废弃羽毛发酵产物在制备黑水虻饲料中的应用的制作方法

本发明属于环境资源利用领域，涉及一种废弃羽毛发酵产物在制备黑水虻饲料中的应用。

背景技术：

黑水虻的幼虫含有大量的蛋白、脂肪、丰富的必需氨基酸和矿物质，能够用于生产具高经济价值的动物饲料；利用黑水虻脱脂蛋白为原料，可生产高档食品、保健品，其生物油脂，可用于生产护肤品；黑水虻的蛹壳含有丰富的几丁质，可用于水体净化，能够作为食品稳定剂和药品，还用于染料、织物、黏合剂等相关工业生产当中，以及作为工业用的离子交换树脂和分离薄膜，还能生产外科封口线。

目前尚未发现有将废弃羽毛进行发酵处理，并作为养殖饲料应用于黑水虻的养殖研究。

技术实现要素：

本发明的目的是将难以直接利用的羽毛角蛋白通过微生物发酵产生用于昆虫养殖，转化为昆虫蛋白。

本发明利用微生物降解废弃羽毛，以发酵后物质养殖黑水虻，依据黑水虻口食的广谱性，以实现资源化利用和昆虫的养殖。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明提供了废弃羽毛发酵产物在制备黑水虻饲料中的应用，所述废弃羽毛发酵产物采用如下方法制备：

S1.对废弃羽毛进行清洗、灭菌，加入发酵缓冲液；

S2.将蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)YSQ08菌种进行活化培养，得到活化后的菌液；然后加入到S1中进行发酵，得到发酵产物；

S1中，废弃羽毛质量占发酵缓冲液质量的1～5％，所述发酵缓冲液的pH值为7～10；S2中，蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)YSQ08于2012年09月03日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏编号为CCTCC No.M2012322；

S2中，将活化后的菌液按2～5％的质量百分比加入到S1含有废弃羽毛的发酵缓冲液中。

由于黑水虻并不能直接处理动物羽毛，因此需要将其进行发酵后，才能直接进行养殖黑水虻。

优选地，将S2中发酵产物离心，得到发酵上清液和发酵沉淀物，将发酵上清液制备成相应的干物质应用于黑水虻的养殖。

优选地，S1中，废弃羽毛质量占发酵缓冲液质量的3.5％，所述发酵缓冲液的pH值为7。

优选地，S2中，将活化后的菌液按3％的质量百分比加入到S1含有废弃羽毛的缓冲液中。

优选地，S2中，发酵的温度为37℃，发酵时间为6d。

优选地，S1中废弃羽毛为废弃鸡毛。

优选地，所述发酵缓冲液组成为：0.1～1.0g/L氯化钠，0.01～0.5g/L氯化钙，0.1～0.5g/L氯化镁，1.0～3.0g/L磷酸氢二钾，0.5～2.0g/L磷酸二氢钾。

优选地，所述黑水虻饲料应用于黑水虻的增重。

优选地，所述黑水虻饲料应用于降低饲料的料重比和/或饲料转化率。

优选地，所述黑水虻饲料应用于提高黑水虻的存活率。

本发明将动物废弃羽毛资源化，生物转化整合微生物发酵以及昆虫处理技术，达到羽毛废弃物减容化、资源化的目的。“羽毛废弃物生物转化”是指有羽毛经过特别筛选的高性能微生物发酵处理之后，变成可溶性蛋白质和多肽，提高角蛋白胃蛋白酶消化效率；接着，将发酵处理的废弃物配制成昆虫饲料，养殖黑水虻经济昆虫。通过这些手段得到昆虫蛋白，将角蛋白转化成为可利用的昆虫蛋白，从而实现羽毛角蛋白资源化利用。黑水虻幼虫取食过程中能够通过含有消化酶、抗菌肽的分泌物抑制微生物的生长，在体内还能消灭多种高致病性微生物，如霍乱、疟疾的病原物等。因此，经过黑水虻处理之后，不仅能够抑杀角蛋白酶发酵菌，避免发酵菌种威胁动物和人体的健康安全，而且角蛋白转化成为可利用的昆虫蛋白，一举两得，给羽毛资源化处理提供一个新型的生物技术方案。

根据本发明提供的方法，蜡样芽孢杆菌YSQ08(Bacillus cereus)在1d～10d内将鸡毛降解成游离氨基酸、短肽或絮状物。将发酵液、离心得到的上清液以及沉淀物分别经冷冻真空干燥制备成为干物质。发酵液干物质与发酵沉淀干物质的性状相近，颜色呈灰色，无明显的特殊气味，容易结团。两者蛋白质的含量均为90.0％左右，灰分约为8.50％，水分约为5.05％。而上清液干物质呈土黄色，无味，颗粒细腻轻盈，不粘稠，粗蛋白含量为94.36％，水分5.36％，灰分3.74％。

本发明中废弃羽毛采用生物技术处理，与传统羽毛粉加工方法相比：

一是反应条件温和，能耗较低，水解以及干燥过程的温度低，减少蛋白质变性以及氨基酸的损耗；二是增加了可利用氨基酸，改善羽毛粉产品中氨基酸的消化率，使动物必需氨基酸更加平衡，降低氮排放量，减少环境污染。生物技术处理法能够明显提高羽毛粉产品的营养价值，并且使产品中含有多种对动物机体有利的活性物质，比如消化酶类、益生菌及其代谢产物。因此采用生物技术生产的羽毛粉比常规方法拥有更高的经济价值。

二是应用于黑水虻的养殖中，养殖效果显著。本发明将发酵产物的总干物质，发酵产物离心获得的上清液干物质和沉淀干物质分别用于饲养黑水虻幼虫，以猪粪饲养作为对照，以平均增重、料重比、转化率、存活率作为指标。发酵上清液效果最优，黑水虻幼虫平均增重为0.2455g，料重比为1.4811，转化率为40.46％，黑水虻幼虫存活率达到90％以上。发酵液干物质与发酵沉淀干物质与猪粪在平均增重和转化率上表现相当，其中平均增重约为0.2200g，转化率约为22％，但这两组的料重比均低于猪粪组。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

本发明将废弃羽毛发酵产物，尤其是该发酵产物的发酵上清液制备成干物质作为饲料，应用于黑水虻养殖中，能够显著提升黑水虻的生长速度，增重效果明显，且有效降低饲料的料重比和饲料转化率，同时还能提高存活率，实现了羽毛的无害化、资源化及合理化应用和黑水虻养殖的低成本化，在养殖业废弃物利用和昆虫蛋白的开发具备广阔的应用前景。

附图说明

图1为发酵产物的性状。

图2不同口食来源对黑水虻平均增重的影响。

图3不同口食来源对黑水虻料重比的影响。

图4不同口食来源对黑水虻转化率的影响。

图5不同口食来源对黑水虻存活率的影响。

具体实施方式

以下结合具体实施例和附图来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。

以下实施例中采用的LB肉汤培养基制备为：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 5g混合，加蒸馏水定容至1000mL，pH7.0，121℃高压灭菌20min。

发酵缓冲液的制备：0.5000g氯化钠，0.0600g无水氯化钙，0.1000g氯化镁，1.4 000g磷酸氢二钾，0.7000g磷酸二氢钾，pH调至7.0，蒸馏水定容至1000mL。

蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)YSQ08，于2012年09月03日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏编号为CCTCC No.M2012322。

实施例1：

(1)采用平板划线培养的方法，将蜡样芽孢杆菌YSQ08(Bacillus cereus)进行活化，挑取单菌落，置于LB肉汤培养基中，摇床37℃，200r/min培养24h。采用诱导培养的方法，将活化好的菌液以2％加入到含羽毛的培养基中72h后，划线倒置培养14h，挑取单菌落进行液体培养，摇床37℃，200r/min培养14h。

将诱导好的蜡样芽孢杆菌YSQ08(Bacillus cereus)以添加量为2％加入到LB肉汤培养基中进行扩大培养3次，得到活化后的菌液。

(2)在鸡毛质量含量为3.5％的pH为7的发酵缓冲液中加入(1)中诱导培养好的3％的活化后的菌液。保持发酵温度为37℃，发酵时间为6d。

(3)将锥形瓶中的液体均匀倾倒于两个100mL离心管中，配平后对置于离心机中，3000r离心10min。取上层清液，用少量的蒸馏水清洗滤渣，再一次配平3000r离心10min。两次离心得到的上层清液即发酵液。离心后的沉淀物为发酵沉淀物。将发酵原液、上层清液、发酵沉淀物分别置于冷冻干燥机中，真空冷冻干燥后粉碎。

(4)每个重复试验取4日龄的黑水虻幼虫50头，放入长12cm、宽8cm、高10cm塑料盒中，每日加入少量不同处理的饲料，饲料面上覆盖纱布，防止水分散失快，盖上有小孔的盖子，以防止幼虫爬出；放入生化培养箱(30℃，RH80％，光周期14L∶10D)(喻国辉等，2014；Tomberlin et al.,2002)进行饲养；每日观察幼虫生长情况。饲养幼虫时饲料要分多次添加，及时添加发酵分解的羽毛物质，并保持其湿度；当出现一半预蛹时停止加料，并记录相关数据。以羽毛发酵液干物质、羽毛发酵上清液、羽毛发酵沉淀物干物质进行试验组试验，以猪粪作为对照组。

数据验证：

(1)幼虫增重

每个重复试验取4日龄的黑水虻幼虫50头，记录湿重。放入饲料中进行饲养，到出现一半预蛹时结束喂养。然后将幼虫用8目筛筛出，记录幼虫湿重。

幼虫增重＝m₁-m₀

m₁：出现一半预蛹时幼虫总湿量

m₀：4日龄的幼虫总湿重

(2)料重比

每个重复试验取4日龄的黑水虻幼虫50头，记录湿重。放入饲料中进行喂养，饲料分三次添加，记录每次添加饲料干重，到出现一半预蛹时结束喂养。然后将幼虫用8目筛筛出，记录幼虫湿重。

料重比＝m₂/m₃

m₃：幼虫增加总湿重

(3)转化率

每个重复试验取4日龄的黑水虻幼虫50头，记录湿重。放入饲料中进行喂养，饲料分多次添加，记录每次添加饲料干重，到出现一半预蛹时结束喂养。然后将幼虫用8目筛筛出，记录幼虫湿重。然后幼虫与剩余物料在80℃条件下烘24h分别称重。

转化率＝m₄/(m₂-m₅)

m₄：幼虫增加总干重

m₂：添加饲料总干重

m₅：剩余残渣总干重

(4)存活率

每个重复试验取4日龄的黑水虻幼虫50头，喂养到出现一半预蛹时结束，记录幼虫的存活数。

存活率＝存活数/50

将发酵液、离心得到的上清液以及沉淀物分别经冷冻真空干燥制备成为干物质。发酵液干物质与发酵沉淀干物质的性状相近，颜色呈灰色，无明显的特殊气味，容易结团(见图1所示)。两者蛋白质的含量均为90.0％左右，灰分约为8.50％，水分约为5.05％。而上清液干物质呈土黄色，无味，颗粒细腻轻盈，不粘稠，粗蛋白含量为94.36％，水分5.36％，灰分3.74％。说明上清液中含有大量的水溶性蛋白、小肽或氨基酸。

将上述三种干物质分别用于饲养黑水虻幼虫，以猪粪饲养作为对照，以平均增重、料重比、转化率、存活率作为指标。结果表明，发酵上清液效果最优，黑水虻幼虫平均增重为0.2455g，料重比为1.4811，转化率为40.46％，黑水虻幼虫存活率达到90％以上，见图2～5所示。发酵液干物质与发酵沉淀干物质与猪粪在平均增重和转化率上表现相当，其中平均增重约为0.2200g，转化率约为22％，但这两组的料重比均低于猪粪组。

鸡羽毛经过优化的发酵工艺处理后，其发酵产物蛋白含量高，制成昆虫饲料养殖黑水虻幼虫，黑水虻生长理化指标均不低于猪粪养殖的黑水虻，本发明将废弃羽毛发酵产物，尤其是该发酵产物的发酵上清液制备成干物质作为饲料，应用于黑水虻养殖中，能够显著提升黑水虻的生长速度，增重效果明显，且有效降低饲料的料重比和饲料转化率，同时还能提高存活率。