一种太湖新银鱼物种分子鉴定的引物和方法
【专利摘要】本发明公开了一种太湖新银鱼物种分子鉴定的引物和方法，属于分子生物学DNA标记领域。本发明引物序列：ND5L(5’-CTTGGTGCAAATCCAAGCAGGAAC-3’)，ND5R(5’-GCTTACTCGTGGCCTGAGCCGA-3’)；鉴定方法：(1)用上述引物对太湖新银鱼实验标本总DNA进行PCR扩增；(2)PCR产物纯化、复制克隆，测序得到ND5基因全序列；(3)将实验标本与相关近缘物种的ND5基因全序列比对，构建标准流生物系统树；(4)如上方法，获得待测鱼类样本的ND5基因全序列，将该序列加入步骤(3)，重新构建检测流生物系统树；(5)分析和比较。本发明用于非形态学的准确地物种鉴定和分类，为该物种的人工养殖，杂交、进一步遗传学研究提供科学鉴定依据。
【专利说明】一种太湖新银鱼物种分子鉴定的引物和方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学DNA标记【技术领域】，更具体地说，涉及一种太湖新银鱼物 种分子鉴定的引物和方法。
【背景技术】
[0002] 银鱼（icefishes)是我国一种重要的经济鱼类。中国有世界17种银鱼中的15种， 其中6种为中国特有种。太湖新银鱼（Neosalanx taihuensi)是种较常见的银鱼，为中国 特有种，属于银鱼科（Salangidae)新银鱼属（Neosalanx)。
[0003] 银鱼具有较高的营养价值和经济价值：每百克鲜银鱼可食部分含蛋白质8. 2克， 脂肪〇. 3克，碳水化合物1. 4克，钙258毫克等。全鱼可入药，其肉性味甘、平，有滋养补肾、 健胃补虚、益肺、利水之功效；可用于治疗脾虚泄泻，营养缺乏，消化不良，小儿疮积等症。银 鱼是中国重要的出口水产品之一，远销欧、亚、美各国，在国际市场上被誉为"软黄金"。
[0004] 太湖新银鱼的种质资源鉴定必要性：中国的银鱼天然资源因围湖造田、过度捕捞、 环境污染和生境破碎化等多种因素的影响而持续衰退，各种银鱼的天然资源都不同程度地 下降，物种分布范围显著缩小，个别物种渐危，太湖新银鱼的产量也逐年下降。因此太湖新 银鱼的种质资源鉴定、繁养、杂交以及遗传多样性保护变得十分重要。另一方面，银鱼科 鱼类的分类仍存在很多争议，依据形态学和水域分类的各银鱼科物种的亲缘关系也十分混 舌L。尤其是经济鱼类太湖新银鱼物种与形态学相近的大银鱼，近太湖新银鱼及寡齿银鱼的 分类鉴定十分困难，这对特种银鱼养殖，物种杂交，人工选育及遗传多样性保护等生产和科 学研究带来诸多不便。因此，利用分子手段鉴定和分类银鱼科物种十分必要，鉴定手段也十 分简洁和科学。
[0005] 发明人曾参与研究发表的论文《2种银鱼线粒体CO II及侧翼tRNA基因的测定分 析及其亲缘关系研究》，2008年5月第38卷第3期，发表于《中国海洋大学学报》，探讨了 4 种银鱼及香鱼线粒体C0 II基因序列变异及它们的亲缘关系，测定和分析银鱼线粒体C0 II 基因全序列及侧翼tRNA基因序列，并与同源序列比较，用NJ法和MP法对其进行系统树重 建，推演物种间的亲缘关系，为银鱼的系统分类寻求分子依据，论文中所用到的引物为
[0006] YaL(5, -TCAGCCACATAACCGCTCTG-3,）；
[0007] YaR(5' -CTTCTAGGAGGCGGAATTG-3'）和
[0008] YbL(5' -CTGTAATTCTTATCCTCAT-3'）；
[0009] YbR(5' -GCTGGGTTGAGTTGAGGCATG-3'）。
[0010] 但是发明人后期研究中发现利用上述引物检测银鱼线粒体CO II基因从而构建生 物系统树的过程中，引物扩增并不是很稳定，PCR产物结果并不足够精确，要想准确的鉴定 银鱼种类，需要重新设计一种能够稳定扩增的引物。
【发明内容】
[0011] 1.发明要解决的技术问题
[0012] 本发明为改善和提高现有银鱼分类和鉴定技术，提供了一种太湖新银鱼物种分子 鉴定的引物和方法。采用本发明的技术方案，通过测定和分析银鱼的线粒体ND5基因序列， 推演物种间的亲缘关系，进而获得其科学的分类鉴定依据。
[0013] 2.技术方案
[0014] 为达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
[0015] 本发明的一种太湖新银鱼物种分子鉴定的引物和方法，发明人选取太湖新银鱼线 粒体ND5基因设计引物，引物序列如下：
[0016] ND5L :5' -CTTGGTGCAAATCCAAGCAGGAAC-3'（SEQ ID NO. 1)
[0017] ND5R :5' -GCTTACTCGTGGCCTGAGCCGA-3'（SEQ ID NO. 2)。
[0018] 利用上述线粒体ND5基因的引物对太湖新银鱼物种分子鉴定的方法，如下述步 骤：
[0019] 步骤一、构建标准流生物系统树
[0020] (1)用权利要求1所述引物对太湖新银鱼实验标本的总DNA进行PCR扩增，获得 PCR产物；
[0021] (2)将PCR产物纯化，转入质粒载体复制克隆，对菌液进行测序，获得ND5基因全序 列；
[0022] (3)将太湖新银鱼实验标本与相关近缘物种的ND5基因全序列进行比对，利用 MEGA6. 0软件构建NJ法标准流生物系统树；
[0023] 步骤二、构建检测流生物系统树
[0024] (4)按照步骤一方法，获得待测鱼类样本的线粒体ND5基因全序列，将该序列加入 步骤（3)，重新构建检测流生物系统树；
[0025] (5)分析和比较标准流生物系统树与检测流生物系统树，鉴定待测样本是否为太 湖新银鱼。
[0026] 优选的，PCR扩增反应体积为25 μ 1，模板DNA1 μ 1 (含10?50ng) ;PCR循环退火 温度：55°C。
[0027] 本发明设计的线粒体ND5基因引物是按照如下方法获得的：
[0028] a，从NCBI获得太湖新银鱼近缘物种的线粒体全序列3条；利用ClustalXvl. 83做 ND5两端序列的比对，找出两端200bp左右的保守区段，作为引物候选区；
[0029] b，利用0LIG0 v6软件对候选区序列进行分析，引物序列选择条件：选出长度在 20bp左右，GC含量50%左右，软件预测的引物退火温度在50-55摄氏度，引物间不形成发 卡结构，引物可能扩增全序列中其他位置的序列的引物效率低于200。满足这些要求后，我 们选定1对，上下游引物作为PCR扩增的最终引物，即为本发明的ND5L、ND5R序列。
[0030] 本发明鉴定方法的原理是：
[0031] 选取太湖新银鱼中进化速率适中的线粒体ND5基因设计引物进行PCR扩增，将获 得的PCR产物纯化、转入质粒载体复制克隆，并对菌液进行测序，获得ND5基因全序列；然后 根据基因序列分析结果将太湖新银鱼、相关近缘物种和待测标本的基因序列构建出生物系 统树，从而确定待测标本是否为太湖新银鱼，与其他银鱼或是太湖新银鱼的亲缘关系。
[0032] 3.有益效果
[0033] 采用本发明提供的技术方案，与现有技术相比，具有如下显著效果：
[0034] (1)本发明的一种太湖新银鱼物种分子鉴定的引物和方法，与传统形态学相比，分 子鉴定方法科学、准确，易于操作，对生物样本进行鉴定具有普遍性，科学性和可重复性，快 速测定待测鱼类样本与太湖新银鱼的亲缘关系，为太湖新银鱼的物种间亲缘关系数据判定 和资源鉴定、繁养、杂交以及遗传多样性保护提供依据。
[0035] (2)本发明的一种太湖新银鱼物种分子鉴定的引物和方法，选取太湖新银鱼的线 粒体ND5基因，与之前发明人论文里选取的线粒体CO II基因相比，获得的结果更为稳定，设 计的引物PCR，能够稳定扩增，PCR为long-PCR，PCR产物精确可靠。
[0036] (3)本发明的一种太湖新银鱼物种分子鉴定的引物和方法，通过构建标准流生物 系统树以及增加待测样品基因重新构建生物系统树的方法，不仅在鉴定和推断待测物种是 否为太湖新银鱼，与其他银鱼或是太湖新银鱼的亲缘关系方面具有更为精确的优势，还能 够对于任何一种未知种属的银鱼都可以进行亲缘关系的重现，并进一步用于它们的分类， 适用范围宽。
【专利附图】
【附图说明】
[0037] 图1为本发明中太湖新银鱼物种分子鉴定方法的流程示意图；
[0038] 图2为本发明中太湖新银鱼物种分子鉴定方法的流程简图；
[0039] 图3为本发明中实施例1的生物系统树构建图。
【具体实施方式】
[0040] 为进一步了解本发明的内容，结合附图及实施例对本发明作详细描述。
[0041] 实施例1
[0042] 如图1所示，本发明的一种太湖新银鱼物种分子鉴定的方法步骤为：
[0043] 步骤一、构建标准流生物系统树
[0044] 获得太湖新银鱼完整、新鲜个体样本，与淮南师范学院动物标本室内标本对比鉴 定，初步确认为太湖新银鱼样本，再依据太湖新银鱼形态学特征（舌部及牙齿数量和位置， 鳍的位置与鳍条数），利用解剖镜和显微镜进行形态学鉴定，确认物种，并将其作为太湖新 银鱼标准标本，实验室取标本新鲜的肌肉组织，采用SDS/蛋白酶裂解，酚氯仿提取总DNA， 琼脂糖凝胶电泳检测，和分光光度计测定总DNA含量。
[0045] (1)参考近缘物种相关序列，设计太湖新银鱼线粒体ND5基因引物，序列如下：
[0046] ND5L :5' -CTTGGTGCAAATCCAAGCAGGAAC-3'（SEQ ID NO. 1)
[0047] ND5R :5' -GCTTACTCGTGGCCTGAGCCGA-3'（SEQ ID NO. 2)。
[0048] 用上述引物对太湖新银鱼实验标本的总DNA进行PCR扩增，获得PCR产物；PCR扩 增反应体积为25 μ 1，模板DNA1 μ 1 (含10?50ng) ;PCR循环退火温度：55°C。
[0049] (2)将PCR产物经过生物试剂盒纯化，转入质粒载体复制克隆，对菌液进行测序， 具体在本实施例中，对菌液基因的测序工作交给上海生物公司，获得ND5基因全序列。
[0050] 太湖新银鱼的ND5基因全序列具体核苷酸如下：1824bp
[0051] //atgtaccccctcaccaccattttaaactcctcgctagtactgatcttcgctcttctcctcttcccct tgttcaccacggc
[0052] taacaaacactgggccctaacgcacgtcaacaccgcaatcaaagccgcattcctcgtcagccttatccc cctctctgttt
[0053] tcctcgactctggggttgaaacagttgtctgtgcctgacaatgaatctgcacccgcacctttgacatta gcatcagcttt
[0054] aaatttgacctttactccctcatcttcacccccgtcgctctttatgtaacatgagcaatcttagaattc gcccgctgata
[0055] tatacatgcagaccccaacatgaaccgattcttcaaatgccttctcctcttcctagtggcaatgattat tatggtaacag
[0056] ccaacaacatgttccaactctttattggctgggaaggcattggtatcatgtcttttctactcatcgact gatgagacggg
[0057] cgagcagatgccggcgccgctgcccttcaggccgtcctatacaaccgagttggagacatcggacttgtt cttagcatagc
[0058] ttgattcgctgtaaatctaaactcttgagacatagagcaaatatctgtgtcttcccaagaccttgacct caccctccccc
[0059] tcataggcctaatcctggcagccactgcaaaatccgcgcaattcggcctccacccctgactccccgcgg ctatagaaggc
[0060] cctactcctgtctccgccctgcttcactccagcacaatggtggtcgcaggagtattccttctagtccgg actagccctat
[0061] aatagaaaacaaccccatagcccttactacctgcttatgcctgggggccctcaccactctctttgccgc cacctgcgctc
[0062] tgacccaaaacgacattaaaaaaatcgtcgccttctccacctcaagccagctcggactaatgatagtcg ctgtcggtctt
[0063] aaccaaccacagctcgctttcctccatatctgcacacacgcatttttcaaagccatactgttcttgtgc tcaggatcaat
[0064] tatccacagcctaaatgatgaacaggacattcggaagatgggaggcctaagcaacctcgcccccttcac ctcctcttgcc
[0065] tcgctatcggcagcctcgccctcacagggacccccttcctggcaggcttcttctcaaaagacgccatca tggaagcttta
[0066] aacacatcttacctgaacgcctgagccctggccctcaccctcctagccacctccttcaccgcaatctat agccttcgtgt
[0067] ggcctactttgtagccatgggccacccccgatccccagccctctcccccatcaacgaaaataacccctg cgttattaacc
[0068] ccattaaacgcctcgccttaggaagcatcattgccggcctcctaatcacctccaacctcctcccctcca aaacccctgtc
[0069] ttaactatgccccccctcctcaaacttagcgcccttgtagtaactgtcatcggccttctcacagcccta gaactcgcctc
[0070] cttgacttccaaacaatttaagacctccccctctctcaccccccacaacttctctaacatgctaggatt tttccccgcaa
[0071] tcatccatcgatcaatcccctactgaagcctcttcctcggacaaacagttgcgagccaaatgcttgaca aaacatgattc
[0072] gagaaagtcggccccaaggcaatatccactatcaacctgcctgcagcttccaccactgccgaccttcac cagggcataat
[0073] caaaacctatctgtccctattccttctgacagtcgtcttggctattatcctgcccctcatctaa// (SEQ ID NO. 3)
[0074] (3)利用生物数据库NCBI获得相关近缘物种的对应序列，利用生物软件clusterW 将太湖新银鱼实验标本与相关近缘物种的ND5基因全序列进行比对，基于线粒体ND5基因 核苷酸序列，利用MEGA6. 0软件构建NJ法标准流生物系统树；确定太湖新银鱼的分类地位。
[0075] 步骤二、构建检测流生物系统树
[0076] (4)获得2个未知银鱼确切物种X和Y的肌肉样本，按照步骤一方法，分别提取它 们的DNA，利用上述ND5L和ND5R引物扩增它们的线粒体ND5基因，测序后获得2条线粒体 ND5基因全序列。将该序列加入步骤（3)，重新构建检测流生物系统树，（如图3所示）。
[0077] (5)分析和比较标准流生物系统树与检测流生物系统树树形差异，鉴定待测样本 是否为太湖新银鱼，肌肉样本X与已知的太湖新银鱼形成一个单系群，可判断为太湖新银 鱼，肌肉样本Y与已知的太湖新银鱼不能形成一个单系群，不是太湖新银鱼，但是其与大银 鱼形成一个单系群，为大银鱼。
[0078] 本发明的一种太湖新银鱼物种分子鉴定方法，太湖新银鱼及其他物种的线粒体 ND5基因均存在物种内和种间变异，通过序列比对，检查突变频率，可以构建生物系统树，鉴 定物种。且根据其设计的引物ND5L和ND5R较为可靠，能够在太湖新银鱼及有关近缘物种 鱼类的群体中稳定扩增，PCR为long-PCR，获得的PCR产物稳定，使得太湖新银鱼的物种鉴 别更精确，且通过生物系统树的构建来确定物种的亲缘关系更加准确显而易见。
[0079] 以上示意性的对本发明及其实施方式进行了描述，该描述没有限制性，附图中所 示的也只是本发明的实施方式之一，实际的情况并不局限于此。所以，如果本领域的普通技 术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案 相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。
【权利要求】
1. 一种太湖新银鱼物种分子鉴定的引物，其特征在：所述引物序列如下： ND5L ：5, -CTTGGTGCAAATCCAAGCAGGAAC-3, ND5R :5' -GCTTACTCGTGGCCTGAGCCGA-3'。
2. -种太湖新银鱼物种分子鉴定的方法，其特征在于：包括下述步骤： 步骤一、构建标准流生物系统树 (1) 用权利要求1所述引物对太湖新银鱼实验标本总DNA进行PCR扩增，获得PCR产 物； (2) 将PCR产物纯化，转入质粒载体复制克隆，对菌液进行测序，获得ND5基因全序列； (3) 将太湖新银鱼实验标本与相关近缘物种的ND5基因全序列进行比对，利用MEGA6. 0 软件构建NJ法标准流生物系统树； 步骤二、构建检测流生物系统树 (4) 按照步骤一方法，获得待测鱼类样本的线粒体ND5基因全序列，将该序列加入步骤 (3)，重新构建检测流生物系统树； (5) 分析和比较标准流生物系统树与检测流生物系统树，鉴定待测样本是否为太湖新 银鱼。
3. 根据权利要求2所述的一种太湖新银鱼物种分子鉴定的方法，其特征在于：PCR扩增 反应体积为25 μ 1，模板DNA1 μ 1，模板DNA含10?50ng ;PCR循环退火温度：55°C。
【文档编号】C12N15/11GK104152451SQ201410409580
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年8月19日 优先权日:2014年8月19日
【发明者】张际峰, 周杰, 王建超 申请人:淮南师范学院