用于植物寄生线虫核酸提取的试剂盒及其使用方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于植物寄生线虫核酸提取的试剂盒及其使用方法，该试剂盒包括盒体，其盒体内设有一个9孔磁力架(1)，用于置放所述9孔磁力架和多瓶试剂的下凹位，以及成型纸盒(8)和盒内挡板(7)。采用本发明，可准确选择吸附位置，快捷、高效地提取植物寄生线虫核酸，并简化其操作过程。
【专利说明】用于植物寄生线虫核酸提取的试剂盒及其使用方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及检验检疫技术，尤其涉及一种用于植物寄生线虫核酸提取的试剂盒及其使用方法。
【背景技术】
[0002]植物寄生线虫是一种体型微小，通常肉眼不可见的蠕虫形动物。传统分类方法是将线虫列入线形动物门中线虫纲。植物寄生线虫主要通过取食植物根系，造成植物根系畸形、养分吸收困难甚至腐烂，从而影响作物产量。
[0003]据统计，因线虫危害全球每年粮食和纤维作物损失高达800亿美元，历史上甜菜胞囊线虫(Heterodera schachtii)、马铃薯金线虫(Globodera rostocheinsis),温暖地区的根结线虫(Meloidogyne spp)等都引起严重的植物线虫病害。东北和黄淮地区的大豆胞囊线虫(Heterodera glycines)、鳞球莖莖线虫(Ditylenchus dipsaci)、水稻干尖线虫(Aphelenchoides besseyi)都一直造成生产上的严重损失。近年来松材线虫(Bursaphelenchus Xylophilus)在江苏、安徽、广西、云南等省蔓延引起一些松树树种的毁灭性危害。可见，植物寄生线虫病害-直受到人门的重视，一直以来都是口岸检验检疫工作中，需要检测的一类植物有害生物。
[0004]近年来，随着分子生物学技术的不断发展，多种线虫分子生物学检测技术不断建立，例如:实时荧光PCR技术、RFLP技术和LAMP技术，这些技术均建立在线虫核酸提取的基础上，但目前大多数线虫核酸提取的方法存在诸多问题，诸如提取效率低、不稳定、包含一些有毒有害物质等，这些问题都影响了对这类有害生物检测方法的建立和应用。因此线虫核酸的稳定提取成为限制这些技术进一步推广完善的重要因素。国内一些学者也发表文章开始提供一些线虫核酸分离的方法，常用的蠕虫裂解法，对线虫核酸的裂解提取效果较好，但其操作时间较长，新近一些学者发表的冷冻-酶解法针对一些体形较大体壁较薄的线虫种类效果较好，但其基于变温形成的裂解力效率较低，适用范围较窄，且稳定性较差。
[0005]由于线虫体型微小，肉眼不可见，对其核酸的有效提取和富集是对其进行分子检测的关键。基于纳米富集技术的有害生物核酸提取方法在近几年发展迅速，已经在植物病毒、植物真菌、植物细菌等领域出现较多研究和方法的建立，但尚未应用到植物线虫研究领域。
【发明内容】
[0006]有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种用于植物寄生线虫核酸提取的试剂盒及其使用方法，以快捷、高效地提取植物寄生线虫核酸，并简化其操作过程。
[0007]为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的:
[0008]一种用于植物寄生线虫核酸提取的试剂盒，包括盒体；该盒体内设有一个9孔磁力架1，用于置放所述9孔磁力架和多瓶试剂的下凹位，以及成型纸盒8和盒内挡板7。
[0009]其中，所述9孔磁力架，设有分列两排的9个圆形孔；具体为:一排设有3个供1.5ml离心管适用的孔；另一排设有6个供0.2ml离心管适用的孔。
[0010]所述分列两排的9个圆形孔之间，设有可上下移动的磁力板11，所述磁力板11通过调节钮13沿磁力板调节道12上下移动。
[0011]所述试剂盒进一步包括一个用于存放试剂盒说明书的槽位6。
[0012]所述多瓶试剂，具体为:线虫核酸裂解液2、线虫核酸富集液3、线虫核酸洗涤液4和线虫核酸释放液5。
[0013]所述线虫核酸裂解液2，包含:20mmol/L醋酸钾，5mmol/L乙二胺四乙酸，0.3M盐酸胍，0.2mM柠檬酸钠，0.1mM硫酸，0.1mM蛋白酶K。
[0014]所述线虫核酸富集液3，主要由粒径为200nm的磁珠和缓冲液组成，所述缓冲液，具体为:2%PEG 2000,0.lmol/L NaCl，0.001mol/L KC1，0.01mol/LNa2HP04，0.002mol/LKH2P04, pH7.2 ?7.4。
[0015]所述线虫核酸洗涤液4，包含:2mM乙二胺四乙酸和2mMTris_HCL。
[0016]所述线虫核酸释放液5为20%乙醇溶液。
[0017]一种用于植物寄生线虫核酸提取的试剂盒的使用方法，该方法包括:
[0018]步骤一:向0.2mlpcr管里加入1ul灭菌水，将多条或单条线虫，挑取或吸取放入该管中，向管中加入2ul线虫核酸裂解液，56度水浴中保存30分钟；
[0019]步骤二:向上述步骤一中的per管中加入3ul线虫核酸富集液，充分混匀后，静置5分钟，此时形成磁珠-核酸复合体；
[0020]步骤三:将上述步骤二中的per管置于磁力架上，调节磁力板位置，使吸附点位于per管底部，待磁珠-核酸复合体充分被吸附到per管底部后，使用移液器将上清液全部吸出弃掉；
[0021]步骤四:将上述步骤三的per管从磁力架上取下，向其中加入1ul线虫核酸洗涤液，使用移液器轻吹打散磁珠-核酸复合体，静置5分钟后，重复步骤三，再次吸附磁珠-核酸复合体，弃上清液；
[0022]步骤五:将上述步骤四per管从磁力架上取下，向其中加入1ul线虫核酸释放液，使用移液器轻吹打散磁珠-核酸复合体，静置5分钟后，再次将per管置于磁力架上，此时核酸已释放于上清液中，小心吸取上清液，直接用于后续检测或_20°C冷冻保存待用。
[0023]本发明所提供的用于植物寄生线虫核酸提取的试剂盒及其使用方法，具有以下优占-
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[0024]使用本发明的用于植物寄生线虫核酸提取的试剂盒和采用其使用方法，经过富集可提高核酸浓度，从而提高检测灵敏度和准确性。该试剂盒还具有使用简便、操作步骤少、提取核酸用时较短的效果。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1为本发明用于植物寄生线虫核酸提取的试剂盒的俯视图；
[0026]图2为图1所示试剂盒含磁力架的结构示意图；
[0027]图3为用普通PCR验证通用引物检验示意图；
[0028]图4为实时荧光PCR验证显示结果示意图。
[0029]【主要部件/组件符号说明】
[0030]I:9孔磁力架
[0031]11:可调节磁力板
[0032]12:磁力板调节道
[0033]13:调节钮
[0034]2:线虫核酸裂解液
[0035]3:线虫核酸富集液
[0036]4:线虫核酸洗涤液
[0037]5:线虫核酸释放液
[0038]6:槽位
[0039]7:盒内档板
[0040]8:成型纸盒。
【具体实施方式】
[0041]下面结合附图及本发明的实施例对本发明的用于植物寄生线虫核酸提取的试剂盒及其使用方法作进一步详细的说明。
[0042]图1为本发明用于植物寄生线虫核酸提取的试剂盒的俯视图，图2为图1所示试剂盒含磁力架的结构示意图。
[0043]如图1所示，该试剂盒主要包括盒体、盒内设置有一个9孔磁力架、多瓶试剂和置放所述试剂以及所述9孔磁力架的下凹位。所述下凹位，用于配合固定所述9孔磁力架和稳定装有试剂的试管/瓶位置。较佳地，还可设一个用于存放所述试剂盒说明书的槽位6。该试剂盒说明书中列明有该试剂盒的使用说明，包括试剂盒的详细使用步骤、使用注意事项等内容。
[0044]如图1所示，该试剂盒内设置的9孔磁力架I,所述多瓶试剂,具体为:线虫核酸裂解液2、线虫核酸富集液3、线虫核酸洗涤液4和线虫核酸释放液5。此外，该试剂盒还包括成型纸盒8，以及设有的盒内档板7。成型纸盒8与置放有多瓶试剂的区域，通过所述挡板7隔离。
[0045]如图2所示，所述9孔磁力架I进一步包括可调节磁力板11、磁力板调节道12和调节钮13三个部件。
[0046]所述用于植物寄生线虫核酸提取的试剂盒中，9孔磁力架1，其支架主体由聚乙烯树脂铸成，上表面开设有9个圆形孔，这些圆形孔分为并列两排，其中一排设有3个供1.5ml离心管适用的孔，另一排设有6个供0.2ml离心管适用的孔。该两排孔之间设有可上下移动的磁力板(图1未示出)，如图2所示，所述磁力板11可通过调节钮13沿磁力板调节道12上下移动。
[0047]其中，所述试剂盒的线虫核酸裂解液2、线虫核酸富集液3、线虫核酸洗涤液4和线虫核酸释放液5，分别由以下组成成分构成:
[0048]所述线虫核酸裂解液2，包含:20mmol/L醋酸钾，5mmol/L乙二胺四乙酸，0.3M盐酸胍，0.2mM柠檬酸钠，0.1mM硫酸，0.1mM蛋白酶K。
[0049]所述线虫核酸富集液3，主要由缓冲液(2% PEG 2000,0.lmol/L NaCl, 0.0Olmol/L KCl,0.01mol/L Na2HP04,0.002mol/L KH2P04, ρΗ7.2 ?7.4)和粒径为 200nm 的磁珠组成。
[0050]所述线虫核酸洗涤液4，包含:2mM乙二胺四乙酸和2mMTris_HCL。
[0051]所述线虫核酸释放液5，为20%乙醇溶液。
[0052]采用本发明的试剂盒的优点在于，9孔磁力架配置了 2种规格的孔径，可调节的磁力板可更准确的选择吸附位置。线虫核酸裂解液可有效破解线虫细胞膜，但不破坏核酸，经过蛋白酶酶解后，高效释放线虫核酸。采用粒径为200nm的纳米磁珠，在缓冲液条件下高效吸附线虫核酸。本发明不需要加入氯仿等有毒物质，且提取时间为60分钟左右，安全高效。
[0053]本发明的植物寄生线虫核酸提取的试剂盒的使用方法，主要包括如下步骤:
[0054]步骤一:向0.2mlpcr管里加入1ul灭菌水，将多条或单条线虫，挑取或吸取放入该管中，向管中加入2ul线虫核酸裂解液，56度水浴中保存30分钟。
[0055]步骤二:向上述步骤一中的per管中加入3ul线虫核酸富集液，充分混匀后，静置5分钟，此时形成磁珠-核酸复合体。
[0056]步骤三:将上述步骤二中的per管置于磁力架上，调节磁力板位置，使吸附点位于per管底部，待磁珠-核酸复合体充分被吸附到per管底部后，使用移液器将上清液全部吸出弃掉。
[0057]步骤四:将上述步骤三的per管从磁力架上取下，向其中加入1ul线虫核酸洗涤液，使用移液器轻吹打散磁珠-核酸复合体，静置5分钟后，重复步骤三，再次吸附磁珠-核酸复合体，弃上清液。
[0058]步骤五:将上述步骤四per管从磁力架上取下，向其中加入1ul线虫线虫核酸释放液，使用移液器轻吹打散磁珠-核酸复合体，静置5分钟后，再次将per管置于磁力架上，此时核酸已释放于上清液中，小心吸取上清液，直接用于后续检测或_20°C冷冻保存待用。
[0059]上述使用方法的优点在于，操作步骤简便，用时较短，经过富集核酸浓度提高，从而提高了检测灵敏度和准确性。
[0060]【结果判定方法】
[0061]I)用普通PCR验证通用引物，如图3所示。用M13通用引物及MSP119C引物做PCR鉴定，结果显示，分别在500bp?750bp之间及750bp?100bp之间出现两条特异性条带。
[0062]将各组分混匀后，放入PCR仪中，按上述反应参数设计35个循环。待反应结束后，电泳鉴定扩增片断，结果显示出现与预期大小一致的DNA条带同时切胶回收目的片断。
[0063]2)用实时荧光PCR验证，如图4所示，显示了革兰氏阳性和革兰氏阴性探针的一个管中的两条曲线。阳性(向上)曲线表示检测约1.3 X 104个细胞的革兰氏阳性模板的革兰氏阳性探针，和平缓曲线反映了革兰氏阴性探针采用相同的模板，无假阳性检测显示。
[0064]显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
【权利要求】
1.用于植物寄生线虫核酸提取的试剂盒，包括盒体；其特征在于，该盒体内设有一个9孔磁力架(I)，用于置放所述9孔磁力架和多瓶试剂的下凹位，以及成型纸盒(8)和盒内挡板⑵。
2.根据权利要求1所述用于植物寄生线虫核酸提取的试剂盒，其特征在于，所述9孔磁力架，设有分列两排的9个圆形孔；其中，一排设有3个供1.5ml离心管适用的孔；另一排设有6个供0.2ml离心管适用的孔。
3.根据权利要求2所述用于植物寄生线虫核酸提取的试剂盒，其特征在于，所述分列两排的9个圆形孔之间，设有可上下移动的磁力板(11)，所述磁力板11通过调节钮(13)沿磁力板调节道(12)上下移动。
4.根据权利要求1?3任一所述用于植物寄生线虫核酸提取的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进一步包括一个用于存放试剂盒说明书的槽位(6)。
5.根据权利要求1所述用于植物寄生线虫核酸提取的试剂盒，其特征在于，所述多瓶试剂，具体为:线虫核酸裂解液(2)、线虫核酸富集液(3)、线虫核酸洗涤液(4)和线虫核酸释放液(5)。
6.根据权利要求5所述用于植物寄生线虫核酸提取的试剂盒，其特征在于，所述线虫核酸裂解液(2)，包含:20mmol/L醋酸钾，5mmol/L乙二胺四乙酸，0.3M盐酸胍，0.2mM柠檬酸钠，0.1mM硫酸，0.1mM蛋白酶K。
7.根据权利要求5所述用于植物寄生线虫核酸提取的试剂盒，其特征在于，所述线虫核酸富集液(3)，主要由粒径为200nm的磁珠和缓冲液组成，所述缓冲液，具体为:2% PEG2000，0.lmol/L NaCl,0.001mol/L KCl，0.01mol/LNa2HP04,0.002mol/L KH2P04, ρΗ7.2 ?7.4。
8.根据权利要求5所述用于植物寄生线虫核酸提取的试剂盒，其特征在于，所述线虫核酸洗涤液(4)，包含:2mM乙二胺四乙酸和2mMTris-HCL。
9.根据权利要求5所述用于植物寄生线虫核酸提取的试剂盒，其特征在于，所述线虫核酸释放液(5)为20%乙醇溶液。
10.用于植物寄生线虫核酸提取的试剂盒的使用方法，其特征在于，该方法包括: 步骤一:向0.2mlpcr管里加入1ul灭菌水，将多条或单条线虫，挑取或吸取放入该管中，向管中加入2ul线虫核酸裂解液，56度水浴中保存30分钟； 步骤二:向上述步骤一中的per管中加入3ul线虫核酸富集液，充分混匀后，静置5分钟，此时形成磁珠-核酸复合体； 步骤三:将上述步骤二中的per管置于磁力架上，调节磁力板位置，使吸附点位于per管底部，待磁珠-核酸复合体充分被吸附到per管底部后，使用移液器将上清液全部吸出弃掉； 步骤四:将上述步骤三的per管从磁力架上取下，向其中加入1ul线虫核酸洗涤液，使用移液器轻吹打散磁珠-核酸复合体，静置5分钟后，重复步骤三，再次吸附磁珠-核酸复合体，弃上清液； 步骤五:将上述步骤四per管从磁力架上取下，向其中加入1ul线虫核酸释放液，使用移液器轻吹打散磁珠-核酸复合体，静置5分钟后,再次将per管置于磁力架上,此时核酸已释放于上清液中，小心吸取上清液，直接用于后续检测或-20°C冷冻保存待用。
【文档编号】C12N15/10GK104232482SQ201410510760
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月28日 优先权日:2014年9月28日
【发明者】江丽辉, 边勇, 邓丛良, 刘若思, 郑春生, 骆卫峰 申请人:中华人民共和国北京出入境检验检疫局