、TN-KJl-1、TN-KJ2、TN-KJ2-1，含有21、22个重复单元的识别EBE3的中间载体TN-KJ24和TN-KJ24-1[图1:(6)、图4]。[0075]5.pdTE表达质粒载体构建[0076]将上述构建的TN-KJl、TN-KJl-1、TN-KJ2、TN-KJ2-1、TN-KJ24和TN-KJ24-1分别用Spe1-NheI双酶切，回收含有重复单元的片段，分别与pSK-RAR、pSK-RAR-Ο连接，构建成pdTEl、pdTE2(含有标准的LHR)，pdTEl-O、pdTE2-0(缺失LHR)，pdTEl-1、pdTE2_l(LHR被一个完整的34个氨基酸取代)及pdTE24(含有标准的LHR)，pdTE24_0(缺失LHR)[图1:⑵-⑶]、图3a、图5b、表2]。[0077]6.植物表达载体及病原菌表达载体构建[0078]首先将植物表达载体pCAMBIA1305中的⑶S基因片段酶切掉，将pdTEl、pdTEl_0、pdTEl-Ι、pdTE2、pdTE2-0和pdTE2_l分别用Xba1-HindIII双酶切，将含有N端、C端、重复单元等编码完整TALEs的片段分别克隆到pCAMBIA1305(无⑶S基因)中，构建成植物表达载体，分别命名为pCdTEl、pCdTEl-0、pCdTEl-l、pCdTE2、pCdTE2-0和pCdTE2_l，将上述质粒载体转入农杆菌EHA105中，备用。[0079]将pdTE24和pdTE24_0用Hindi11单酶切，与pHMl载体(参见参考文献[30])连接，构建成病原菌表达载体，命名为pHdTE24和pHdTE24-0，电击转入水稻白叶枯病强致病菌PX099中，备用。[0080]7.⑶S报告基因载体R印I和R印2的构建[0081]以诱导型启动子BjChl(参见参考文献[31])为模板，设计引物，上游引物在5’端引入HindIII酶切位点及EBEl或EBE2序列，下游引物在5’端引入NcoI酶切位点序列(表I)。[0082]以BjChl序列为模板，用URP1/URP2，URP3/URP2引物(表1)分别扩增，扩增产物分别克隆到pEASY-Blunt载体(北京全式金生物技术有限公司)中，测序正确后，质粒DNA用HindIII/Ncol双酶切回收外源片段约142bp片段，分别克隆到pCAMBIA1305(已用Hindlll/Ncol双酶切去除3`5S启动子)中，构建成含有GUS基因的报告载体，命名为R印I和R印2(图3b)，转入农杆菌EHA105中，备用。[0083]表1设计引物序列[0084]【权利要求】1.一种通用载体PSK-RAR-U的构建方法，其特征在于，包括以下步骤:第一步，以含有avrXa23基因的pBluescriptSK+质粒即pSK_avrXa23质粒DNA为模板，分别用引物对TalenFl/TalenRl、TalenF2_U/TalenR2进行PCR扩增，将扩增出的两个PCR产物混合作模板，再用引物对TalenFl/TalenR2进行搭桥PCR；第二步，将扩增出的片段回收，与pEASY-Blunt载体重组连接，测序正确的克隆用Sphl酶切；第三步，将酶切片段克隆到中间载体PSK-avrXa23ΔSphF-XH载体，构建成通用的重复可变区受体质粒载体，命名为pSK-RAR-U；其中，所述TalenFl、TalenRl、TalenF2-U、TalenR2的序列分别是SEQIDN0.6,SEQIDN0.7、SEQIDN0.1USEQIDN0.15；其中，所述中间载体pSK-avrXa23ΔSphF-XH载体构建方法如下:(1)将(PSK-avrXa23用Sphl酶切，去除Sphl酶切的DNA片段，将含有avrXa23的N端和C端DNA序列的载体在T4连接酶作用下自连，形成的载体命名为PSK-avrXa23ΔSphF,其中avrXa23没有Sphl片段；(2)用引物avrXa23F6和avrXa23R6，以pSK_avrXa23ΔSphF载体为模板进行PCR扩增，扩增片段重组到pBluescriptIISK的5)胳1酶切线性DNA上，形成的中间载体即为pSK-avrXa23ΔSphF-XH;所述引物avrXa23F6和avrXa23R6的序列分别为SEQIDN0.4和SEQIDN0.5。2.一种如权利要求1所述方法构建获得的通用载体pSK-RAR-U。3.一种如权利要求2所述的通用载体pSK-RAR-U用于构建dTALEs表达载体的方法，其特征在于包括如下步骤:第一步，dTALE重复区序列组装；第二步，将dTALE重复区序列克隆到pSK-RAR-U中。4.一种如权利要求3所述的方法，其特征在于:第一步，装配识别A、T、G和/或C的dTALE重复区于中间载体中；第二步，将中间载体用Spe1-NheI双酶切，并将含Spe1-NheI酶切片段回收，再克隆到pSK-RAR-U的船eI位点，即构建成dTALEs表达质粒载体。5.如权利要求2所述的通用载体pSK-RAR-U、如权利要求3或4所述的方法在对生物基因组进行定点激活、敲除或修饰的dTALEs和TALENs方法中的应用。6.如权利要求5所述的应用，其用于黄单胞杆菌属造成的作物病害。7.如权利要求5所述的应用，其中所述作物是水稻，所述病害为白叶枯病或细菌性条斑病。【文档编号】C12N15/66GK103805624SQ201410032382【公开日】2014年5月21日申请日期:2014年1月23日优先权日:2014年1月23日【发明者】赵开军,王春连,郑崇珂,张晓平,王福军,秦腾飞申请人:中国农业科学院作物科学研究所