焦磷酸测序法检测sil-tal1融合基因的引物对及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种焦磷酸测序法检测SIL-TAL1融合基因的引物对及包含所述引物对的试剂盒，该试剂盒能够一次性检测SIL-TAL1(type II)和SIL-TAL1(type III)两种融合基因。通过对SIL-TAL1融合基因的mRNA设计引物，经过逆转录PCR后对产物进行测序分析，本试剂盒可以实现SIL-TAL1融合基因的快速、准确、高通量的检测。
【专利说明】焦磷酸测序法检测SIL-TAL1融合基因的引物对及试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种焦磷酸测序法检测SIL-TALl融合基 因的引物对，包含所述引物对的试剂盒及该试剂盒的应用。
【背景技术】
[0002] SIL-TALl融合基因包括SIL-TALl(typeII)、SIL-TALl(typeIII)等多种类型， 常见于T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL)中。
[0003] 当前国内外广泛使用的分子生物学检测SIL-TALl融合基因的方法中，荧光原位 杂交技术（FISH)只能进行定性检测、操作复杂；突光定量PCR存在着检测通量的局限性，所 以都还不能真正满足临床诊断检测的需要。传统的固相生物芯片（Biochip)或基因芯片技 术存在着可重复性差、灵敏度不够好以及操作繁琐的突出弱点。
[0004] 焦磷酸测序技术（Pyrosequencing)是新一代DNA序列分析技术，具备同时对大量 样品进行测序分析的能力，为高通量、低成本、快速、直观地进行核苷酸分析和临床检验提 供了非常理想的技术操作平台。
【发明内容】
[0005] 发明目的：针对现有技术中存在的技术问题，本发明提出一种焦磷酸测序法 同时检测SIL-TALl融合基因的引入对以及含有所述引物对的试剂盒，可以同时检测 SIL-TALUtypeII)和SIL-TALUtypeIII)两种融合基因，具有高灵敏度、高特异性、高准 确度、检测迅速等优点。
[0006] 技术方案：为实现上述技术目的，本发明提出了一种焦磷酸测序法同时检测 SIL-TALl融合基因的引物对，所述的SIL-TALl为SIL-TALl(typeII)和SIL-TALUtype III)中的任意一种或两种，其特征在于，所述引物对包括：
[0007] (1)对于SIL-TALl(typeII)基因，
[0008] 扩增引物为：
[0009]上游引物：5，-TACCCTGCAAACAGACCTCAGCT-3，，
[0010]下游引物：5，-TTCCCCCTTTTTCGCTGAGA-3，，
[0011] 其中下游引物的5'端进行生物素标记；
[0012] 测序引物为：
[0013] 5， -AGAGGCCTGCAGTTAC-3，；
[0014] (2)对于SIL-TALl(typeIII)基因：
[0015] 扩增引物：
[0016]上游引物：5'-CCTCCCAAAATGCTGATCG-3'，
[0017]下游引物：5'-GTCTTTGCTTTCCCCCTTTTTC-3，，
[0018] 其中下游引物的5'端进行生物素标记；
[0019] 测序引物：
[0020] 5'-GGCCTGCAGTTACGCT-Si 。
[0021] 本发明进一步提出了一种焦磷酸测序法检测SIL-TALl融合基因的试剂盒，该试 剂盒包含上述的引物，具体地，所述试剂盒包含如下引物：
[0022] (1)对于SIL-TALl(typeII):
[0023] 扩增引物：
[0024]上游引物：5，-TACCCTGCAAACAGACCTCAGCT-3，，
[0025]下游引物：5，-TTCCCCCTTTTTCGCTGAGA-3，，
[0026] 其中下游引物的5'端进行生物素标记；
[0027] 测序引物：
[0028] 5; -AGAGGCCTGCAGTTAC-3;；
[0029] (2)对于SIL-TALl(typeIII):
[0030] 扩增引物：
[0031]上游引物：5'-CCTCCCAAAATGCTGATCG-3'，
[0032]下游引物：5'-GTCTTTGCTTTCCCCCTTTTTC-3，，
[0033] 其中下游引物的5'端进行生物素标记；
[0034] 测序引物：
[0035]5'-GGCCTGCAGTTACGCT-3，。
[0036] 更具体地，所述试剂盒还包括质控品。所述质控品包括阳性对照品和阴性对照 品，其中，所述的阳性对照品为含有SIL-TALl(typeII)和SIL-TALl(typeIII)的质粒 的混合液，所述的阴性对照品作为对照，与阳性对照品相比为不含SIL-TALUtypeII)和 SIL-TALl(typeIII)的质粒溶液。
[0037] 本发明还提出了上述引物对及包含上述引物对的试剂盒在制备检测SIL-TALl融 合基因的试剂中的应用。
[0038] 有益效果：与现有技术相比，本发明的焦磷酸测序法检测SIL-TALl融合基因的试 剂盒能够实现快速、简便、高效、准确的检测SIL-TALl(typeII)和SIL-TALl(typeIII)融 合基因，为制备用于检测SIL-TALl(typeII)和SIL-TALl(typeIII)融合基因的试剂提供 了理论基础。
【具体实施方式】
[0039] 实验材料：
[0040] 引物由invitrogen公司合成；Trizol购自invitrogen公司；逆转录cDNA合成试 剂盒购置于Fermentas公司；多重PCR试剂盒购置于QIAGEN公司；焦磷酸测序试剂购置于 QIAGEN公司。
[0041] 一种焦磷酸测序法检测SIL-TALl融合基因的试剂盒，所述的SIL-TALl为 SIL-TALUtypeII)和SIL-TALl(typeIII)中的任意一种或两种，包括质控品和如下引 物：
[0042] (I)SIL-TALl(typeII)：
[0043] 扩增引物：
[0044]上游引物：5，-TACCCTGCAAACAGACCTCAGCT-3，，
[0045]下游引物：5' -TTCCCCCTTTTTCGCTGAGA-S'，
[0046] 其中下游引物的5'端进行生物素标记；
[0047] 测序引物：
[0048]5'-AGAGGCCTGCAGTTAC-3，，
[0049] (2)SIL-TALl(type III)：
[0050] 扩增引物：
[0051]上游引物：5' -CCTCCCAAAATGCTGATCG-3，，
[0052]下游引物：5' -GTCTTTGCTTTCCCCCTTTTTC-3，，
[0053] 其中下游引物的5'端进行生物素标记；
[0054] 测序引物：
[0055]5'-GGCCTGCAGTTACGCT-3，。
[0056] 其中，质控品（质控品DNA)包括阳性对照品和阴性对照品，所述的阳性对照品为 含有SIL-TALl (type II)和SIL-TALl (type III)的质粒的混合液；所述的阴性对照品作 为阴性对照，与阳性对照品相比，阴性对照品为不含SIL-TALl (type II)和SIL-TALl (type III)的质粒溶液。
[0057] 检测方法包括如下步骤：
[0058] ( -）RNA提取：
[0059] 取20个T-ALL患者的临床样本；1-20号患者的临床样本分别按照下面的步骤提 取RNA :
[0060] (1)淋巴细胞提取：取新鲜全血2ml加Iml3wt%柠檬酸钠，混匀后在4°C下 3000r/min离心lOmin，取血球层上浅黄色层即为淋巴细胞，得到淋巴细胞液；
[0061] (2)取1个离心管（经DEPC水处理）加入⑴中的淋巴细胞液150μ1，然后加 ImlTrizol，室温放置5min，使其充分裂解；
[0062] (3) 12,OOOr/min离心 5min，取上清；
[0063] (4)向上清中加入200μ1氯仿，剧振荡混匀后室温放置15min;
[0064] (5) 4°C12,OOOg下离心 15min;
[0065](6)吸取上层水相，将水相转移至另一离心管中；
[0066] (7)向水相中加入500μ1异丙醇混勻，室温放置5?IOmin;
[0067] (8)4°C12,OOOg下离心IOmin,弃上清，RNA沉于管底；
[0068] (9)向步骤⑶的管中加入Iml75% (v/v)乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀；
[0069](10)4°C8,OOOg离心 5min，尽量弃上清；
[0070] (11)室温晾干或真空干燥5?IOmin ;
[0071] (12)用50ulRNase-freedH20 溶解RNA样品，55 ?6(TC，5 ?IOmin;
[0072] (13)测OD值定量RNA浓度。
[0073] 按照上述步骤，分别获得1-20号样本的mRNA。
[0074](二）多重逆转录PCR扩增：
[0075] 按照如下方法对上述的1-20号样本的mRNA进行多重逆转录PCR扩增：
[0076] (l)cDNA第一链的合成
[0077] ①取一RNase-free的离心管，置于冰上，建立下列反应体系；
[0078]TotalRNA 5~10 μg/3μ I
[0079] Oligo (dT) 18 Primer (0. 5 μ g/μ I) I μ I
[0080] RNase-free dH20 加至12 μ I
[0081] 轻轻混匀反应液，用冷冻离心机稍微离心收集管壁上的反应液到管底；
[0082] ②离心管于70°C温育5分钟，之后迅速取出置于冰中冷却，用冷冻离心机稍微离 心收集管壁上的反应液到管底；
[0083] ③将离心管放置于冰上，按顺序加入以下反应液；
[0084] 5Xreactionbuffer 4μI
[0085]RNaseInhibitor(20U/μI) IμI
[0086] IOmMdNTPsMix 2 μ I
[0087] 轻轻混匀反应液，用冷冻离心机稍微离心收集管壁上的反应液到管底；
[0088] ④离心管于37°C温育5分钟；
[0089]⑤加入 1μIRevertAidTMReverseTranscriptase(200U/μ1)，终体积为 20μ1;
[0090] ⑥离心管于42°C反应60分钟；
[0091] ⑦离心管于70°C加热10分钟终止反应，之后迅速取出置于冰中冷却。
[0092]如此，合成cDNA第一链，即模板cDNA(Template cDNA)。
[0093] (2)多重PCR
[0094] 采用的是QIAGEN公司的MultiplexPCR试剂盒，体系如下
[0095]TemplatecDNA或质控品DNA 10μ1
[0096] 2XQIAGENMultiplexPCRMasterMix 25μI
[0097]IOXPrimermix 5μI
[0098] RNase-free dH20 10 μ I
[0099] 终体积为50μI
[0100]其中，2XQIAGENMultiplexPCRMasterMix中含热启动TaqDNA酶、MgCljPdNTP Mix;10XPrimermix为包含上述三种融合基因引物对的混合物。
[0101]PCR扩增程序：95°C 15min ;94°C 30s，55°C 90s，72°C 90s，35个循环；72°C IOmin ; 4 C保温。
[0102] 通过上述步骤，获得PCR产物。
[0103] (三）焦磷酸测序
[0104] 首先，用微珠固定PCR产物，其主要是将生物素标记的PCR产物固定到链霉亲和素 包被的琼脂糖微珠（StreptavidinSepharoseHighPerformance)上，包括如下步骤：
[0105](1)轻摇包被链霉亲和素的琼脂糖微珠，直至获得均质溶液；
[0106] (2)在一个试管中混合链霉亲和素包被的琼脂糖微珠总量（2μ1/样品）与结合缓 冲液（40μ1/样品），添加超纯水至一定体积，该体积与后续所要添加优化好的生物素标记 的PCR产物的体积的总和为80μ1/孔；
[0107] (3)将⑵中得到的一定体积的溶液添加至24孔PCR孔板中；
[0108] (4)根据孔板设置，添加5?20μ1优化好的生物素标记的PCR产物至PCR孔板的 每个孔槽，使其中每孔所含溶液为80μ1;
[0109] (5)使用孔板条盖密封PCR孔板，确保孔槽之间没有泄漏；
[0110] (6)使用振荡混合器（HOOrpm)不断振荡PCR孔板至少5?10分钟。
[0111] 经过上述步骤，生物素标记的PCR产物被固定到链霉亲和素包被的琼脂糖微珠 上。
[0112] 接着，开始真空工作站准备工作，包括如下步骤：
[0113] (1)准备以下试剂：大约50ml70% (v/v)乙醇；大约40ml变性溶液（QIAGEN公 司）；大约50mlIX洗涤缓冲液（QIAGEN公司））；大约50ml超纯水；大约70ml超纯水；
[0114] (2)打开真空泵：打开真空开关，进行测试试验，以确定过滤探针是否正常工作；
[0115] (3)每次使用真空泵前要用超纯水检测过滤探针的通透性，将事先准备好的装好 超纯水的离心管插在PCR装置上，将过滤探针降入超纯水中，超纯水如在20秒内被抽空则 表明过滤探针正常，可以使用，反之则需更换过滤探针；
[0116] (4)取下振荡好的PCR孔板，将样品放入PCR装置中，小心降下过滤探针至PCR孔 板中，停留15秒；确保溶液全部被吸走，以捕获含有固定模板的微珠；
[0117] (5)将真空装置移至含有70% (v/v)乙醇的第一试剂槽，冲洗过滤探针5秒；
[0118] (6)将真空装置移至含有变性溶液的第二试剂槽，冲洗过滤探针5秒；
[0119] (7)将真空装置移至含有洗涤缓冲液的第三试剂槽，冲洗过滤探针10秒；
[0120] (8)抬高真空装置超过90°垂线5秒，从过滤探针中排液；
[0121] (9)握持真空装置到Q24孔板上，关闭装置上的真空开关并悬空停留5秒，让负压 散去；
[0122] (10)通过左右轻摇真空装置，释放珠子至含3种测序引物的孔板中；
[0123](11)在真空装置关闭的情况下将真空装置转移至含有超纯水的第四试剂槽，振荡 10秒；
[0124] (12)降下探针至另一个含超纯水的第五试剂槽中并施加真空，清洗探针，用70ml 超纯水冲洗过滤探针；
[0125] (13)抬高真空装置超过90°垂线5秒，从过滤探针中排液；
[0126] (14)关闭真空装置上的开关，并将其置于静止（P)位。
[0127] 如此变完成了真空站的准备工作，接着开始分离DNA单链并将样品释放到 PyroMarkQ24孔板中，具体地包括如下步骤：
[0128] (1)将PyroMarkQ24孔板放置在预热的孔板底座上80°C精确加热2分钟；
[0129] (2)从孔板底座上取下孔板，使样本在室温下至少冷却5分钟。
[0130] 经过上述步骤，样品被杯释放到PyroMarkQ24孔板中。接着准备PyroMarkQ24 试剂，按下述步骤进行：
[0131] (1)打开PyroMarkQ24试剂盒并取出含有酶和底物冻干粉的小瓶，以及含有核苷 酸的试管；
[0132] (2)按照试剂盒说明书用超纯水溶解并分装酶和底物，所有试剂需恢复室温后再 使用；
[0133] (3)依照电脑程序计算出的体积，向试剂仓内加入酶、底物和核苷酸A、T、G、C(试 剂仓最多使用30次，试剂仓在使用前必须是干燥的）。
[0134] 准备好PyroMarkQ24试剂后，在PyroMarkQ24仪器上按下述步骤进行测试：
[0135] (1)打开PyroMarkQ24 软件，点击newassay(新测试）一newAQassay(新 AQ测试）一在sequencetoanalyze(待分析序列）中输入突变点序列，点击Generate DispensationOrder(产生分配顺序），点击保存；
[0136] (2)点击newrun(新运行）一Instrumentmethod(仪器方法）一007,然后点击 要测序的格子，点击保存至U盘；
[0137] (3)将含有运行文件的U盘插入仪器前面的USB端口中；
[0138] (4)把加热好的孔板放到仪器上；
[0139] (5)将试剂仓（酶、底物和核苷酸）的标签面面向自己放入仪器，打开孔板支座架 放入孔板，关闭孔板支座架和仪器盖；
[0140] (6)选择Run(运行），并按OK;
[0141] (7)在进入Run(运行）后，按select(选择）选择要运行的文件；
[0142] (8)仪器运行结束并确认运行文件已保存至U盘后，按close，取出U盘；
[0143] (9)打开仪器，取出试剂仓，并对其进行反复清洗，废弃孔板；
[0144] (10)当仪器不运行时，从主菜单选择shutdown(关机）并按OK;
[0145] (11)当Itisnowsafetoturnofftheinstrument(现在可以安全关机）出现 时，即可关闭仪器，电源开关位于仪器后面。
[0146] (四）结果分析：
[0147] 打开PyromarkQ24 软件，分析SIL-TAL1(typeII)和SIL-TAL1(typeIII)融合 基因的类型，分析结果如下表：
[0148]
【权利要求】
1. 一种焦磷酸测序法检测SIL-TAL1融合基因的引物对，所述的SIL-TAL1为 SIL-TALl(type II)和SIL-TALl(type III)中的任意一种或两种，其特征在于，所述引物对 包括： (1) 对于 SIL-TALl(type II)基因， 扩增引物为： 上游引物：5' -TACCCTGCAAACAGACCTCAGCT-3'， 下游引物：5' -TTCCCCCTTTTTCGCTGAGA-3'， 其中下游引物的5'端进行生物素标记； 测序引物为： 5; -AGAGGCCTGCAGTTAC-3;； (2) 对于 SIL-TALl(type III)基因： 扩增引物为： 上游引物：5' -CCTCCCAAAATGCTGATCG-3'， 下游引物：5' -GTCTTTGCTTTCCCCCTTTTTC-3，， 其中下游引物的5'端进行生物素标记； 测序引物： 5' -GGCCTGCAGTTACGCT-3'。
2. -种焦磷酸测序法检测SIL-TAL1融合基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含 如权利要求1所述的引物对。
3. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括质控品，所述质控品 包括阳性对照品和阴性对照品。
4. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照品为含有 SIL-TALl(type II)、SIL-TALl(type III)的质粒的混合液，所述的阴性对照品为不含 SIL-TAL1 (type II)、SIL-TAL1 (type III)的质粒溶液。
5. 权利要求1所述的引物对在制备检测SIL-TAL1融合基因的试剂中的应用。
6. 权利要求2或3所述的试剂盒在制备检测SIL-TAL1融合基因的试剂中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK104278093SQ201410510911
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2014年9月28日 优先权日:2014年9月28日
【发明者】邵棠, 李玲, 陈庆, 段彪 申请人:南京百捷生物科技有限公司