一种嗜热酮还原酶突变体、编码基因及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种嗜热酮还原酶突变体、编码基因、重组载体及其应用。所述突变体由SEQ?ID?No.1所示氨基酸序列经点突变得到，所述点突变为：第21位突变为亮氨酸，和/或第118位突变为组氨酸或谷氨酸。本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种嗜热酮还原酶突变体，突变特定位置的氨基酸生成的突变体同野生型酶相比，在热稳定性和催化活性相当的前提下，提高了反应产物的旋光选择性。
【专利说明】—种嗜热酮还原酶突变体、编码基因及其应用
(-)【技术领域】
[0001]本发明涉及一种嗜热酮还原酶突变体、编码基因、重组载体及其应用。
(二)【背景技术】
[0002]生物学上，手性产物的生成可经过化学与酶的催化，不对称还原，多步反应合成。其中，生物催化的不对称还原在理论上说，在温和的条件下可以使产物对映选择性达到99%。然而，在本发明中超嗜热菌海栖热袍菌表达的蛋白Tm酶活反应初始时并不能使产物的单一构型达到理想值，需要在同源建模、分子模拟和化学分子量分析等基础上，对酶进行理性设计，定点突变，以期望能生成有效的生物催化酶。
[0003]目前越来越多的药物或其中间体是通过一种生物酶催化合成的方式，而非化学合成。很明显，酶催化相比于传统的化学合成有极大的优势:1，生物反应中可避免有毒的反应试剂或溶剂；2，酶具有高效率、底物特异性等特点，使得在反应中保护抗体的羰基团；3，避免了包括消旋化等在内的副反应。
[0004]国内外对于生物催化的研究越来越多，其中一个关键问题是所用的酶往往不能完全满足实际工业化生产的要求，需要经过进一步的改造，以提高其稳定性，活性及手性选择性。通过理性设计点突变的方法构建新酶更是一种常规方法。构建突变体酶改造的方法主要可分为三种类:非理性突变，半理性突变，理性突变。
[0005]非理性突变:首 先对基因随机突变，体外随机突变的技术多种多样，主要有易错PCR技术(error-prone PCR),DNA重排技术(DNA rearrangement method),基因家族重排技术(gene family rearrangement method)等,获得基因文库后进性筛选出有利的突变体。这种方法工作程序简单明了，可能会出现突变极好的突变体，但也可能不会。突变库容量较大，筛选出有利突变体的比例较低。
[0006]半理性突变:组合活性位点测试(CASTing)就是其中的一种。基本要点是:通过同源建模或晶体结构确定酶底物口袋中侧链朝向位点的氨基酸残基，同时选择可以与其相互作用的另一个残基，构建饱和突变体库，以达到减少突变库容量的同时增加筛选出有益突变的概率。其构库依据一般为选定底物口袋SA范围内的所有氨基酸残基，将侧链朝向底物口袋的选出，根据其所在的位点的二级结构(a螺旋为n+4，^折叠为n+2，loop为n+1)选定另一个氨基酸，针对这两个氨基酸构建饱和突变进行筛选。这种策略构建的突变库库容量小，有效性高。
[0007]理性突变:在酶-底物三维建模和底物对接的基础上，加以软件分析，通过化学量子计算、热能计算、分子动力学分析等，在酶活性中心区域选择有效的点进行定向突变，直接获得有益的突变体。这种方法突变库的量极小，筛选出优突变的概率基本上达到100%。然而，前期的计算工作量极大，时间长需要知识的较多前期积累，现阶段还无法达到通过先计算再进行定点定向突变的程序。
[0008]很多的文献和专利中都报道了关于酮还原酶催化还原含酮基底物生成羟基化的产物，使反应变得高效率，具有底物特异性或旋光纯选择性等优势。例如，有些研究是从赭色掷孢酵母提取出一种酮还原酶催化对取代乙酰苯(Cl-，Br-, Me-, OMe-, MeC3, CF3-等)，旋光选择性极低，需要通过理性设计突变位点，定点突变将其氨基酸序列中242位的甲硫氨酸以亮氨酸取代，氨基酸序列中245位的谷氨酰胺以脯氨酸取代，组成有效的双突变体酶。该突变体酶在原条件下催化具有各种取代基的对取代乙酰苯，使生成的产物构型由R-转变为S-，同时使原S-产物的ee值提高至99%。这一成果具有极高的价值。
[0009]也有相关研究如:提取于橘青霉的酮脂还原酶(ker)，用于催化4_溴_3_氧基丁酸生成高纯度的(S-) 4-溴-3-羟基丁酸，酶活稳定性低，一般在30°C热浴6h后酶活降低到初始酶活的15%。为了提高稳定性，易错聚合酶链式反应随机突变，然后对突变体进行高通量的筛选，最终获得热稳定性提高的单突变体，它们分别是在其特定氨基酸序列中54位的亮氨酸被谷氨酰胺取代成的单突变体，氨基酸序列中245位的精氨酸被赖氨酸取代成的单突变体，和氨基酸序列中271位置的天冬酰胺被天冬氨酸取代成的单突变体酶，尤其是氨基酸序列中54位的亮氨酸被谷氨酰胺取代的突变体酶在30°C热浴6h后，活性提高到初始酶活的62%，突变后的效果非常显著。
(三)
【发明内容】
[0010]本发明目的是提供一种产物ee值高的嗜热酮还原酶突变体、编码基因、重组载体及其应用。
[0011]本发明采用的技术方案是:
[0012]一种嗜热酮还原酶突变体，由SEQ ID N0.1所示氨基酸序列经点突变得到，所述点突变为:第21位突变为亮氨酸，和/或第118位突变为组氨酸或谷氨酸。
[0013]2-羟基-4-苯基丁酸乙酯(HPBE)是合成众多血管紧张素转化酶，抑制剂类治疗高血压和充血性心力衰竭药物的关键手性中间体。如:苯那普利(Benazepril)、依那普利(Enalapril )、赖诺普利(Lisinopril )、西拉普利(Cilazapril )、培哚普利(Perindopril )、喹那普利(Quinapril)、螺普利(Spirapril)和雷米普利(Ramipril)等。因此，2_轻基-4-苯基丁酸乙酯在该类药物合成中具有相当的重要性，它的制备一直是国内外研究的热点之一，吸引了许多的化学科技工作者对其制备方法进行广泛的研究，报道了大量的制备方法。
[0014]海栖热袍菌表达的酮还原酶Tm能够催化特异的酮酯，并能够改变其催化效率与对映选择性。本发明以EOPB为模式底物，该酶能够催化EOPB不对称加氢合成S-HPBE达到ee值为81%，通过对该酶活性区域理性设计/定点突变。W21，W86，P87，W118四个点进行定点饱和突变筛选出突变体，提高其ee值，但并尽量不减少其酶活稳定性、米氏参数和比活。这样就能获得理想的酮还原酶。
[0015]从海栖热袍菌提取可编码醛酮还原酶的基因Tm，经过保守序列比较、同源建模等方式分析，其开放阅读框是861bp，编码蛋白的理论相对分子质量是33.23kDa，利用PET28a(+ )构建基因tadh的大肠杆菌表达系统。将重组的特定位点基因突变导入受体细胞反应，其是否成功可通过合成寡核苷酸进行测序检验。本发明中的突变体酮还原体酶的合成及验证必须经过以下过程:
[0016]1、通过PCR定点突变来改变编码酮还原酶的特定基因，其中应有到的原料脱氧寡核苷酸，Taq酶，Mg2+，及PCR缓冲液都是由公司购买而来的。新合成的寡核苷酸链酮母链是相同的，但只有被突变的位点氨基酸改变。
[0017]2、将突变后的基因转到一个克隆载体上，形成一个完整重组质粒。将重组质粒转化到感受态细胞内，在适宜的培养基内培养宿主细胞。
[0018]3、活化表达酮还原酶，分离、收集并纯化。
[0019]4、检测单突变体酶催化生成的产物的ee值和转化率，选择合适的突变体。
[0020]5、根据步骤1，克隆双突变体。
[0021]6、催化突变体催化反应，并检测其还原酶活力、旋光选择性及热稳定性。
[0022]肽链的合成可通过DNA序列和还原的氨基酸序列鉴定出来。由于遗传密码子的自然退化，导致一个密码子翻译多个氨基酸或终止信号，或者其它的DNA序列编码相同的氨基酸序列等等。这样就可以理解关于这些DNA和氨基酸序列的等位基因的突变体的存在是一种很自然的现象。同时我们可以有目的性的引导这种突变。氨基酸序列中插入、取代或缺失、颠倒或其在其一个或两个末端添加数个氨基酸而得到，且与原来所示的氨基酸序列具有90%以上的同一性，且保持其酮还原酶活性。这些氨基酸的替代可以建立在其本身极性、带电性、可溶性、疏水性、亲水性、两亲性的相似性的基础上。例如，带负电的氨基酸有天冬氨酸和谷氨酸，带正电的氨基酸有赖氨酸和精氨酸，含有不带电的极性基团的氨基酸和含有非极性基团的氨基酸具有相似的亲水性，如:亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，甘氨酸，丙氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，苯丙氨酸，和络氨酸。前面所说的聚合肽链的盐类和脂类可以发生突变，同样也有前面所说的聚合肽链的前导序列。比如，前导序列含有N-末端的甲硫氨酸，可能会被N-甲酰甲硫氨酸所替代，从而发生突变。这些突变在本发明中都有可能出现。
[0023]这里的酮还原酶的基因突变具有能够催化底物生成旋光纯产物。而定点的选择可依赖于蛋白的晶体结构图谱，分子同源建模，化学分子量分析，分子生物学和蛋白化学技术的基础上进行参考分析。这些选择出来的特殊氨基酸位置是影响该酶催化特性的重要因素，可通过X-射线晶体图谱结构上确定，在本发明酮还原酶中的突变位点包括Trp21，Trp86, Pro87, Trpll80
[0024]优选的，所述突变体氨基酸序列为下列之一:SEQ ID N0.3 (突变体W21L)、SEQ IDN0.4 (突变体 W21L/W118E)、SEQ ID N0.5 (突变体 W21L/W118H)。
[0025]本发明还涉及编码所述的嗜热酮还原酶突变体基因，以及含有所述基因的重组载体和基因工程菌。本领域普通技术人员根据本发明提供的突变体氨基酸序列，可以方便的进行重组获得基因工程菌，以基因工程菌发酵培养获得的菌体细胞或菌体细胞破碎后的上清液作为酶源，可催化含酮基底物还原获得光学纯手性醇。其酶液纯化的过程可通过Ni+柱纯化、盐析、脱盐等步骤，或者通过70~80°C热纯化IOmin~3h等方式。转化可按下述方法进行:在pH6.0~8.0的磷酸盐缓冲液中，在NADP+、葡萄糖脱氢酶、葡萄糖存在下，在本发明酮还原酶作用下，不对称还原含酮基底物，制得手性醇。
[0026]本发明还涉及所述的基因在制备重组嗜热酮还原酶中的应用。
[0027]本发明还涉及所述的嗜热酮还原酶突变体在催化2-氧代-4-苯基丁酸乙酯不对称加氢合成(S ) -2-羟基-4-苯基丁酸乙酯中的应用。
[0028]优选的，所述不对称加氢合成在10~80°C下进行。
[0029]在本发明中，从海栖热袍菌中找到可编码醛酮还原酶的基因Tm，可表达的热稳定酮还原酶在有机合成中有着较大的应用潜力，该酶能够特异性催化酮酯，并通过同源建模/理性设计等技术提高催化效率，改变产物的对映选择性，并提高其ee值。所以本发明以2-氧代-4-苯基丁酸乙酯(EOPB)作为研究对象。原始的Tm酶不对称还原EOPB生成2-羟基-4-苯基丁酸乙酯(HPBE)共两种构型R-与S-，其中S-构型的对映选择性只达到81%，而本发明通过定点突变可使其达到99%。
[0030]本发明的有益效果主要体现在:本发明提供了一种嗜热酮还原酶突变体，突变特定位置的氨基酸生成的突变体同野生型酶相比，在热稳定性和催化活性相当的前提下，提高了反应产物的旋光选择性。
(四)【专利附图】
【附图说明】
[0031]图1为不同温度下野生型和双突变体的酶活。
(五)【具体实施方式】
[0032]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此:
[0033]实施例1:第一轮突变
[0034](一)设计引物并构建突变文库
[0035]将点W21，W86，P87，W118进行定点饱和突变，因此利用oligo7软件设计平末端引物，共四条反向引物，和33条正向引物。然后进行PCR定点突变。本次PCR突变采用KOD-Plus-Neo DNA聚合酶试剂盒(购买来自东洋纺科技有限公司，上海。)
[0036]表1:定点突变的弓丨物设计
[0037]
【权利要求】
1.一种嗜热酮还原酶突变体，由SEQ ID N0.2所示氨基酸序列经点突变得到，所述点突变为:第21位突变为亮氨酸，和/或第118位突变为组氨酸或谷氨酸。
2.如权利要求1所述的嗜热酮还原酶突变体，其特征在于所述突变体氨基酸序列为下列之一:SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5。
3.编码权利要求1或2所述嗜热酮还原酶突变体的基因。
4.含有权利要求3所述基因的重组载体。
5.含有权利要求3所述基因的重组基因工程菌。
6.权利要求3所述的基因在制备重组嗜热酮还原酶中的应用。
7.权利要求1所述的嗜热酮还原酶突变体在催化2-氧代-4-苯基丁酸乙酯不对称加氢合成(S) -2-羟基-4-苯基丁酸乙酯中的应用。
8.如权利要求3所述的应用，其`特征在于所述不对称加氢合成在10~80°C下进行。
【文档编号】C12N15/53GK103614347SQ201310454764
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年9月27日 优先权日:2013年9月27日
【发明者】陈振明, 张双玲, 王志国, 周硕, 赖敦岳, 张飒 申请人:杭州师范大学