一种产生内切型菊粉酶的黑曲霉菌株及其应用的制作方法

一种产生内切型菊粉酶的黑曲霉菌株及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种产生内切型菊粉酶的黑曲霉菌株及其应用，这种黑曲霉菌株能产生内切型菊粉酶，利用这种黑曲霉菌株和该菌株分泌的内切型菊粉酶可以生产低聚果糖。以黑曲霉作为出发菌株，经含有牛蒡菊糖的培养基活化、牛蒡汁液体培养基摇瓶培养后，利用低能离子束对其细胞进行诱变；诱变菌株经培养后，筛选出一株内切型菊粉酶的生产菌株，其酶活(82U/mL)比出发菌株(58.77U/mL)提高了39.53％。该菌株可用于低聚果糖的生产，与传统的低聚果糖生产工艺相比，具有一次性加酶、工艺简单、发酵液中低聚果糖含量高的优点。
CGMCC No.7145
20121215

CGMCC No.7347
20130322
【专利说明】一种产生内切型菊粉酶的黑曲霉菌株及其应用

【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种产生内切型菊粉酶的黑曲霉菌株；由黑曲霉产生内切型菊粉酶； 通过细胞深层发酵培养生产内切型菊粉酶的方法，以及由所述的内切型菊粉酶降解牛蒡菊 糖生产低聚果糖的方法。

【背景技术】
[0002] 低聚果糖是一种良好的双歧因子和水溶性膳食纤维，可做为功能性食品或者饲料 的原料或添加剂。低聚果糖具有抗肿瘤、刺激双歧杆菌生长、防治便秘、抑制肠内腐败物质 形成、提高机体免疫力、改善脂质代谢、降低胆固醇等作用，同时可作为膳食纤维用于防治 糖尿病和减肥，也可用来改善肠胃功能，降低血脂和预防高胆固醇病等。因此，具有重要的 健康、药用开发价值。
[0003] 传统工业化大规模生产低聚果糖是由蔗糖经果糖基转移酶合成，反应的副产物葡 萄糖是酶的抑制剂，反应进行不彻底，混合物中含有大量葡萄糖和蔗糖，低聚果糖占总量 <55%-60% (干基），且工艺复杂、生产成本高。而本专利用黑曲霉发酵产生内切型菊粉 酶，可利用内切菊粉酶水解菊糖的方法生产低聚果糖，是单酶反应，工艺简单，黑曲霉来源 广泛，且低聚果糖含量高达80%以上，是一种生产低聚果糖的新工艺。
[0004] 目前，如何提高内切型菊粉酶的酶活，是这个新工艺能否用于工业化生产的关键。 据文献报道，现在利用细胞诱变和工艺条件的优化来提高微生物生产内切型菊粉酶酶活的 较多，但未有利用低能离子束诱变技术进行孢子诱变提高菌株酶活的报道。
[0005] 离子束是元素离子化加速后的粒子线，离子束物质能量的传递特征是，离子通过 物质时，在物质中的局部引起高密度的电离和激发。在一般生物或细胞中，IOOkev/ym左 右LET (传能线密度）的离子束的致死效果最好，所导致的DNA双键断裂损伤难以修复，诱 发突变效果较好。常用的离子束有氢离子束、氮离子束、氩离子束、氦离子束、氖离子束等， 目前氮离子束的应用最为广泛。
[0006] 低能离子束诱变与一般生物育种物理诱变剂相比，主要具有以下优点：①技术稳 定可靠，简单易得。因此，离子束生物技术将成为生物培养与改良中一种非常重要的手段之 一；②变异频率高。因为可选择注入的离子种类多样，而且其质量、能量、电荷可有多种组 合，所以诱变结果和效应也是多种多样的；③变异稳定快。离子注入造成的损伤不易修复， 突变体稳定较快；④变异谱宽。能产生较高的电离密度，使天NA产生严重损伤，可获得较高 的突变频率和较广的突变谱，易于筛选出新的突变体。


【发明内容】

[0007] 本发明利用黑曲霉生产内切型菊粉酶，再利用内切型菊粉酶进行牛蒡菊糖的降解 生产低聚果糖；与传统的低聚果糖工艺相比，具有一次性加酶、工艺简单、低聚果糖含量高 的特点，本发明的一个目的就是利用低能离子束诱变技术选育一种新的黑曲霉菌株。
[0008] 本发明的第一个目的是：通过对菌株黑曲霉（Asergillus niger)，08013,保藏编 号为：CGMCCNo. 7145 (保藏日期为：2012年12月15日）进行低能离子束的诱变，选育到一 株黑曲霉菌株（Aspergillus niger)，08-DT-60-09,并在中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心（中国，北京，中关村，100080)进行了保藏，保藏编号为！CGMCCNo. 7347,保 藏日期为：2013年3月22日。
[0009] 本发明的第二个目的是：提供一种由所述的黑曲霉菌株产生的内切型菊粉 酶。本发明的内切型菊粉酶具有以下特征：其Km(菊糖）为1.434mm 〇l/L，Km(蔗糖）为 20. 210mmol/L，I/S = 10. 6/1，最适pH为5. 5,最适反应温度为50°C，在45-55°C范围内均 有较高的内切型菊粉酶反应活性，50°C下的半衰期为18h ;钙离子能够提高内切型菊粉酶 活性34. 2%。本发明的内切型菊粉酶在黑曲霉发酵后存在于发酵液中，可直接进行牛蒡菊 糖的降解，生产低聚果糖。
[0010] 本发明的第三个目的是：提供一种由所述的黑曲霉菌株，利用细胞深层发酵法产 生内切型菊粉酶的方法，包括：
[0011] (1)将菌株划线接种于到含有牛蒡汁3% (体积）活化培养基（固体）中，于28°C 下，进行活化培养；
[0012] (2)培养2-5天后，待长出黑色孢子后，再次将菌株划线接种于到含有牛蒡汁3% (体积）活化培养基（固体）中，于28°C下，进行活化培养；
[0013] (3)培养2-5天后，待长出黑色孢子后，取lcm2的黑曲霉菌丝、孢子及培养基，接入 到装有SOmL发酵培养基（液体）的250mL三角瓶中，放置于回旋式恒温调速摇瓶柜中，在 30°C转速150转/分钟条件下摇瓶培养，进行种子扩大培养；
[0014] (4)培养24h后将三角瓶取出，于无菌操作台中从三角瓶中移取SmL发酵液，转入 到装有72mL的发酵培养基的250mL三角瓶中，再次放置于回旋式恒温调速摇瓶柜中，30°C 转速150转/分钟条件下，培养96h。
[0015] 在上述发酵方法中，发酵培养基中牛蒡汁浓度为7% (体积），有机氮源酵母膏的 浓度为I. 6g/100mL，无机氮源硫酸铵的浓度为0. 5g/100mL，发酵培养基含有0. 5g/100mL的 氯化钠，0. 5g/100mL的磷酸氢二钾，发酵培养基的pH控制在5. 5,发酵培养的温度控制在 30°C，回旋式恒温调速摇瓶柜的转速控制在150转/分钟，发酵液中最高内切型菊粉酶活性 达到 82U/mL。
[0016] 本发明的第四个目的是：提供一种由所述的黑曲霉菌株，利用细胞深层发酵法产 生低聚果糖的方法，包括：
[0017] (1)将菌株划线接种于到含有牛蒡汁3% (体积）活化培养基（固体）中，于28°C 下，进行活化培养；
[0018] (2)培养2-5天后，待长出黑色孢子后，再次将菌株划线接种于到含有牛蒡汁3% (体积）活化培养基（固体）中，于28°C下，进行活化培养；
[0019] (3)培养2-5天后，待长出黑色孢子后，取Icm2的黑曲霉菌丝、孢子及培养基，接入 到装有SOmL发酵培养基（液体）的250mL三角瓶中，放置于回旋式恒温调速摇瓶柜中，在 27°C转速150转/分钟条件下摇瓶培养，进行种子扩大培养；
[0020] (4)培养24h后将三角瓶取出，于无菌操作台中从三角瓶中移取SmL发酵液，转入 到装有72mL的发酵培养基的250mL三角瓶中，再次放置于回旋式恒温调速摇瓶柜中，27°C 转速150转/分钟条件下，培养120h。
[0021] 在上述发酵方法中，发酵培养基中牛蒡汁浓度为16% (体积），有机氮源酵母膏 的浓度为2. 8g/100mL，无机氮源硫酸铵的浓度为0. 8g/100mL，发酵培养基含有0. 5g/100mL 的氯化钠，〇. 5g/100mL的磷酸氢二钾，发酵培养基的pH控制在5. 5,发酵培养的温度控制在 27°C，回旋式恒温调速摇瓶柜的转速控制在150转/分钟，在以上条件下进行发酵120h，发 酵液中低聚果糖含量达到1142mg/80mL。
[0022] 本发明的第五个目的是：提供一种利用低能离子束诱变技术选育高产内切型菊粉 酶菌株的制备方法，包括：
[0023] (1)将一个黑曲霉菌株接种于含牛蒡菊糖的活化培养基上活化1-2次，再接入到 活化培养基试管斜面上进行培养，将在活化斜面中生长3-5天的黑曲霉孢子用IOmL无菌水 冲洗下来，倒入预先灭菌的装有60mL无菌水的在三角瓶中，摇晃均匀，至镜检全部为单孢 子即可得到单孢子悬液。
[0024] (2)取100 μ L调好浓度的孢子悬液，涂布于直径为90mm无菌空白平皿上，置于超 净台下，由无菌风吹干制成干菌膜。
[0025] (3)对制备好的干菌膜进行N+离子注入，注入N+能量为lOKev，注入靶室的真空 度为KT 3Pa,脉冲剂量为IO14NYcm2S，注入剂量为60X2. 6 X IO13NYcm2。
[0026] (4)黑曲霉孢子经过离子注入并培养后，选择20株透明圈大的菌株，每个菌株移 入2个活化培养基培养，待菌丝体生长出来后每个菌株挖取I cm2的培养基及菌株置于发酵 培养基中进行发酵培养，28°C培养4天，发酵液过滤取上清液，测定内切型菊粉酶的酶活。
[0027] 通过上述菌株制备方法，经过筛选，选育出一株产内切型菊粉酶菌株 (Aspergillus niger) :08-DT_60-09，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登 记入库编号：CGMCCNo. 7347。08-DT-60-09菌株的内切型菊粉酶的酶活（82U/mL)比出发菌 株08013 (58. 77U/mL)提高了 39. 53%。选育出来的菌株，经过十代传代实验后，内切型菊粉 酶的酶活偏差在±4. 7%，浮动较小，遗传性状稳定。该菌株可用于生产内切型菊粉酶，进而 降解牛蒡菊糖生产低聚果糖。

【专利附图】

【附图说明】
[0028] 图1为发酵时间与黑曲霉生物量的关系；
[0029] 图2为发酵时间与酶活的关系；
[0030] 图3为底物浓度对反应速度的影响；
[0031] 图4为米氏常数和最大反应速度Km的测定；
[0032] 图5为pH值对酶活性的影响；
[0033] 图6为温度对酶活的影响；
[0034] 图7为内切型菊粉酶保藏温度对酶活性的影响
[0035] 图8为保温时间对酶活的影响；
[0036] 图9为低聚果糖的含量测定

【具体实施方式】 [0037] 实施例1
[0038] 菌株、培养基、内切型菊粉酶活性单位定义与测定
[0039] 1、菌株
[0040] 黑曲霉菌株08013 (Aspergi I lus niger)，为
【发明者】从江苏省徐州市沛县河口镇秦 庄村牛蒡种植基地取得的土壤样本中分离、筛选所得。
[0041] 2、培养基
[0042] (1)菌株保藏培养基（IL):硝酸钠2g，磷酸氢二钾lg，硫酸镁0. 5g，氯化钾0. 5g， 硫酸亚铁0. 〇lg，蔗糖30g，琼脂20g ;
[0043] (2)活化（初筛）培养基（IL):牛蒡汁3mL，蛋白胨lg，酵母膏lg，琼脂2g。
[0044] (3)发酵培养基（用于内切型菊粉酶生产的种子扩大和发酵生产）（0· 1L):牛蒡汁 7mL，酵母膏I. 6g，氯化钠0. 5g，磷酸氢二钾0. 5g，硫酸按0. 5g ;
[0045] (4)发酵培养基（用于低聚果糖生产的种子扩大和发酵生产）（0. 1L):牛蒡汁 16mL，酵母膏2. 8g，氯化钠0. 5g，磷酸氢二钾0. 5g，硫酸按0. 8g。
[0046] 所有培养基配置好均放入高压灭菌锅中121°C灭菌30min。
[0047] 3、酶活的定义
[0048] pH值为4. 5,温度为50°C的条件下每分钟水解底物生成Iumol还原糖所需的酶量 为一个酶活力单位。
[0049] 4、酶活的测定方法
[0050] 取酶液ImL加4ml 2%菊粉（购买于sigma-Aldrich公司）溶液，50°C反应lOmin， 取反应液0. 5mL和I. 5mL 3, 5-二硝基水杨酸试剂，沸水浴加热5min终止酶的作用，定容 至25mL，在同样的反应系统和条件下，以沸水浴中加热IOmin的酶作空白测定，在波长为 540nm处测定溶液的吸光度，查对标准曲线并计算，便可求得样品中还原糖的含量及酶活 性。
[0051] 实验1 :产生内切型菊粉酶的天然菌株的诱变与筛选
[0052] 将一个08013黑曲霉菌株接种于含菊糖的活化培养基上活化1-2次，再接入到活 化培养基试管斜面上进行培养，将在活化斜面中生长3-5天的黑曲霉孢子用IOmL无菌水冲 洗下来，倒入预先灭菌的装有60mL无菌水的在三角瓶中，摇晃均匀，至镜检全部为单孢子 即可得到单孢子悬液。
[0053] 取100 μ L调好浓度的孢子悬液，涂布于直径为90mm无菌空白平皿上，置于超净台 下，由无菌风吹干制成干菌膜。
[0054] 对制备好的干菌膜进行N+离子注入，注入N +能量为lOKev，注入靶室的真空度为 10_3Pa，脉冲剂量为 1014N+/cm2s，注入剂量为 60X2. 6X 1013N+/cm2。
[0055] 黑曲霉孢子经过离子注入并培养后，选择20株透明圈大的菌株，每个菌株移入 2个活化培养基培养，待菌丝体生长出来后每个菌株挖取Icm 2置于发酵培养基中进行 发酵培养，28°C培养4天，发酵液过滤取上清液，测定内切型菊粉酶的酶活，内切型菊粉 酶的酶活比出发菌株平均提高了 38. 5%以上，而后选定此高产菌株定名为Aspergillus niger08-DT-60-09,该菌株继代10代以上，产内切型菊粉酶的性能及其他生物学特性稳 定。
[0056] 实验2 :黑曲霉08-DT-60-09菌株生产内切型菊粉酶的条件
[0057] 将黑曲霉08-DT-60-09菌株放入装有发酵培养基80mL的250mL的三角瓶中在 30°C，150r/min的摇瓶柜上反应24h，从三角瓶中移取8mL发酵液，转入到装有72mL的发酵 培养基的250mL三角瓶中，再次放置于回旋式恒温调速摇瓶柜中，30°C转速150转/分钟条 件下，进行发酵培养，每12h测定一次内切型菊粉酶的酶活和生物量，共测7天，确定最佳的 产酶时间。
[0058] 从图1可知：摇瓶发酵液中的生物量在60h达到最高峰，为2. 37g/瓶，此后即一直 下降，到144h时为0. 32g/瓶。
[0059] 从图2可知：摇瓶发酵液中的酶活在96h达到最高峰，为82U/mL，此后即一直下 降，到168h时为32. 34U/mL。实验结果显示菌体生物量与内切型菊粉酶分泌量有密切的正 比例关系，而内切型菊粉酶分泌量的高峰出现在菌体生物量的高峰之后，符合一般规律。
[0060] 实验3:内切型菊粉酶的酶学性质
[0061] 1、内切型菊粉酶的底物特异性及其反应速度与底物浓度的关系
[0062] (1)内切型菊粉酶的底物特异性
[0063] 表1.内切型菊粉酶的底物特异性
[0064]

【权利要求】
1. 一种产内切型菊粉酶的黑曲霉菌株，其保藏号为：CGMCCNo. 7347。
2. -种由权利要求1所述的黑曲霉菌株产生的内切型菊粉酶。
3. 按照权利要求1所述的内切型菊粉酶，其特征在于，其Km(菊糖）为1. 434mmol/L， Km(蔗糖）为 20.210mmol/L，I/S = 10.6/1，最适？11为5.5，最适温度为501：，在 45-55°〇 范围内均有较高的内切型菊粉酶反应活性，45°C下的半衰期为18h ;钙离子能够提高内切 型菊粉酶活性34. 2%。
4. 一种由黑曲霉菌株发酵生产内切型菊粉酶的方法，其特征在于：采用权利要求1所 述的黑曲霉菌株发酵。
5. -种由黑曲霉菌株发酵生产低聚果糖的方法，采用权利要求1所述的黑曲霉菌株发 酵。
6. -种由黑曲霉菌株发酵生产低聚果糖的方法，包括如下步骤： (1) 将菌株划线接种于到含有牛蒡汁1-5% (v/v)固体活化培养基中，于25-30°C下，进 行活化培养；(2) 培养2-5天后，待长出黑色孢子后，再次将菌株划线接种于到含有牛蒡汁1-5% (v/v)固体活化培养基中，于25-30°C下，进行活化培养；(3) 培养2-5天后，待长出黑色孢子后，取0.5-2cm2的黑曲霉菌丝、孢子及培养基，接入 到装有60-100mL液体发酵培养基的250mL三角瓶中，放置于回旋式恒温调速摇瓶柜中，在 28-32°C转速120-180转/分钟条件下摇瓶培养，进行种子扩大培养；(4) 培养24h后将三角瓶取出，于无菌操作台中从三角瓶中移取5-10mL发酵液，转入 到装有60-80mL的发酵培养基的250mL三角瓶中，再次放置于回旋式恒温调速摇瓶柜中， 26-28°C转速120-180转/分钟条件下，培养120h。
7. 按照权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（3)使用牛蒡汁作为唯一碳源，使用 酵母膏作为有机氮源，使用硫酸铵作为无机氮源。
8. 按照权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤（3)发酵培养基中牛蒡汁浓度 为15-20 % (V/V)，有机氮源酵母膏的浓度为2-3g/100mL，无机氮源硫酸铵的浓度为 0? 5-1. 0g/100mL。
9. 按照权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（3)所述的发酵培养基含有 0. 4-0. 6g/100mL 的氯化钠，0. 4-0. 6g/100mL 的磷酸氢二钾。
10. 按照权利要求6所述的方法，其特征在于，发酵培养基的pH控制在5-6 ;发酵培养 的温度控制在26-28 °C。
【文档编号】C12N1/14GK104498364SQ201410511024
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年9月28日 优先权日:2014年9月28日
【发明者】曹泽虹, 王陶, 董玉玮, 李文 申请人:徐州工程学院