一种检测细胞NF-κB信号通路的PCR试剂及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种检测细胞NF-κB信号通路的PCR试剂及其应用，本发明所述检测试剂包括检测CD40基因、IL10基因、CD83基因、EGFR基因等相关基因和内参ACTB基因、GAPDH基因、HPRT1基因的PCR反应引物。本发明将涉及NF-κB信号分子集中在一个平板上，通过做一次实时荧光定量PCR反应，反应细胞的生存状态，与正常的肝癌、肝细胞做对比，探讨NF-κB信号通路在肿瘤/正常细胞中的可能途径，为研究关键蛋白的调控提供最直接的证据；本发明从转录水平快速准确的找到NF-κB信号通路相关分子，为抗癌药物筛选、新靶向药物的机制探讨等提供了有力的工具。
【专利说明】-种检测细胞NF-kB信号通路的PCR试剂及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，尤其涉及一种检测细胞NF- K B信号通路的PCR试剂 及其应用。
【背景技术】
[0002] NF-kB信号通路是存在于生物体内的一条极其重要的信号传导通路，尤其是对凋 亡的调节起着非常重要的作用。目前，已经建立起来的NF-kB信号通路包括经典通路和非 经典通路。NF-kB的经典信号通路和非经典信号通路的主要区别就在于：在NF-kB的经 典信号通路中，IkB蛋白的降解使NF-kB二聚体得到释放。而在NF-kB非经典信号通路 中，则是通过P100到P52的加工处理，使信号通路激活。而在NF-kB信号通路的终止中， IkB蛋白家族是至关重要的。而NF-kB通路如何被阻断以抑制肿瘤的发展一直是NF-kB 信号通路的谜团和研究热点之一。
[0003] 目前研究核心信号通路的核心分子调控机制，已经成为治疗肿瘤的一种关键手 段，尤其是近年来NF-kB信号通路在肝癌中的研究，已经成为研究开发肝癌药物研发领域 的急需解决的重要问题。
【发明内容】
[0004] 本发明针对现有技术中如何确定NF-K B核心信号分子的调控，如何解释核心分 子在肿瘤细胞中的变化的困难，提供了一种检测细胞NF-kB信号通路的PCR试剂及其应 用，本发明将涉及细胞NF-kB的信号分子集中在一个平板上，通过做一次实时荧光定量 PCR反应，反应细胞的生存状态，探讨在肝癌细胞系中引起NF-kB信号通路变化的可能靶 分子与靶途径，为研究核心NF-kB信号蛋白的调节提供最直接的证据。
[0005] 为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：
[0006] 一种检测细胞NF- K B信号通路的PCR试剂，它包括以下引物：
【权利要求】
1. 一种检测细胞NF-KB信号通路的PCR试剂，其特征在于它包括以下引物： (1) 检测CD40基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5'-TGGGGTCAAGCAGATTGCTA-3' ； 5,-CAGATGACACATTGGAGAAGA-3，； (2) 检测ILlO基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5,-CAAGGCGCATGTGAACTCC-3，； 5,-ATGTCAAACTCACTCATGGCT-3，； (3) 检测CD83基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5,-AAGCTGGCATGGAACGAG-3，； 5'-GTCTTGTGAGGAGTCACTAGC-3' ； (4) 检测EGFR基因的的PCR反应引物，其引物序列如下： 5,-GGCACGAGTAACAAGCTCAC-3，； 5,-TGAGGACATAACCAGCCACC-3，； (5) 检测FASLG基因的的PCR反应引物，其引物序列如下： 5'-TTTAACAGGCAAGTCCAACTCA-3' ； 5'-GCCACCCTTCTTATACTTCACT-3' ； (6) 检测ILlA基因的的PCR反应引物，其引物序列如下： 5'-TCATGTAAGCTATGGCCCACT-3' ； 5'-TTCCCGTTGGTTGCTACTAC-3' ； (7) 检测ILlB基因的的PCR反应引物，其引物序列如下： 5,-TCGACACATGGGATAACGAGG-3，； 5'-TTTTGCTGTGAGTCCCGGAG-3' ； (8) 检测ILlRl基因的的PCR反应引物，其引物序列如下： 5'-GCCAGTTGAGTGACATTGCT-3' ； 5'-GTGATGAGGGTACTCCTTCTTT-3' ； (9) 检测IL8基因的的PCR反应引物，其引物序列如下： 5'-CTGAGAGTGATTGAGAGTGGAC-3' ； 5'-ACCCTCTGCACCCAGTTTTC-3' ； (10) 检测LTBR基因的的PCR反应引物，其引物序列如下： 5'-CAGTCCGACACAACCTGC-3' ； 5'-TACAGGATTGGGTCCCTCTC-3' ； (11) 检测NODl基因的的PCR反应引物，其引物序列如下： 5'-GCGACCACGTCCTGCTAT-3' ； 5'-AGGTTGGTGAACTGGAAGTG-3' ； (12) 检测TLRl基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5,-TCAAACGTGAAGCTACAGGG-3，； 5,-CGAACACATCGCTGACAACT-3，； (13) 检测TLR2基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5'-CTCTCGGTGTCGGAATGTC-3' ； 5,-CCCGCTCACTGTAAGAAACA-3，； (14) 检测TLR3基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5'-AAACACAAGCATTCGGAATCTG-3' ； 5'-AGGAATCGTTACCAACCACATT-3' ； (15) 检测TLR4基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5'-GTTGATCTACCAAGCCTTGAGT-3' ； 5'-CTGGTTGTCCCAAAATCACTTT-3' ； (16) 检测TLR6基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5'-GAATGCAAAAACCCTTCACCT-3' ； 5'-CAAGTCGTTTCTATGTGGTTGA-3' ； (17) 检测TLR9基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5'-ATCCCTCATATCCCTGTCCC-3' ； 5'-TTGCCGTCCATGAATAGGAAG-3' ； (18) 检测TNF基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5'-AGGCCAAGCCCTGGTATG-3' ； 5'-AGGCCAAGCCCTGGTATG-3' 。 (19) 检测TNFRSF1A基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5,-ACGAGTGTGTCTCCTGTAGT-3，； 5'-GAGTAGAGCTTGGACTTCCAC-3' ； (20) 检测TNFRSF10A基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5' -CGGGGAGGATTGAACCAC-3'； 5'-GACGACAAACTTGAAGGTCTT-3' ； (21) 检测TNFRSF10B基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5'-CAGTTGCAGCCGTAGTCTTG-3' ； 5'-CAGGTCGTTGTGAGCTTCT-3' ； (22) 检测TNFSF10基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5'-GCGTGCTGATCGTGATCTTC-3' ； 5'-CTCGTTGGTAAAGTACACGTA-3' ； (23) 检测BIRC2基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5'-TTCAGTGGTTCTTACTCCAGC-3' ； 5'-CTGTAGGGGTTAGTCCTCGAT-3' ； (24) 检测FADD基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5,-GAGAAGGAGAACGCAACAGT-3，； 5'-CTGAACCTCTTGTACCAGGTC-3' ； (25) 检测IRAKI基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5'-GGTTTCGTCACCCAAACATT-3' ； 5'-GGGCTGTACCCAGAAGGA-3' ； (26) 检测IRAK2基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5,-TGCCACCCCAATGTCTTACC-3，； 5'-GGGAACCATTTGCCATGTAG-3' ； (27) 检测IRFl基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5'-CAGCTACACAGTTCCAGG-3' ； 5'-TCCTCAGGTAATTTCCCTTCCT-3' ； (28) 检测MYD88基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5'-GCTGCTCTCAACATGCGA-3' ； 5'-TGTGTCCGCACGTTCAAGA-3' ； (29) 检测RIPKl基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5'-TACATGGAAAAGGCGTGATACA-3' ； 5'-GGTCTGCGATCTTAATGTGGA-3' ； (30) 检测TBKl基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5'-GATCACTGCCATTTAGACCC-3' ； 5'-AGGCATGTCTCCACTCCAG-3' ； (31) 检测TICAMl基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5,-CTGGAATCATCATCGGAACAG-3，； 5'-GAGTGGTCTATGGCGTCCT-3' ； (32) 检测TNFAIP3基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5'-CAACTGGTGTCGAGAAGTCC-3' ； 5'-AAGTCTGTGTCCTGAACGC-3' ； (33) 检测TRADD基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5'-CTGTTTGAGTTGCATCCTAGC-3' ； 5,-CGCACTTCAGATTTCGCA-3，； (34) 检测TRAF2基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5'-CTCATGCTGACCGAATGTC-3' ； 5,-CCGTCACAAGTTAAGGGGAA-3，； (35) 检测TRAF3基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5'-CTTGAGGAAAGACCTGCGAG-3' ； 5,-CGATCATCGGAACCTGACT-3，； (36) 检测TRAF6基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5,-TGCCATGAAAAGATGCAGAGG-3，； 5'-GCCTGGGCCAACATTCTC-3' ； (37) 检测BCL3基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5'-ACATCTACAACAACCTACGGC-3' ； 5,-GTGAGCCCGTCATAATTGC-3，； (38) 检测CHUK基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5'-TGAAGAAGTTGAACCATGCCA-3' ； 5'-CTCCAGAACAGTATTCCATTGC-3' ； (39) 检测IKBKB基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5'-TGGCCTTTGAGTGCATCAC-3' ； 5'-GCTAACAACAATGTCCACCT-3' ； (40) 检测IKBKG基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5,-GGCAGAGCAACCAGATTCT-3，； 5,-CTGGCATTCCTTAGTGGCAG-3，； (41) 检测NFKBIA基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5'-TCCGAGACTTTCGAGGAAATAC-3' ； 5'-CCATTGTAGTTGGTAGCCTTCA-3' ； (42) 检测NFKBIE基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5'-AATTGCTGCTTCGGAATGGA-3' ； 5'-ATGCGGGCATCTACCTGG-3' ； (43) 检测NFKBl基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5'-AAGCACGAATGACAGAGGC-3' ； 5'-CTTGGCGGATTAGCTCTTTT-3' ； (44) 检测NFKB2基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5'-TGGAGAGTTGCTACAACCCA-3' ； 5'-TGTTCCACGATCACCAGGTA-3' ； (45) 检测REL基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5,-CATGGTAATTTGACGACTGCT-3，； 5'-CTTCCCAATCGTTCAACACA-3' ； (46) 检测RELA基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5'-TGGGGACTACGACCTGAATG-3' ； 5'-GGGCACGATTGTCAAAGATG-3' ； (47) 检测RELB基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5'-TCCGAGCCCGTCTATGACAA-3' ； 5'-GTCTTGAACACAATGGCAATC-3' ； (48) 检测CCL2基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5'-AGCCAGATGCAATCAATGCC-3' ； 5'-GGAATCCTGAACCCACTTCT-3' ； (49) 检测CCL5基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5'-CAGCAGTCGTCTTTGTCAC-3' ； 5,-TCTGGGTTGGCACACACTT-3，； (50) 检测CSFl基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5'-GACCTCGTGCCAAATTACATT-3' ； 5,-GGTGTCTCATAGAAAGTTCGGA-3，； (51) 检测CSF2基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5'-CCTGAACCTGAGTAGAGACAC-3' ； 5,-GCTGCTTGTAGTGGCTGG-3，； (52) 检测CSF3基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5'-CTGCTTGAGCCAACTCCATA-3' ； 5'-AACGCGGTACGACACCTC-3' ； (53) 检测ICAMl基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5'-TATGAACTGAGCAATGTGCAAG-3' ； 5'-TTCCACCCGTTCTGGAGTC-3' ； (54) 检测IFNAl基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5'-CCTCGCCCTTTGCTTTACT-3' ； 5,-TGTGGGTCTCAGGGAGATCA-3，； (55) 检测IFNG基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5'-CGGTAACTGACTTGAATGTCCA-3' ； 5'-CGCTTCCCTGTTTTAGCTGC-3' ； (56) 检测TIMPl基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5'-CCACCTTATACCAGCGTTATGA-3' ； 5'-GTGTAGACGAACCGGATGTC-3' ； (57) 检测LTA基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5'-ATCTACTTCGTCTACTCCCAGG-3' ； 5'-CCCGTGGTACATCGAGTG-3' ； (58) 检测BIRC3基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5'-CCATTGACTTTTCTGTCGCC-3' ； 5,-CAAAGCAAGCCACTCTGT-3，； (59) 检测AGT基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5'-TCCAATTCAGGCCAAGACAT-3' ； 5'-GTCAAGTTTTGCAGCGACTA-3' ； (60) 检测BCL2A1基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5'-GTGCTACAAAATGTTGCGTTC-3' ； 5'-GCAATTTGCTGTCGTAGAAGTT-3' ； (61) 检测BCL2L1基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5,-ACTGAATCGGAGATGGAGACC-3，； 5,-CAGTTCAAACTCGTCGCCT-3，； (62) 检测BIRC3基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5'-CCATTGACTTTTCTGTCGCC-3' ； 5,-CAAAGCAAGCCACTCTGT-3，； (63) 检测AKTl基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5'-ACAAACGAGGGGAGTACATC-3' ； 5'-CCATCATTCTTGAGGAGGAAGT-3' ； (64) 检测MAP3K1基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5'-TAGGGCCTAACTCTTTCCTGAT-3' ； 5'-GTTCTAGTTGAAACACCCGGA-3' ； (65) 检测RAFl基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5'-GTTCAGCAGTTTGGCTATCAG-3' ； 5'-ACTGTTCTTTGCTTGTTCGG-3' ； (66) 检测ATFl基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5,-ACAGATGGAGTACAGGGACT-3，； 5'-ACCACCTGATTGCTGGGC-3' ； (67) 检测EGRl基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5'-CCCCTCTGTCTACTATTAAGGC-3' ； 5'-GGGACTGGTAGCTGGTATTG-3' ； (68) 检测ELKl基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5,-ATCGGAAGAGCTTAATGTGGAG-3，； 5'-TTGGTGGTTTCTGGCACAA-3' ； (69) 检测FOS基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5,-ACTCCAAGCGGAGACAGAC-3，； 5,-GGTCATCAGGGATCTTGCAG-3，； (70) 检测JUN基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5,-CCAAGTGCCGAAAAAGGAAG-3，； 5'-GAGTTCTGAGCTTTCAAGGT-3' ； (71) 检测STATl基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5,-GGCTGAATTTCGGCACCT-3，； 5,-AGTAACGATGAGAGGACCCT-3，； (72) 检测CARDll基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5'-ACCTTCCAGGAGCGGTACTA-3' ； 5'-TAGCGCATGGCTAAGTTGTA-3' ； (73) 检测CASPl基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5,-CCAATAATGGACAAGTCAAGCC-3，； 5'-CTGTACCCCAGATTTTGTAGCA-3' ； (74) 检测CASP8基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5,-TCATGGACCACAGTAACATGGA-3，； 5,-AGTGAACTGAGATGTCAGCTCAT-3，； (75) 检测CFLAR基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5'-GAGTGAGGCGATTTGACCTG-3' ； 5'-TCCGAAACAAGGTGAGGGTT-3' ； (76) 检测HMOXl基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5'-AGACTGCGTTCCTGCTCAAC-3' ； 5,-AAGCCCTACAGCAACTGTCG-3，； (77) 检测MALTl基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5'-GAGAAGTGTTGATGGCGTCT-3' ； 5,-TAGTGAGGAATAGGGCTTCCA-3，； (78) 检测PSIPl基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5'-AAACAGGGGTTACTTCAACCTC-3' ； 5'-GCCTTTCAGCATATTCCTTCT-3' ； (79) 检测RHOA基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5'-ATTGGCGCTTTTGGGTACAT-3' ； 5'-GCAGCTCTCGTAGCCATTTC-3' ； (80) 检测CCL20基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5'-GCTGTACCAAGAGTTTGCTC-3' ； 5'-GCACACAGACAACTTTTTCTTT-3' ； (81) 检测CXCL2基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5,-CATCGCCCATGGTTAAGAAAAT-3，； 5'-ATTGGTGGCTGTTCCTGAAGGA-3' ； (82) 检测CXCL3基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5,-CAAACCGAAGTCATAGCCAC-3，； 5'-GCTCCCCTTGTTCAGTATCT-3' ； (83) 检测STXll基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5'-TAAGTGGGACGTGTTTTCCG-3' ； 5'-TCGATGACGTTCAGGGTGT-3' ； (84) 检测TIFA基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5'-TACAGGTGCATGGTCAGATTCG-3' ； 5'-CTGTCGGAGAACTGCTTTGG-3' ； (85) 检测GAPDH基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5,-CTGCCACCCAGAAGACT-3，； 5'-CTCAGTGTAGCCCAGGAT-3' ； (86) 检测ACTB基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5'-GCTACAGCTTCACCACCAC-3' ； 5'-ACTTGCGCTCAGGAGGAGC-3' ； (87) 检测HPRTl基因的PCR反应引物，其引物序列如下： 5,-AAAAGGACCCCACGAAGTGT-3，； 5'-GTCAAGGGCATATCCTACAACA-3' 。
2. 权利要求1所述的PCR试剂在制备检测癌细胞的检测试剂中的应用。
3. 根据权利要求2所述的PCR试剂在制备检测癌细胞的检测试剂中的应用，其特征在 于：所述癌细胞为肺癌细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞和肝癌细胞。
4. 根据权利要求2所述的PCR试剂在制备检测癌细胞的检测试剂中的应用，其特征在 于：所述检测试剂适用于实时荧光定量PCR检测方法。
5. 根据权利要求4所述的PCR试剂在制备检测癌细胞的检测试剂中的应用，其特 征在于：所述实时荧光定量PCR的反应体系为：Taq聚合酶反应混合液10μ1，上游引物 0. 1-0. 2μmol,下游引物0. 1-0. 2μmol,cDNA模板25-100ng，灭菌蒸馈水补足到20μ1。
6. 根据权利要求5所述的PCR试剂在制备检测癌细胞的检测试剂中的应用，其特征在 于：所述Taq聚合酶为TaKaRa公司的2><SYBR?PremixExTaq聚合酶。
7. 根据权利要求4所述的PCR试剂在制备检测癌细胞的检测试剂中的应用，其特征在 于：所述实时荧光定量PCR的反应程序为：95°C预变性，30秒；95°C变性，5秒，59°C，20秒， 进行40个循环。溶解曲线分析95°C，15秒，至65°C，1分钟，按照4. 4°C/秒进行梯度降温。
【文档编号】C12Q1/68GK104450886SQ201410608428
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月3日 优先权日:2014年11月3日
【发明者】刘世海, 梁军, 潘华政, 王丽萍, 刘相萍, 梁晔, 姚如永, 隋爱华, 刘自民 申请人:青岛大学附属医院