检测澳大利亚葡萄类病毒的RT-qPCR寡核苷酸及检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测澳大利亚葡萄类病毒的RT-qPCR寡核苷酸及检测方法。具体地，本发明提供了一组检测澳大利亚葡萄类病毒的寡核苷酸，为序列表SEQ ID No：1和序列表SEQ ID No：3所示，其中序列SEQ ID No.1和SEQ ID No.2分别为检测澳大利亚葡萄类病毒的正义引物和反义引物，序列SEQ ID No.3为检测澳大利亚葡萄类病毒的荧光探针。本发明还提供了含有上述引物和探针的检测试剂盒及其检测方法，可达到准确定量待测样品中澳大利亚葡萄类病毒的目的。
【专利说明】检测澳大利亚葡萄类病毒的RT-qPCR寡核苷酸及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测澳洲葡萄类病毒的实时荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)检测试 剂盒及寡核苷酸，属于检验检疫领域。
【背景技术】
[0002] 澳洲葡萄类病毒（Australian grapevine viroid, AGVd)属于马铃薯纺锤块莲类 病毒科（Pospiviroidae)，苹果锈果类病毒属（Apscaviroid)，为单链环状的RNA分子，长 36 9个核苷酸残基，能形成类病毒典型的杆状二级结构，可能是多种类病毒的重组体。寄主 受AGVd侵染后，多表现隐症，但有少部分叶片产生黄色斑点或形状不规则的黄色斑块，有 时也会出现黄色环斑或斑驳，且病斑多分布于主脉或侧脉附近，与葡萄扇叶病毒复合侵染， 产生镶脉症状。AGVd主要通过嫁接传播和机械传播，也可通过种子传播。到目前为止，AGVd 在澳大利亚、美国、突尼斯、中国和伊朗被发现。
[0003] 目前，国内外已报道检测类病毒的方法有指示植物法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法、分 子杂交、RT-PCR和基因芯片技术等，这些技术有的操作步骤繁琐，检测周期长，灵敏度低， 有的易于造成交叉污染，出现假阳性结果。RT-qPCR技术是在常规PCR定性技术基础上发 展起来的核酸定量技术，是指在PCR反应体系中加入引物对的同时加入特异性荧光探针 (TaqMan探针），探针与模板特异性结合,其结合位点位于引物对之间，利用荧光信号累积 实时监测整个PCR过程。该技术可以采用绝对定量和相对定量两种方式实现定量检测，其 中绝对定量是目前采用最多的一种，但是需要采用外标准品的定量制备来实现。在RT-qPCR 定量检测中，这些外标准品的制备成为其能否准确定量的关键。RT-qPCR整个过程在全封闭 的状态下进行扩增及产物分析，有效地减少污染及对人体的危害。该技术具有特异性强、灵 敏度高、自动化程度高、检测简单快速、技术易于掌握等特点，是快速分子诊断的发展趋势。
[0004] 目前RT-qPCR技术已广泛用于病毒检测、细菌检测、植原体检测、转基因产品检 测、线虫检测等诸多领域，但对澳大利亚葡萄类病毒的RT-qPCR检测尚未见公开报道。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的第一个技术问题是提供一组特异性强、灵敏度高的检测澳大利亚 葡萄类病毒的寡核苷酸，包括引物和探针。
[0006] 本发明要解决的第二个技术问题是提供一种特异、灵敏、高效的检测澳大利亚葡 萄类病毒的RT-qPCR检测试剂盒。
[0007] 本发明要解决的第三个技术问题是提供一种检测澳大利亚葡萄类病毒的RT-qPCR 检测方法。
[0008] 为解决第一个技术问题，本发明采用以下技术方案：
[0009] 一组检测澳大利亚葡萄类病毒的寡核苷酸，为序列表SEQ ID No. 1至SEQ ID No. 3 所示的寡核苷酸，其中序列SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2分别为检测澳大利亚葡萄类病毒的 正义引物和反义引物，序列SEQ ID No. 3为检测澳大利亚葡萄类病毒的荧光探针，具体为：
[0010] 引物 AGVd-FP :5，-TTC TTT CAC TCT GTA GCT GGA ATC C-3'，（SEQ ID No· 1);
[0011] 引物 AGVd-RP :5'-GCG GGA CCC AGC TAG CTT-3'，（SEQ ID No. 2);
[0012] 探针 AGVd-P :5，-CGC TTG CTG GCG AAA CCT GCA-3,，（SEQ ID No· 3);探针的 5' 端标记报告荧光基团FAM，3'端标记淬灭荧光基团BHQ1。上述引物和探针扩增的目标片段 长度为73bp。
[0013] 为解决第二个技术问题，本发明采用以下技术方案：
[0014] 本发明提供了一种检测澳大利亚葡萄类病毒的RT-qPCR检测试剂盒，包括以下组 分：
[0015] (1) RT-qPCR反应液，其包括序列表SEQ ID No. 1所示的正义引物，序列表SEQ ID No.2所示的反义引物，序列表SEQ ID No·3所示的荧光探针，该探针的5'端标记报告荧光 基团FAM,3'端标记淬灭荧光基团BHQ1 ;
[0016] (2)阴性对照：采用无澳大利亚葡萄类病毒感染葡萄叶片，液氮研磨后，加入DEPC 水充分研磨，然后5000rpm离心3min，取上清液提取RNA，溶解于DEPC水；
[0017] (3)RNA标准品：序列表SEQ ID No· 4所示的基因片段体外转录获得的非感染性 RNA片段。
[0018] 进一步地，上述RT-qPCR反应液还包括常规RT-qPCR反应所需的试剂和酶，优选 地，本发明所述的RT-qPCR反应液还包括：10XPCR缓冲液（含Mg2+)，dNTP混合物，反转录 酶，RNA酶抑制剂，Taq DNA聚合酶和DEPC水，均购自TaKaRa公司。
[0019]为解决第三个技术问题，本发明还提供了检测澳大利亚葡萄类病毒的RT-qPCR检 测方法，包括如下步骤： 乱
[0020] (1)提取样品 RNA ;
[0021]取携带澳大利亚葡萄类病毒的葡萄叶片，经RNA提取试剂盒（购自Qiagen公司） 提取植物总RNA,也可以使用现有技术中已知的提取RNA的方法进行提取；
[0022] ⑵对提取的样品RNA进行RT-qPCR扩增：
[0023] 表1 RT-qPCR反应体系
[0024]
【权利要求】
1. 一组检测澳大利亚葡萄类病毒的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸如序列表SEQ ID No. 1至序列表SEQ ID No. 3所示；其中序列SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2分别为检测 澳大利亚葡萄类病毒的正义引物和反义引物，序列SEQ ID No. 3为检测澳大利亚葡萄类病 毒的荧光探针。
2. 根据权利要求1所述的检测澳大利亚葡萄类病毒的寡核苷酸，其特征在于，所述荧 光探针序列SEQ ID NO :3的5'端标记报告荧光基团FAM，3'端标记淬灭荧光基团BHQ1。
3. 权利要求1或2所述的检测澳大利亚葡萄类病毒的寡核苷酸在制备检测澳大利亚葡 萄类病毒试剂盒中的应用。
4. 一种澳大利亚葡萄类病毒的RT-qPCR检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括以下 组分： (1) RT-qPCR反应液，其包括：序列表SEQ ID No. 1所示的正义引物，序列表SEQ ID No. 2 所示的反义引物，序列表SEQ ID No. 3所示的荧光探针，所述荧光探针的5'端标记报告荧 光基团FAM，3'端标记淬灭荧光基团BHQ1 ; (2) 阴性对照； (3) RNA标准品：序列表SEQ ID No. 4所示的基因片段体外转录获得的非感染性RNA片 段。
5. 根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述RT-qPCR反应液还包括：含Mg2+的 PCR缓冲液，dNTP混合物，反转录酶，RNA酶抑制剂，Taq DNA聚合酶和DEPC水。
6. -种澳大利亚葡萄类病毒的RT-qPCR检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤： (1) 提取样品RNA ; (2) 对提取的样品RNA进行RT-qPCR扩增；其中，使用序列表SEQ ID No. 1所示的正义 引物，序列表SEQ ID No. 2所示的反义引物，序列表SEQ ID No. 3所示的荧光探针，所述荧 光探针的5'端标记报告荧光基团FAM，3'端标记淬灭荧光基团BHQ1 ; (3) 根据RT-qPCR反应体系的荧光强度进行结果判定。
【文档编号】C12Q1/68GK104232796SQ201410487618
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月22日 优先权日:2014年9月22日
【发明者】邓丛良, 周琦, 赵晓丽, 刘兴亮, 梁新苗, 孙宁 申请人:北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心