一种血细胞分离管的制作方法

一种血细胞分离管的制作方法
【专利摘要】本实用新型涉及一种血细胞分离管，所述分离管由管体、旋盖、置于管体内的细胞分离隔膜和加样滑板组成；所述分离管管体是一个底部为半圆形或圆锥形的离心管，管口处有用于固定所述旋盖的外螺纹，所述分离隔膜固定在所述分离管内接近分离管管底处；所述加样滑板由一个圆盘和与所述圆盘边缘连接的∩型推杆组成，所述推杆的另一端设有一个椭圆形的推杆柄，所述圆盘边缘与所述分离管内壁之间有一个狭窄的环形间隙。本实用新型提供的血细胞分离管通过改变加样和取样方式使传统的、复杂的加样模式变成易于操作的方式，使得临床医学检验和细胞生物学研究中的细胞分离过程更简化、操作更容易。
【专利说明】一种血细胞分离管

【技术领域】
[0001] 本实用新型涉及生物医学领域的细胞分离技术，具体涉及一种血细胞分离管，本 实用新型提供的血细胞分离管基于细胞密度梯度离心分离细胞的原理，通过改变加样和取 样方式使传统的、复杂的加样模式变成易于操作的方式。

【背景技术】
[0002] 在临床医学检验中，针对特定细胞功能和生物学特性的检查常常涉及到细胞的分 离技术，从外周血液和各种体液（胸水、腹水、心包积液等）中分离单个核细胞是体外进行 淋巴细胞免疫学研究和细胞学实验的重要前处理步骤，分离的目的细胞的质和量是保证后 续实验可靠性的重要环节。
[0003] 外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)是参与机体 免疫应答反应的一类重要免疫细胞群。PBMCs主要包含淋巴细胞和单核细胞，PBMCs中大部 分（80 %?90 % )为淋巴细胞，其余成分是单核细胞，淋巴细胞包括T淋巴细胞和B淋巴细 胞两大类，这两种免疫细胞按其细胞表面标志和细胞功能又分为不同的细胞亚群，按照淋 巴细胞表面标志T淋巴细胞有⑶3+、⑶4+、⑶8+、⑶28+、⑶38+、⑶45+细胞等等，按照功能分 还有辅助T细胞（helper T cell，Th)、效应T细胞（Effector T cells, Te)、迟发性变态反 应 T 细胞（Delayed type hypersensitivity T cells, Td)和细胞毒性 T 细胞（Cytotoxic T cells，Tc)等等；B淋巴细胞有B1、B2两种亚型，对不同淋巴细胞亚群的分离、鉴别以及功 能的研究对疾病的诊断乃至治疗都有十分重要的临床意义。
[0004] 任何疾病的发生、发展都有相应淋巴细胞的数量、形态或者功能的改变，从细菌、 病毒等一些病源微生物对人类的感染到肿瘤的发生以及一些免疫缺陷病、自身免疫性疾病 和遗传性疾病等许多疾病都有淋巴细胞参与的应激性免疫反应，表现为某些细胞亚群数量 的改变、淋巴细胞膜表面标志物的变化或者引起细胞功能的变化（细胞因子的分泌或抗体 的产生），例如结核分枝杆菌侵入人体后会迅速被体内的淋巴细胞所识别，从而引起相应的 细胞免疫反应，导致初始淋巴细胞在结核抗原刺激下转化成效应T淋巴细胞，这些效应T淋 巴细胞再次受到结核杆菌特异性抗原刺激后会产生相应的细胞因子Y-干扰素，体外检测 这些分泌Y-干扰素的效应T淋巴细胞对于诊断结核分枝杆菌感染具有重要的临床意义。
[0005] 淋巴细胞的分离方法有多种，这些分离方法的原理是根据各种细胞间的密度差 异、细胞的粘附特性或者细胞膜表面标志的不同等物理的和生物学性能而设计的，主要方 法包括粘附分离法、密度梯度离心法、免疫磁珠法和流式细胞仪法等。
[0006] 粘附分离法是根据细胞对玻璃、尼龙棉等不同材质接触表面的粘附差异分离细胞 的，被分离的混合细胞流经吸附物体表面时粘附性高的细胞附着在吸附物表面，粘附性低 的随液流被冲走。中国专利CN87102643A公布一种基于细胞粘附性质设计的细胞分离器， 该专利对细胞吸附材料的制作进行优化，目的是提高分离细胞的纯度和比例。粘附分离法 分离目的细胞的回收率除了与选择的吸附材料有关外，还与分离时控制输入细胞的流速有 关，为此中国专利CN200520134012公布了一项微流体细胞分离装置制造方法，该装置在 控制被分离的混合细胞流速方面做了一些尝试。粘附分离法需要控制被分离混合细胞的输 入速度，操作比较麻烦，这种方法细胞分离纯度不高、回收率也低。
[0007] 免疫磁珠法是应用抗原抗体特异性结合的原理分离细胞的，在各类淋巴细胞亚群 的细胞膜上有不同的分化抗原，利用标记不同单克隆抗体的免疫磁珠与具有相同抗原表位 的淋巴细胞特异性结合，然后在磁力场或者离心力的作用下将不同的淋巴细胞分离，这种 分离细胞的方法如同用鱼饵钓鱼，免疫磁珠相当于鱼饵，由于具有特异性结合的特性，所以 免疫磁珠法具有分离纯度较高的特点，通常分离纯度能达到90%?99%，细胞的收获率也 相对较高，但是，免疫磁珠分离的淋巴细胞的效果和活力受磁珠的种类和标记抗体的影响， 而且成本高。
[0008] 流式细胞分离法是20世纪70年代发展起来的细胞鉴定和分选技术，它将激光技 术、计算机技术、电子物理技术、光电测量技术、荧光化学技术以及单克隆抗体技术融合，使 流式细胞仪得以诞生。流式细胞仪将细胞的分离和鉴别合二为一，其分离细胞的原理是： 细胞液流在高频超声振荡波的作用下分成均匀的含单个细胞的微小液滴，液滴在交变电场 的作用下极化成带有不同电荷微粒，不同种类的细胞极化后带的电荷密度不一样，这些带 电微粒在电场力的作用下发生偏离，由此实现对带有不同表面抗原的淋巴细胞分离。如果 将液流中的某些细胞预先用荧光染色抗体或者DNA染料标记，标记的细胞会被流式细胞仪 中的光电检测系统识别，从而实现对细胞的自动分析。目前，流式细胞分离技术已经比较成 熟，流式细胞术在分选细胞的同时还可以同时检测细胞的DNA含量、细胞体积、细胞膜受体 和表面抗原以及细胞所处周期等许多生物信息，但是，用流式细胞术分选细胞成本较高，分 离过程可能对细胞有损伤，从而影响细胞的活性。另外，该方法不能进行无菌操作，这使得 分选的细胞不宜再做培养方面的研究。
[0009] 免疫磁珠法和流式细胞分离法分离的淋巴细胞对分离样本有选择，通常这两种方 法使用的样本是经过密度梯度离心方法分离获得的混合淋巴细胞，这也是上述两种方法能 获得较高纯度的重要原因。
[0010] 在多种细胞分离方法当中，Ficoll-Hypaque密度梯度离心法是分离淋巴细 胞最传统和经典的方法，这种方法是利用密度接近单个核细胞的聚蔗糖-泛影葡胺 (Ficoll-Hypaque)细胞分离液分离目的细胞的，原理是利用人类血液中各种血细胞之间 存在密度差异，例如红细胞密度为1. 090?1. 093,粒细胞密度为1. 090?1. 092,单个核 细胞的密度为1. 075-1. 090,血小板为1. 030?1. 035。Ficoll-Hypaque是一种密度为 1. 077±0. 001g/L与血浆等渗的低粘度混合溶液，如果将全血叠加在Ficoll-Hypaque分离 液上面在离心力场的作用下，各种血液成分将按密度梯度重新分布聚集，红细胞与粒细胞 由于密度较大，离心后沉降在分离液的底部，血浆和血小板密度较低，离心后悬浮在分离 液的上面，单个核细胞密度接近于分离液，由于分离液对单个核细胞的浮力作用大于离心 力的作用，所以使单个核细胞不会下沉，离心后依然位于分离液界面上，这样就可以分离 获得单个核细胞。密度梯度离心分离单个核细胞的主要优点是：
[0011] ⑴操作步骤比较简单，适合大量样本的分离；
[0012] ⑵能够实现无菌操作，分离的单个核细胞适宜临床应用；
[0013] ⑶对分离的单个核细胞的损伤较小。
[0014] 正是由于密度梯度离心法具有的上述这些优点，才使得它作为最经典的细胞分离 方法占有重要的地位，虽然新的细胞分离方法不断出现，但是，密度梯度离心法具备的这些 优势是其他方法难以替代的。尽管如此，密度梯度分离法也受一些因素影响，其主要影响因 素包括：
[0015] ⑴分离液的化学组成成分及性质；
[0016] ⑵将样本叠加在分离液液面上的操作技巧；
[0017] ⑶离心力和离心时间；
[0018] ⑷样本抗凝和被稀释比例；
[0019] (5)离心过程的温度控制。
[0020] 分离液的化学组成和性质是决定分离效果的重要的因素，为此一些研究人员通 过改变分离液的组成成分借此提高单个核细胞的分离效果，目前除了由聚蔗糖_泛影葡 胺制备的分离液，人们也开发了由不同化合物组成的密度梯度分离液，比如由Percoll 硅胶颗粒制备的连续或不连续的密度梯度分离液，这种分离液能选择性地分离某种类型 的免疫细胞，并且可以提高分离的目的细胞的纯度。邹常春等（实验与检验医学，2009， 27(4) :337-344)报道了一种改良的从全血中分离中性粒细胞的方法。2012年中国专利 CN201110456878公布了一种复方淋巴细胞分离介质，配方中的全部原料均符合静脉注射级 原料药的标准，原料的安全性高，分离的淋巴细胞纯度及淋巴细胞回收率与常规分离液比 无显著差异。另外一项中国专利CN20121011408公布了由羟乙基淀粉替代右旋糖酐的细胞 分离液的制备方法，这种组合方法进一步提高了分离液的生物安全性，使得分离的淋巴细 胞状态更好，活力更高。
[0021] 密度梯度离心法是根据各种血细胞之间的密度差异分离单个核细胞的，由于分离 液的密度最接近目的细胞，因此，离心后这些细胞被富集在分离液的上面，形成一层浓集的 目的细胞层。一般情况下通过优化离心力、离心时间等条件密度梯度离心法分离的目的细 胞混有其他杂细胞的数量是可以控制的（郭继强，刘爱兵，沈丹等.中国组织工程研究与康 复.2011，15(45) :8447-8450 ;樊卫平，宋玉靖，郝颜琴等，山西医科大学学报，2010, 41(3): 274-284)。但是，任何改变分离液密度的因素都会影响密度梯度离心法的分离效果，分离液 密度的变化不仅会影响分离的目的细胞的数量，还可能导致富集的目的细胞层中混入其他 的杂细胞。为了不影响分离液的密度，除了离心时应控制适当的温度外，再有就是在加入样 本时操作必需非常小心，不能让样本冲散分离液液面，如果有部分样本与分离液混合，势必 会改变分离液的密度，影响分离效果。
[0022] 密度梯度离心法的操作过程有以下几个步骤：⑴将样本（如外周血液）用细胞培 养液或生理盐水1 : 1?1 : 2稀释，使各类细胞充分分散；⑵将1/2样本量的分尚液加入 离心管中；⑶用巴氏吸管将稀释样本沿离心管管壁缓慢加到分离液的上面，尽量保持加入 样本与分离液液面清晰；⑷以500?1000g的离心速度离心20?30min ;(5)用巴氏吸管吸 取目的细胞层。上述第⑶、第(5)步骤是密度梯度离心法操作最繁琐的步骤，操作生疏者不容 易掌握，对于操作熟练者也是一个繁琐、费力的事。 实用新型内容
[0023] 为解决密度梯度离心法加样、取样操作繁琐问题，本实用新型的目的是提供一种 血细胞分离管。
[0024] 为了实现上述目的，本实用新型采用了以下技术方案：
[0025] -种血细胞分离管，其特征在于，所述分离管由管体、旋盖、置于管体内的细胞分 离隔膜和加样滑板组成；所述分离管管体是一个底部为半圆形或圆锥形的离心管，管口处 有用于固定所述旋盖的外螺纹，所述分离隔膜固定在所述分离管内接近分离管管底处；所 述加样滑板由一个圆盘和与所述圆盘边缘连接的n型推杆组成，所述推杆的另一端设有一 个椭圆形的推杆柄，所述圆盘边缘与所述分离管内壁之间有一个狭窄的环形间隙。
[0026] 优选地，所述分离管分离隔膜以上的一段长度为3?5厘米的管壁或分离隔膜至 管口这部分管壁为相同内径的圆柱形结构。
[0027] 优选地，所述分离管内在所述分离隔膜以下预留的容积为3?5ml。
[0028] 优选地，所述分离隔膜上有1个或1个以上等间距分布的小孔，所述小孔的孔径相 同，所述孔径为1?l〇mm。
[0029] 优选地,所述小孔依轴心对称分布。
[0030] 优选地，所述环形间隙的宽度为0. 01?5mm，所述环形间隙的宽度使得在所述圆 盘以上加入一定量的血液样本时，所述血液样本在自身重力作用下不会通过所述环形间隙 向下泄漏，当改变所述圆盘的上下位置时，所述血液样本能够通过所述环形间隙自由流动。
[0031] 优选地，所述加样滑板和管体的材料选择非极性或弱极性的高分子聚合材料，这 些材料包括聚乙烯（PE)、聚丙烯（PP)、聚苯乙烯（PS)、聚碳酸酯（PC)、ABS以及SEBS其中 的任意一种。
[0032] 本实用新型的优点和积极效果在于：所提供的血细胞分离管与应用普通离心管分 离单个核细胞的方法相比，简化了后者复杂的操作过程，其特征是使常规的必需应用巴氏 吸管加样、取样操作简化了。
[0033] 本实用新型所提出的加样滑板改变了传统的加样方式，使血液样本与分离液的叠 加界面更清晰，并减少了不必要的失误。
[0034] 在以下本实用新型实施方案中，为了提高目的细胞的收率，采用在分离隔膜上增 加分离液的方式。因为有了加样滑板，加样时才可以直接倒入样本，这样不仅可以提高分离 细胞的收获率，又仍然保持简化的加样操作的特点。
[0035] 本实用新型所提供的血细胞分离管适用所有密度梯度分离介质，如将上述预充的 Ficoll-Hypaque分离液用Percoll分离液代替，在应用Percoll连续的密度梯度分离方式 时，加入分离液的方法与加入Ficoll-Hypaque分离液相同。本实用新型所提供的血细胞分 离管更适用于Percoll不连续密度梯度法分离细胞，在利用Percoll不连续密度梯度法分 离目的细胞时，可将密度较高的Percoll分离液加在分离隔膜以下，然后直接将密度较低 的Percoll分离液倒入分离管的适当的高度即可，由于有分离隔膜的阻挡，不必担心高密 度与低密度的Percoll分离液相互混合。
[0036] 本实用新型中，分离隔膜上的小孔依轴心对称分布，使流体通过分离隔膜后流速 均匀分布同时增加其流通系数；制作加样滑板和分离管的材料选择非极性或弱极性的高分 子聚合材料，这些材料包括聚乙烯（PE)、聚丙烯（PP)、聚苯乙烯（PS)、聚碳酸酯（PC)、ABS以 及SEBS其中的任意一种，这类材料的表面能低，润湿性差，所形成的缝隙能够利用液体的 表面张力特性呈现自封闭性。

【专利附图】

【附图说明】
[0037] 图1是血细胞分离管的完整结构图。
[0038] 图中1旋盖，2分离管管体，3推杆，4推杆柄，5加样滑板，6圆盘7分离隔膜 [0039] 图2是实例1的操作示意图。
[0040] 图中：I血浆层II单个核细胞层III分离隔膜IV红细胞层
[0041] 图3是实例2的操作示意图。
[0042] 图4是实例3的操作示意图。

【具体实施方式】
[0043] 实例1本实用新型的一个应用方式是，不用加样滑板的情况下也可以按照简化的 操作方法分离目的细胞。图2是本方案的示意图，在这项实施方案中可以将预分离血液样 本直接倒入分离管中，在血液样本倒入分离管过程中，分离隔膜将阻止样本与分离液混合， 选择2000转/分的离心速度离心20分钟，离心后红细胞通过分离隔膜沉积在分离管底，单 个核细胞则被富集在分离隔膜以上的细胞分离液和血浆层之间，取样时将分离隔膜以上的 液体直接倒入新的试管中即可。
[0044] 表1两种方法分离的淋巴细胞浓度、纯度和活力
[0045]

【权利要求】
1. 一种血细胞分离管，其特征在于，所述分离管由管体、旋盖、置于管体内的细胞分离 隔膜和加样滑板组成；所述分离管管体是一个底部为半圆形或圆锥形的离心管，管口处有 用于固定所述旋盖的外螺纹，所述分离隔膜固定在所述分离管内接近分离管管底处；所述 加样滑板由一个圆盘和与所述圆盘边缘连接的η型推杆组成，所述推杆的另一端设有一个 椭圆形的推杆柄，所述圆盘边缘与所述分离管内壁之间有一个狭窄的环形间隙。
2. 根据权利要求1所述的血细胞分离管，其特征在于，所述分离管分离隔膜以上的一 段长度为3?5厘米的管壁或分离隔膜至管口这部分管壁为相同内径的圆柱形结构。
3. 根据权利要求1所述的血细胞分离管，其特征在于，所述分离管内在所述分离隔膜 以下预留的容积为3?5ml。
4. 根据权利要求1或2所述的血细胞分离管，其特征在于：所述分离隔膜上有1个或1 个以上等间距分布的小孔，所述小孔的孔径相同，所述孔径为1?l〇mm。
5. 根据权利要求4所述的血细胞分离管，其特征在于，所述小孔依轴心对称分布。
6. 根据权利要求1或2所述的血细胞分离管，其特征在于，所述环形间隙的宽度为 0. 01?5mm，所述环形间隙的宽度使得在所述圆盘以上加入一定量的血液样本时，所述血 液样本在自身重力作用下不会通过所述环形间隙向下泄漏，当改变所述圆盘的上下位置 时，所述血液样本能够通过所述环形间隙自由流动。
7. 根据权利要求1或2所述的血细胞分离管，其特征在于：所述加样滑板和管体的材 料选择非极性或弱极性的高分子聚合材料，这些材料包括聚乙烯（PE)、聚丙烯（PP)、聚苯 乙烯（PS)、聚碳酸酯（PC)、ABS以及SEBS其中的任意一种。
【文档编号】C12M1/12GK204097473SQ201420358393
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2014年7月1日 优先权日:2014年7月1日
【发明者】宋雪, 程月红 申请人:北京圣浦博大生物科技有限公司