超嗜热糖苷酶突变体及其在人参皂苷ck制备中的应用的制作方法

超嗜热糖苷酶突变体及其在人参皂苷ck制备中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种超嗜热糖苷酶突变体及其在人参皂苷CK制备中的应用，属于生物技术工程【技术领域】。超嗜热糖苷酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所述，超嗜热糖苷酶突变体在制备稀有人参皂苷CK的应用。超嗜热糖苷酶突变体，具有很高的耐热性和稳定性，在70℃-80℃下保温300小时以上仍能保持较高催化活力，因而运用到生产中，具有储运成本低，加快动力学反应，对反应器冷却系统要求标准低等优点。同时，具有β-葡萄糖苷酶活性，并且可以在不破坏皂苷结构的基础上，水解主要二醇型人参皂苷C3位和C20位的葡萄糖苷生成稀有人参皂苷Compound K，具有高效、专一、副产物少、产率高等优点，因而可将Fpglu1a应用到稀有人参皂苷Compound K的工业生产中。
【专利说明】超嗜热糖苷酶突变体及其在人参皂苷CK制备中的应用

【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术工程【技术领域】，具体涉及一种来源于闪烁杆菌属 (Fervidobacteium)细菌的超嗜热糖苷酶突变基因、重组载体、生产突变体的基因工程菌， 以及该超嗜热糖苷酶突变体在稀有人参皂苷CK制备中的应用。

【背景技术】
[0002] 人参（Panax ginseng)是我国传统名贵中药材，具有悠久的历史。华夏的传统医 学认为人参能"主补五脏，安精神，安魂魄，止惊悸，除邪气，明目开心益智，久服轻身延年"。 人参皂苷是人参中的主要活性物质，且已经从人参中发现100多种天然人参皂苷产物，分 离40余种。各种人参皂苷的含量不同，结构多样，药理活性也有很大的差别。研宄发现某 些在人参中含量极低的稀有人参皂苷（如Rg3、F2、Rh2、Compound K、Compound Mc等）才 具有很高的药用价值和应用前景。
[0003] 稀有人参皂苷CK (Compound K)是人参或人参皂苷口服后在哺乳动物血液及器官 内的主要活性组分，体外细胞实验及体内动物模型实验证据表明，CK具有抗炎，保肝，降糖 和抗癌等重要生物活性，中国食品药品监督管理局已经批准进行CK预防和治疗关节炎症 的临床试验。因而稀有人参皂苷CK在药物开发等方面具有极其重要的应用潜力。但是人 参中并不含有或只含有痕量的人参皂苷CK，限制了其广泛应用。因此基于皂苷核心骨架和 化学结构相似原理，通过水解某些含量高、药效低的人参皂苷末端糖基来大量制备这些稀 有人参皂苷就成了目前最为可行的方法。化学水解法通常选择性较差，产率低，不易提纯， 同时容易造成环境污染。而糖苷酶水解法则具备区域选择性和立体选择性高、得率高、副产 物少、无污染和容易工业化生产等优点，被认为是制备稀有人参皂苷最具有潜力的方法。
[0004] 来源于嗜热菌的嗜热糖苷酶，由于具有较高的催化活力和热稳定性，日益受到人 们的关注，成为嗜热糖苷酶基础研宄和开发新型糖苷酶制剂的热点。关于嗜热酶，自1985 年第一种嗜热酶即Taq DNA聚合酶被成功地用于聚合酶链式反应（PCR)后，生长在特殊高 热环境下的微生物正日益引起人们的重视。许多具有水解酶活性的嗜热酶（thermophilicenZyme，55-80°C)相继得到了开发，并在许多领域发挥了重要作用。近年来，人们从海底热 流的嗜热古细菌中分离得到超级嗜热酶（hyperthermophilic enzyme，80-113°C )，为现代 酶工程技术展现了新的应用前景。嗜热酶不仅具有化学催化剂无法比拟的优点，如催化效 率髙和底物专一"性强，而且酶的稳定性极好。因而它可以克服中温酶（mesophilic enzyme， 2〇-55°C )及低温酶（psychrophilic enzyme，-2_20°C )在应用过程中常常出现的生物学 性质不稳定的现象，从而使很多髙温化学反应过程得以实现，这将极大地促进生物技术产 业的发展，从而带动技术水平和生活质量的提高。
[0005] 利用嗜热酶作为生物催化剂有如下优点：（1)酶制剂的制备成本降低。因为嗜热 酶的稳定性高，因而可以在室温下分离提纯和包装运输，并且能长久地保持活性。（2)加快 了动力学反应。随着反应温度的提高，分子运动速度加快，酶催化能力加强。（3)对反应器 冷却系统的要求标准降低，因而减少了能耗。（4)提高了产物的纯度。在嗜热酶催化反应条 件下（超过70°C)，很少有杂菌生存，从而减少了细菌代谢物对产物的污染。由于嗜热酶的 髙温反应活性，以及对有机溶剂、去污剂和变性剂的较强抗性，使它在食品、医药、制革、石 油开采及废物处理等方面都有广泛的应用潜力。
[0006] 由于嗜热菌人工培养困难，生长周期较长，糖苷酶的含量很低，因此不利于直接利 用嗜热菌来生产耐热糖苷酶。


【发明内容】

[0007] 本发明提供一种超嗜热糖苷酶突变体及其在人参皂苷CK制备中的应用，以解决 嗜热菌人工培养困难，生长周期较长，糖苷酶的含量很低，因此不利于直接利用嗜热菌来生 产耐热糖苷酶的问题。
[0008] 本发明采取的技术方案是：超嗜热糖苷酶突变基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1 所述。
[0009] 本发明提供由上述超嗜热糖苷酶基因突变后构建的重组质粒和重组工程菌。
[0010] 本发明提供一种利用上述重组工程菌制备的超嗜热糖苷酶突变体FpglUla ;
[0011] 本发明超嗜热糖苷酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所述。
[0012] 本发明提供上述超嗜热糖苷酶突变体在稀有人参皂苷CK生产中的应用。
[0013] 我们通过野生型菌体的培养、全质粒PCR，则得到本发明所述的超嗜热糖苷酶突变 重组质粒，我们委托鼎国生物（上海）进行基因测序，测序结果如SEQ ID NO :1所述。
[0014] 将获得的超嗜热糖苷酶基因突变质粒按照生物学常规方法导入Escherichia coli BL21(DE3)(购自于Novagen公司）宿主中，构建出突变体工程菌。
[0015] 以野生型及突变体工程菌为出发菌株进行细菌培养和IPTG诱导，表达所需的野 生型及突变体酶。经实验验证目的蛋白均为胞内酶，需通过细胞的超声破碎方法使菌体破 裂，再通过高速离心、镍柱亲和层析纯化、SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳等方法获得高纯度 的目的蛋白。
[0016] 分离自热喷泉等自然极端热环境的闪烁杆菌属（Fervidobacterium)细菌属于嗜 热真细菌，从闪烁杆菌属细菌中分离得到的嗜热酶多具有很好的酶学性质和应用潜力。对 多节闪烁杆菌（Fervidobacterium pennivorans DSM9078)基因组的分析，我们发现在此 菌的基因组中可能包含几个嗜热的糖苷酶基因。应用分子生物学技术，我们对其中一个糖 苷酶基因突变体进行了克隆和表达，表达蛋白具有与野生型相比更高的葡萄糖苷酶活 性，进一步的酶学研宄证实，这一蛋白是一种性质优良的超嗜热β-葡萄糖苷酶。
[0017] 我们对大肠杆菌工程菌表达的野生型超嗜热糖苷酶及其突变体进行了活力测定 实验，证实它们对对硝基苯-β -D-葡萄糖苷和对硝基苯-β -D-半乳糖苷具有很高的水解 活性。且突变体水解对对硝基苯-β-D-葡萄糖苷的水解活力是野生型的2. 5倍。与其它 一些糖苷酶相比，超嗜热糖苷酶突变体具有很强的热稳定性，温度达到l〇〇°C时活力持续上 升，在70°C及80°C下保温超过300小时仍能保持80%以上的活力，未达到半衰期；酶液在 90°C的半衰期可达到3. 5小时。因而Fpglula属于超嗜热酶，在应用中具有酶制剂成本低、 具有储运成本低，加快动力学反应、对反应器冷却系统要求标准低，同时具有β -葡萄糖苷 酶活性，并且可以在不破坏皂苷结构的基础上，水解主要二醇型人参皂苷C3位和C20位的 匍萄糖昔生成稀有人参阜昔Compound Κ，具有尚效、专一、副广物少、广率尚等优点，因而可 将Fpglula应用到稀有人参皂苷Compound K的工业生产中，为其工业化应用奠定了基础。
[0018] 通过对超嗜热糖苷酶突变体转化稀有人参皂苷的研宄，该嗜热糖苷酶能够水解二 醇型人参皂苷Rbl，Rb2和Rc，转化产物利用HPLC和LC-MS进行了准确快速地鉴定，结果表 明，Fpglula转化人参皂苷Rbl，Rb2和Rc的终产物均为人参皂苷CK。

【专利附图】

【附图说明】
[0019] 图1是超嗜热糖苷酶野生型基因 PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；
[0020] 左道：DNA分子Marker DL5000 ;右道：超嗜热糖苷酶野生型基因的PCR扩增产物， 右道在分子量IOOObp处有明显亮带，与预期的分子量1398bp相符，所以我们通过PCR方法 所钓取的基因即为本专利所述超嗜热糖苷酶野生型基因。
[0021] 图2是质粒重组过程图；
[0022] 图3是超嗜热糖苷酶及其突变体变性电泳分析图，从左往右依次：蛋白质分子量 Marker，超声破碎粗酶和镍柱亲和层析所得的野生型酶及突变体酶；
[0023] 图4是温度对超嗜热糖苷酶突变体活力影响曲线图；
[0024] 图5是pH对超嗜热糖苷酶突变体活力影响曲线图。
[0025] 图6是超嗜热糖苷酶突变体转化人参皂苷Rbl不同时间的HPLC图；其中（A)八种 人参皂苷标准品的HPLC图，（B)突变体转化人参皂苷Rbl在0小时的HPLC图，（C)突变体 转化人参皂苷Rbl在0. 5小时的HPLC图，（D)突变体转化人参皂苷Rbl在12小时的HPLC 图；
[0026] 图7是超嗜热糖苷酶突变体转化人参皂苷Rb2不同时间的HPLC图；其中（A)八 种人参皂苷标准品的HPLC图，（B)突变体转化人参皂苷Rb2在0小时的HPLC图，（C)突变 体转化人参皂苷Rb2在6小时的HPLC图，（D)突变体转化人参皂苷Rbl在36小时的HPLC 图；
[0027] 图8 :超嗜热糖苷酶突变体转化人参皂苷Rc不同时间的HPLC图；其中（A)八种人 参皂苷标准品的HPLC图，（B)突变体转化人参皂苷Rc在0小时的HPLC图，（C)突变体转化 人参皂苷Rc在8小时的HPLC图，（D)突变体转化人参皂苷Rc在36小时的HPLC图；
[0028] 图9是Rc转化产物1的电喷雾离子质谱图；
[0029] 图10是Rc转化产物1的质谱串联棒状图；

【具体实施方式】
[0030] 实施例1嗜热细菌糖苷酶工程菌的构建及其酶的表达
[0031] (1)嗜热细菌 Fervidobacterium pennivorans DSM 9078 的培养及其染色体 DNA 的提取
[0032] 嗜热细菌 Fervidobacterium pennivorans DSM 9〇78 购自 DSMZ (德国）培 养条件是根据 DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)提供的培养基配 方，每升 Fervidobacterium pennivorans DSM 9078 的培养基组成成分如下：NH4Cl, 0. 5g ；MgS04X 7H20? 0. 16g ；KH2P04? I. 6g ；Na2HP04X H20? I. Og ；CaCl2 X 2H20? 0. 06g ；trace mineral solution，10ml ;Vitamin solution，10ml ;yeast extract，2g ;trypticase， 2g ；resazurin, 0. 5mg ；glucose,3g ；Cysteine-HCl XH20,0. 3g ；Na2SX9H20,0. 3g〇 其中每 升 trace mineral solution 的组成如下 mitrilotriacetic acid, I. 5g ；MgS04X 7H20, 3g ;MnS04 · H20,0. 5g ;NaCl，I. Og ;FeS04 · 7H20,0. Ig ;C〇S04 · 7H20,0. 18g ;CaCl2 · 2H20， 0· Ig ;ZnS04X7H20,0. 18g ;CuS04X5H20,0. Olg ;KA1 (SO4)2X 12H20,0. 02g ;H3B03,0. Olg ; Na2MoO4 · 2H20,0. Olg ;NiCl2X6H20,0. 03g ;Na2Se03X 5H20,0. 3g。每升 Vitamin solution 的配方如下：Biotin，2mg ;Folic acid，2mg ;Pyridoxine_HCl，IOmg ;Thiamine_HCl X 2H20， 5mg ；Riboflavin,5mg ；Nicotinic acid，5mg ;D_Ca-pantothenate，5mg;Vitamin B12， 0. Img ；p-Aminobenzoic acid, 5mg ；Lipoic acid，5mg〇 Fervidobacterium pennivorans DSM 9078 (菌种保藏号DSM9078)的干细胞加入Iml上述培养基，重悬后转移至装有IOmL新 鲜上述培养基的培养管中，稍微旋转培养管以混匀；通入氮气3分钟以除尽培养管内的氧 气，之后置于高温培养箱中65°C静止培养2天。然后转移至装有IOOrnl上述培养基的厌氧 培养瓶中65°C静止培养2天，8000rpm离心20分钟收集上述嗜热菌体，-40°C保存菌体备用
[0033] 取上述收集的菌体，应用细菌基因组DNA提取试剂盒（购自杭州维特洁生物公司） 按照说明书提取细菌基因组DNA，用0.8%的DNA凝胶电泳检测其纯度和浓度，并于-20°C保 存备用。
[0034] (2)来源于 Fervidobacterium pennivorans DSM 9078 的野生型葡萄糖苷酶基因 的克隆及表达。
[0035] 根据序列（序列号X74163)设计引物，
[0036] 引物 1 :5' -CAGCAGCATATGTTTCCAAAGTCATTTATG-3' (下划线处为 NdeI 的酶切位 点）；
[0037] 引物 2 :5' -CGAGCCCTCGAGTTAGAATTTCATCAAATTG-3' (下划线处为 XhoI 的酶切位 点）。
[0038] 两个引物所设置的酶切位点与表达载体pET28a的NdeI和XhoI相匹配，适合于在 大肠杆菌中高效表达。
[0039] PCR 反应：在 50 μ 1 反应体系中含 0· 5 μ I Ex-Taq DNA 聚合酶，5 μ I Ex-Taq DNA 聚合酶缓冲液，1 μ 1基因组DNA，1. 5 μ I dNTP混合物（每种核苷酸浓度25nmol/L)，1 μ 1 上游引物，1 μ 1下游引物，40 μ 1无菌超纯水。每循环中94°C变性1分钟，61. 8°C退火1分 钟，72°C延伸1分钟，最后一次循环延至10min，共30个循环。用1. 0%琼脂糖凝胶电泳检 测PCR产物，分子量与预期的（1398) -致，如图1所示。
[0040] 使用PCR产物纯化试剂盒（Bay Gene公司生产的PCR Clean-up Kit,步骤如下： 向PCR溶液中加入三倍体积的Buffer PCR-A，混匀；将上述溶液加入到DNA-prep柱子中， 12000rpm 离心 30 秒；向 DNA-prep 柱子中加入 500 μ IBuffer W2,12000rpm 离心 1 分钟，再 重复一次；把DNA-prep柱子转移到干净的I. 5ml microfuge tube，加入30 μ 1灭菌的去离 子水，室温放置一分钟后12000rpm离心1分钟即得到纯化的PCR产物）对扩增产物进行纯 化，-20 °C保存备用。
[0041] 将纯化的PCR产物用限制性内切酶NdeI酶切（20ul反应体系：IOul上述PCR产 物，5ul去离子水，2ul NEBuffer 4缓冲液，Iul NdeI酶），37°C下保温1小时后，直接加入 1 μ I Xhol，再在37°C下保温1小时。酶切完毕，在1. 0%的琼脂糖凝胶上电泳，应用DNA凝 胶检测试剂盒回收酶切后的DNA片段。1. 0%的琼脂糖核酸凝胶电泳检测凝胶回收的DNA 片段大小约1398bp，与目的DNA片段1398bp大小相符，说明所得DNA为目的DNA。
[0042] 将pET_28a载体（大肠杆菌表达载体，含有T7强启动子、C/N-末端组氨酸标签以 及卡那霉素抗性基因等）用限制性内切酶NdeI酶切（20ul反应体系：10ul pET-28a载体， 5ul去离子水，2ul NEBuffer 4缓冲液，Iul NdeI酶），37°C下保温1小时后，直接加入Ιμ? XhoI，再在37°C下保温1小时。酶切完毕，再用碱性去磷酸化酶（CIAP)处理，在0.8%琼脂 糖凝胶中检测线性载体并提纯酶切后的载体。在16°C应用T4DNA连接酶来连接已酶切的糖 苷酶基因片段和载体片段，得重组载体（构建过程如图2)。
[0043] (3)来源于 Fervidobacterium pennivorans DSM 9078 的葡萄糖苷酶突变基因的 克隆及表达。设计突变引物，具体是
[0044] 引物 1 :5,-GATACTCCT GCG GAATTTGCAAAATAC-3' ；
[0045] 引物 2 :5, -TGCAAATTC CGC AGGAGTATCATCAC-3, 〇
[0046] 全质粒PCR反应：在50 μ 1反应体系中含1 μ I Ex-Taq DNA聚合酶，5 μ I Ex-Taq DNA聚合酶缓冲液，1 μ 1基因组DNA，4 μ I dNTP混合物（每种核苷酸浓度25nmol/L)，1 μ 1 上游引物，1 μ 1下游引物，37 μ 1无菌超纯水。每循环中95°C变性40秒，62°C退火1分钟， 68°C延伸8分钟，最后一次循环延至lOmin，共30个循环。用0. 8 %琼脂糖凝胶电泳检测 PCR产物，分子量与预期的（6000bp) -致。
[0047] 使用PCR产物纯化试剂盒（Bay Gene公司生产的PCR Clean-up Kit)对扩增产物 进行纯化，_20°C保存备用。
[0048] 将纯化的PCR产物用Dpnl酶进行消化（50ul反应体系：30ul上述PCR产物，14ul 去离子水，5ul IOXT Buffer 4缓冲液，Iul Dpnl酶），37°C下保温1小时后用于转化。
[0049] (4)野生型及突变体的表达及纯化
[0050] 将重组质粒转入到大肠杆菌DH5a的感受态细胞中，进行平板初步筛选。挑取 单菌落，在5ml LB培养基中进行培养。利用PCR鉴定阳性克隆后，对目的基因进行基因 测序，并证明准确无误。为了表达目的蛋白，将连接成功的质粒转入到表达菌株E. coli BL21 (DE3)CodonPlus感受态细胞中进行表达。LB培养基组成如下：Bacto-Tryptone，L 0%; Bacto-Yeast Extract，。. 5% ;NaCl，0. 5%。
[0051] 重组菌按2%的接种量接种于5ml含100 μ g/ml卡纳霉素的LB培养基中，37°C，震 荡培养过夜。按同样的接种量接200ml LB培养基，37°C震荡培养直至0D_达到I. 0左右 时，加入终浓度为ImM的诱导剂IPTG，30°C下诱导过夜，经8000rpm离心20分钟之后，收集 得到菌体，于-20°C冰箱中保存，用于提取目的蛋白。
[0052] 本专利使用磷酸氢二钠-柠檬酸（pH7. 0)缓冲液作为制备粗酶液的重悬缓冲液。 菌体（5g)按l:6(w/v)加入30ml 20mM磷酸氢二钠-柠檬酸（pH7.0)缓冲液，超声破碎约 1小时（3sX3s)后，即溶液变得清亮，IOOOOrpm离心20分钟，收集上清得重组酶的粗酶液。
[0053] 粗酶液使用镍亲和层析的方法对重组糖苷酶进行分离和纯化，用150mM的咪唑溶 液洗脱与层析柱结合得到的纯的嗜热酶，应用SDS-PAGE(10% )电泳检测重组蛋白的纯度， 结果如图1所示，从左往右依次为蛋白质分子量Marker，超声破碎粗酶和镍柱亲和层析所 得的野生型酶及突变体酶，由此可见野生型及突变体酶蛋白均在33000Da附近出现一单一 电泳条带。
[0054] 实施例2超嗜热重组糖苷酶突变体的特性
[0055] (1)野生型及突变体糖苷酶的底物特异性
[0056] 称取各种对硝基苯酚糖苷底物，参照（1)所述糖苷酶测定条件进行酶活力测定。
[0057] 由表1可知，嗜热糖苷酶及其突变体对系列对硝基苯酚糖苷底物表现出不同的水 解活力，其中水解对硝基苯-β -D-葡萄糖苷的活力最高，且突变体水解对硝基苯-β -D-葡 萄糖苷的活力是野生型的2. 5倍左右。
[0058] 表1野生型超嗜热糖苷酶及其突变体底物选择性
[0059]

【权利要求】
1. 一种超嗜热糖苷酶突变基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所述。
2. -种由权利要求1所述的超嗜热糖苷酶突变基因构成的重组表达载体，其特征在 于：与表达载体pET-lla、pET-28a或pET-20b进行重组。
3. 如权利要求2所述的超嗜热糖苷酶突变基因构成的重组表达载体，其特征在于：表 达载体为pET-28a。
4. 一种导入由权利要求2或3所述的重组表达载体得到的重组工程菌，其特征 在于：将该重组表达载体导入Escherichia coli BL21(DE3)CodonPlus宿主细胞中或 Escherichia coli BL21(DE3)宿主细胞，得到重组工程菌。
5. 如权利要求4所述的重组工程菌，其特征在于：宿主细胞为Escherichia coli BL21(DE3) 〇
6. -种超嗜热糖苷酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO :2所述。
7. 权利要求6所述的超嗜热糖苷酶突变体在制备稀有人参皂苷CK中的应用。
【文档编号】C12N15/70GK104480127SQ201410766484
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年12月14日 优先权日:2014年12月14日
【发明者】于珊珊, 刘淑莹, 李晶, 郑飞, 许春春 申请人:长春中医药大学