一种适用学生饮用的钙铁锌强化型酸奶及其制备方法与流程

本发明涉及食品加工技术领域，具体的，本发明涉及一种营养强化型酸奶及其制备的技术领域。

技术背景

自从2000年全国范围实施的“学生饮用奶计划”，牛奶作为健康食品的代表，几乎己经渗透到了每一个家庭，极大的促进了家长对于学生的营养保健意识。我国人民消费者购买的主要乳制品品种为：鲜奶(87.0％)、酸奶(66.8％)，而酸奶是一种含有较强乳酸菌的健康饮料，能增强消化功能，促进食欲，增强肠的蠕动和机体的物质代谢，经常饮用有增进人体健康的作用卿。酸奶由于乳酸菌的发酵作用，在营养成分得到改善的同时，也产生了一些生理活性物质如有机酸、芳香物质、抗生物质、细胞壁外多糖、活性酶、乳酸菌增殖因子及乳酸菌等，对机体功能有显著的调节作用，达到防病治病的功能之一。

目前市面上的酸奶饮品主要注重口感，例如草莓酸奶、蓝莓酸奶巧克力酸奶等等；专利公开号为CN106135410A的中国专利，公开了一种蜂蜜酸奶及其制备方法，该专利在原料中添加了蜂蜜，提高了酸奶的价值，该饮品适合于女士及老年人，有助于人体吸收、延缓衰老；专利公开号为CN106212679A的中国专利，公开了一种莼菜酸奶，相比较常规酸奶，该酸奶含有大量的氨基酸及锌铁等元素，但是莼菜主要产于中国浙江、江苏和湖北省，是一种季节性蔬菜，其他地区不易获得。现有技术中的酸奶普遍注重口感，无法满足学生在生长发育阶段的营养摄入量，因此需要针对学生这个群体，在酸奶制作过程中加入需适量的营养强化剂和寻求合适的发酵菌种，以为此达到学生膳食营养素推荐摄入量，克服现有的问题和不足。

技术实现要素：

针对目前国内外常规酸奶无法满足儿童学生膳食营养素推荐摄入量的技术现状，本发明旨在于提供一种适用学生饮用的钙铁锌强化型酸奶及其制备方法，通过采用辐射灭菌、混合菌种发酵和添加营养强化剂以及筛选一种专用型发酵菌种等一系列独特的制备工艺，建立一个稳定的发酵的高钙酸、高铁酸和高锌酸凝乳体系，提供了一种适于学生饮用的风味发酵乳制品，对食品加工技术领域具有广泛的实用性。

本发明首先提供一种适用学生饮用的钙铁锌强化型酸奶发酵的优良菌种，选用的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)WWMR-1，根据新疆的地理环境的特殊性，通过从新疆玛纳斯县及南北疆畜牧区采集的自制酸驼乳中取样，筛选出一批生长良好的微生物菌株，经培养、分离与筛选后，从中优选出一株编号为WWMR-1的菌株，菌种经培养后菌落呈边缘整齐、表面光滑乳白色凸起的圆形，直径0.5-3mm的菌落，进行革兰氏染色，染色鉴定结果为革兰氏阳性杆状细菌；该细菌在过氧化氢酶试验中呈阴性、接触酶呈阴性，不能够还原硝酸盐、不液化明胶、不产生吲哚和H₂S、不运动，不能够发酵阿拉伯糖、蜜二糖、棉籽糖、鼠李糖和木糖，能够在15℃生长，具有接种后生长稳定，延迟期短，适应快，发酵初期产酸能力较强。经微生物学分类与鉴定为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)。

本发明具体采用的一种适用学生饮用的钙铁锌强化型酸奶发酵的优良菌种编号为WWMR-1的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)，该细菌经MRS培养基分离培养，再经改良MRS培养基中会产生溶钙圈进行初步筛选，将其初步界定乳酸菌菌株；该菌株在MRS培养基平板上划线培养24h，能形成菌落边缘整齐、表面光滑乳白色凸起的圆形，直径0.5-3mm的菌落；进行革兰氏染色，染色鉴定结果为革兰氏阳性杆状细菌；该菌株培养条件：培养温度37℃，最适培养温度37℃；优先生长于MRS培养基表面，MRS培养基组分牛肉膏10.0g/L，酵母膏5.0g/L，葡萄糖20.0g/L，乙酸钠5.0g/L，柠檬酸氢二胺2.0g/L，吐温-801.0ml/L，磷酸氢二钾2.0g/L，七水硫酸镁0.2g/L，七水硫酸锰0.05g/L，蒸馏水1.0L，固体培养基加琼脂20.0g/L；菌株在固体培养基上菌落直径大小为0.5-3mm，正面呈圆形，侧面凸起；边缘整齐、表面光滑；菌落不透明，呈乳白色；具有一定粘稠性；革兰氏阳性菌。

结合上述编号为WWMR-1的该菌种菌落形态、生理生化特性，初步确定为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)。参照《伯杰氏系统细菌学鉴定手册》(《Bergey，s Manual of Systematic Bacterio-logy》)第九版和《常用细菌系统鉴定手册》等对干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)WWMR-1菌株进行形态学测定、生理生化检测，结合该菌种的16S rDNA同源分析、系统发育分析结果，确定菌种编号为WWMR-1菌株为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)，该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏日期是2013年9月23日，保藏号是CGMCC No.8244。经上述微生物学综合鉴定归属为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)WWMR-1CGMCC No.8244。

同时，本发明提供了菌株干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)WWMR-1制作适用学生饮用的钙铁锌强化型酸奶的发酵工艺：在无菌条件下，挑取该菌株，37℃，135r/min培养18-24h。

本发明为实现以上技术目的，提供一种适用学生饮用的钙铁锌强化型酸奶的制备方法，具体步骤如下：

(1)原料预热：选择100000份的新鲜奶制品，采用辐射灭菌机灭菌1s-3s，灭菌后90℃恒温水浴10min，水浴过程中不断搅拌，水浴10min后迅速冷却至40℃-45℃，加入2000份-6000份蔗糖、3份-4份铁营养强化剂、2份-3份锌营养强化剂，均匀搅拌。

(2)乳酸发酵：按重量百分比计，接种2％-6％的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)WWMR-1 CGMCC No.8244，添加1000份老酸奶醪液后加入钙营养强化剂50份-70份、香兰素4份-5份，于33℃-45℃在发酵罐中发酵4h-8h。

(3)后发酵：酸奶酸度达到80°T-90°T发酵完成，2℃-8℃条件下进行后发酵15h-18h。

本发明中，原料采用新鲜的牛奶或羊奶。

本发明中，铁营养强化剂选用柠檬酸铁铵、乳酸亚铁和硫酸亚铁中的任意一种，优先选择硫酸亚铁。

本发明中，锌营养强化剂选用葡萄糖酸锌、乳酸锌或硫酸锌中的任意一种，优先选择硫酸锌。

本发明中，钙营养强化剂选用碳酸钙、葡萄糖酸钙和乳酸钙中的任意一种，优先选择添加碳酸钙。

本发明中，老酸奶醪液类似发酵中的酵头，第一次选用农村土法自然自制的酸奶，优先选用牧区牧民自然发酵自制的酸骆驼乳，生产中可选用每次上次制作好的酸奶即可。

本发明中，乳酸发酵温度优先选择42℃。

本发明中，乳酸发酵时间优先选择5h。

本发明采用的铁营养强化剂、锌营养强化剂和钙营养强化剂均为食品级，均可从市场购买获得。本发明选用的老酸奶醪液初始发酵选用农村土法自然发酵的酸奶，具有产酸能力高，发酵周期短的特点。

同时，本发明优选进一步提供适用学生饮用的钙铁锌强化型酸奶的制备方法，具体步骤如下：

(1)原料预热：选择100g的新鲜奶制品，采用辐射灭菌机灭菌3s，灭菌后90℃恒温水浴10min，水浴过程中不断搅拌，水浴10min后迅速冷却至45℃，加入6g蔗糖、3.3mg硫酸亚铁、2.3mg硫酸锌，均匀搅拌。

(2)乳酸发酵：按重量百分比接种3％干酪乳杆菌，添加1g老酸奶醪液，然后加入碳酸钙60mg、香兰素5g，于42℃在发酵罐中发酵5.4h。

(3)后发酵：酸奶酸度达到90°T发酵完成，8℃条件下进行后发酵18h。

进一步，本发明提供上述制备适用学生饮用的钙铁锌强化型酸奶在儿童或者学生膳食营养搭配中的应用。

通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下效果:

(1)本发明提供发酵制备适用学生饮用的钙铁锌强化型酸奶的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)WWMR-1，本菌株能在低pH值时活性较强，热稳定性好，在发酵过程中产生有机酸,主要是乳酸，使pH值降低来抑制一些腐败菌和致病菌的生长，并改善食品的品质和风味。

(2)本发明最终选用的钙盐营养强化剂碳酸钙，铁盐营养强化剂硫酸亚铁，锌盐营养强化剂硫酸锌，使得发酵完成后的酸奶持水性，酸度，黏度和感官质量最好。

(3)本申请通过提供辐射灭菌、混合菌种发酵和添加营养强化剂等一系列独特的制备工艺，建立一个稳定的发酵的高钙酸、高铁酸和高锌酸凝乳体系，提供了一种适于学生饮用的风味发酵乳制品，制作的酸奶钙元素含量最高可达1230.5ug/ml，铁元素含量最高可达3.58ug/ml，锌含量最高可达4.56ug/ml，动物实验结果显示，高剂量的钙铁锌强化型酸奶能够提高小鼠血液中的钙铁锌含量，其中血钙浓度升高70％、血铁浓度升高165％，血锌浓度升高199％，是一种适用学生饮用的钙铁锌强化型酸奶，获得了良好的技术效果。

附图说明

图1显示为不同接种量对制备适用学生饮用酸奶发酵的影响。

图2显示为不同发酵温度对制备适用学生饮用酸奶发酵的影响。

图3显示为不同发酵时间对制备适用学生饮用酸奶发酵的影响。

图4显示为不同蔗糖添加量对制备适用学生饮用酸奶发酵的影响。

图5显示为发酵时间和接种量对制备适用学生饮用酸奶酸度影响的响应面图。

图6显示为发酵温度和发酵时间对制备适用学生饮用酸奶酸度影响的响应面图。

图7显示为发酵温度和接种量对制备适用学生饮用酸奶酸度影响的响应面图。

图8显示为接种量和发酵时间对制备适用学生饮用酸奶粘度影响的响应面图。

图9显示为发酵温度和发酵时间对制备适用学生饮用酸奶粘度影响的响应面图。

图10显示为发酵温度和接种量对制备适用学生饮用酸奶粘度影响的响应面图。

图11显示为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)WWMR-1CGMCC No.8244的系统进化树。

具体实施方式

下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。

本发明中选用的试剂与培养基如下：

MRS培养基：葡萄糖20g，蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，柠檬酸二胺2g，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，吐温-801mL，蒸馏水1000mL。

采用的主要的仪器设备：

LD2X-50KB立式电热压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器厂)；HR40-ⅡA2生物安全柜(青岛海尔特种电器有限公司)；DHP-781电热恒温培养箱(河北省黄石市医疗器械厂)；DZKW-172电热恒温水浴锅(北京市光明医疗仪器厂)，辐射灭菌机(上海辐新辐照技术有限公司)。

采用新鲜牛奶由新疆乌鲁木齐南山地区提供；选用的老酸奶醪液，老酸奶醪液类似发酵中的酵头，第一次选用农村土法自然自制的酸奶，优先选用牧区牧民自然发酵自制的酸骆驼乳，生产中可选用每次上次制作好的酸奶即可；干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)WWMR-1自筛鉴定为典型的新种菌种。

另外，在下述的说明中，如无特别说明，％皆指m/m质量百分比，本发明中选用的所有试剂、原料和仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。

实施例一：干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)WWMR-1CGMCC No.8244的分离与纯化

初筛:通过从新疆玛纳斯县及南北疆畜牧区采集的自制酸驼乳中取样，取农牧区传统发酵酸驼乳1mL放入装有9mL无菌生理盐水的试管中，在旋涡混合器上充分混合均匀。将发酵酸驼乳以10倍级进行稀释，稀释度为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6。用移液器吸取上述稀释度样液各1mL，采用倾注法倒入改良MRS培养基，平板置于37℃培养箱中培养24h。观察并记录菌落特征并挑取有透明圈的不同形态单个菌落，进行革兰氏染色，挑取革兰氏染色阳性菌落，在显微镜油镜下观察细胞形态，并对疑似的菌种进行编号。

菌种的纯化:将疑似产透明圈的菌株再接种于MRS琼脂培养基，于37℃培养箱恒温培养24h，重复3～4次纯化乳酸菌。纯化后的乳酸菌菌株接种于改良MRS斜面，37℃培养箱恒温培养24h后，4℃保存备用。从酸驼乳中进行微生物菌种的培养、分离与筛选，获得一批细菌，并从中分离筛选出干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)，编号为WWMR-1，经微生物学分类与鉴定，属于干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)。

本发明具体采用的一种适用学生饮用的钙铁锌强化型酸奶发酵的优良干酪乳杆菌的编号为WWMR-1，其能够产乳酸。参照《伯杰氏系统细菌学鉴定手册》(《Bergey，s Manual of Systematic Bacterio-logy》)第九版和《常用细菌系统鉴定手册》等对干酪乳杆菌WWMR-1菌株进行形态学测定，生理生化检测，确定干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)WWMR-1为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)中的成员。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏日期是2013年9月23日，保藏号是CGMCC No.8244。16SrRNA同源分析、系统发育分析和细胞脂肪酸组分分析结果都表明WWMR-1菌株为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)。该菌株培养条件：培养温度37℃，最适培养温度37℃；优先生长于MRS培养基表面，MRS培养基组分牛肉膏10.0g/L，酵母膏5.0g/L，葡萄糖20.0g/L，乙酸钠5.0g/L，柠檬酸氢二胺2.0g/L，吐温-801.0ml/L，磷酸氢二钾2.0g/L，七水硫酸镁0.2g/L，七水硫酸锰0.05g/L，蒸馏水1L，固体培养基加琼脂20.0g/L。菌株在固体培养基上菌落直径大小为0.5-3mm，正面呈圆形，侧面凸起；边缘整齐、表面光滑；菌落不透明，呈乳白色；具有一定粘稠性；革兰氏阳性菌，与同类常见的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)具有明显的区分，具有新菌种的特点。

生理生化鉴定：该细菌在过氧化氢酶试验中呈阴性、接触酶呈阴性，不能够还原硝酸盐、不液化明胶、不产生吲哚和H₂S、不运动，不能够发酵阿拉伯糖、蜜二糖、棉籽糖、鼠李糖和木糖，能够在15℃生长，具有接种后生长稳定，延迟期短，适应快，发酵初期产酸能力较强，与同类常见的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)具有显著的区分，具有新菌种的明显特点。

分子生物学鉴定：基于16S rDNA序列扩增和PCR产物测序，获得rDNA序列经GenBank\Blast同源序列比对分析，其与现有技术所报道的已知干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)同源性较高，相似度：99％；从GenBank中获取干酪乳杆菌标准菌株16S rRNA基因序列，进行同源进化分析，构建系统进化树，结果参见附图11；结果显示，菌种编号为WWMR-1的菌株隶属于干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)，与Lactobacillus casei亲源关系最近，同源相似性为99％，确定菌株WWMR-1为干酪乳杆菌，结合上述提供的菌种编号为WWMR-1 CGMCC No.8244的菌落形态、生理生化特性，生物学分类名称为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)为典型的新菌种，与同类常见的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)具有明显的区分，具有新菌种最鲜明的特点。

实施例二：利用干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)WWMR-1CGMCC No.8244制备适用学生饮用的钙铁锌强化型酸奶

本发明采用的适用学生饮用的钙铁锌强化型酸奶的制备方法具体步骤如下：

(1)原料预热：选择100000份的新鲜奶制品，采用辐射灭菌机灭菌1s-3s，灭菌后90℃恒温水浴10min，水浴过程中不断搅拌，水浴10min后迅速冷却至40-45℃，加入2000份-6000份蔗糖、3份-4份铁营养强化剂、2份-3份锌营养强化剂，均匀搅拌。

(2)乳酸发酵：按重量百分比计，接种2％-6％干酪乳杆菌，添加1000份老酸奶醪液后加入钙营养强化剂50份-70份、香兰素4份-5份，于33℃-45℃在发酵罐中发酵4h-8h。

(3)后发酵：酸奶酸度达到80°T-90°T发酵完成，2℃-8℃条件下进行后发酵15h-18h。

本发明中，原料采用新鲜的牛奶或羊奶。

本发明中，铁营养强化剂选用柠檬酸铁铵、乳酸亚铁和硫酸亚铁中的任意一种，优先选择硫酸亚铁。

本发明中，锌营养强化剂选用葡萄糖酸锌、乳酸锌或硫酸锌中的任意一种，优先选择硫酸锌。

本发明中，钙营养强化剂选用碳酸钙、葡萄糖酸钙和乳酸钙中的任意一种，优先选择添加碳酸钙。

本发明中，老酸奶醪液类似发酵中的酵头，第一次选用农村土法自然自制的酸奶，优先选用牧区牧民自然发酵自制的酸骆驼乳，老酸奶醪液初始发酵选用农村土法自然发酵的酸奶，具有产酸能力高，发酵周期短的特点，生产中可选用每次上次制作好的酸奶即可。

本发明中，乳酸发酵温度优先选择42℃。

本发明中，乳酸发酵时间优先选择5h。

实施例三：营养强化剂的选择与强化量的确定

本发明中选取具有较高性价比的钙源进行对比分析和筛选，为钙铁锌强化酸奶的研究提供基本依据。选用碳酸钙，葡萄糖酸钙和乳酸钙，作为钙盐营养强化剂，在加热后的100g牛奶中加入相同的剂量60mg，发酵完成后的酸奶酸度和粘度均较好，但持水性和感官质量较碳酸钙最好。确定碳酸钙为钙营养强化剂，在向加热后的100g牛奶中加入碳酸钙50mg，60mg和70mg，发酵完成后的加入60mg碳酸钙的酸奶，乳清析出最少。确定碳酸钙的添加量为60mg。

本发明中选取具有较高性价比的铁源进行对比分析和筛选，为钙铁锌强化酸奶的研究提供基本依据。选用柠檬酸铁铵，乳酸亚铁和硫酸亚铁作为铁盐营养强化剂，在加热前的100g牛奶中加入相同的剂量3.3mg，发酵完成后的酸奶酸度和粘度较乳酸亚铁和硫酸亚铁最好。硫酸亚铁的经济成本比乳酸亚铁低，确定硫酸亚铁为铁营养强化剂，在向加热前的100g牛奶中加入碳酸钙2.3mg，3.3mg和4.3mg，发酵完成后的加入3.3mg硫酸亚铁的酸奶，酸度和感官质量最好。确定硫酸亚铁的添加量为3.3mg。

本发明中选取具有较高性价比的锌源进行对比分析和筛选，为钙铁锌强化酸奶的研究提供基本依据。选用葡萄糖酸锌，乳酸锌和硫酸锌作为铁盐营养强化剂，在加热前的100g牛奶中加入相同的剂量2.3mg，发酵完成后的酸奶酸度，粘度和持水性较乳酸锌和硫酸锌最好。硫酸锌的经济成本比乳酸锌低，确定硫酸锌为锌营养强化剂，在向加热前的100g牛奶中加入硫酸锌2.0mg，2.3mg和2.6mg，发酵完成后的加入2.3mg硫酸锌的酸奶，酸度和感官质量最好。确定硫酸锌的添加量为2.3mg。

实施例四：

选择100g的新鲜奶制品，采用辐射灭菌机灭菌1s，灭菌后90℃恒温水浴10min，水浴过程中不断搅拌，水浴10min后迅速冷却至40℃，加入2g蔗糖、3mg硫酸亚铁、2mg硫酸锌，均匀搅拌。接种2％干酪乳杆菌，添加1g老酸奶醪液，然后加入碳酸钙50mg、香兰素4g，于33℃在发酵罐中发酵4h。酸奶酸度达到80°T发酵完成，2℃条件下进行后发酵15h。

实施例五：

选择100g的新鲜奶制品，采用辐射灭菌机灭菌2s，灭菌后90℃恒温水浴10min，水浴过程中不断搅拌，水浴10min后迅速冷却至42℃，加入5g蔗糖、3mg硫酸亚铁、3mg硫酸锌，均匀搅拌。接种4％干酪乳杆菌，添加1g老酸奶醪液，然后加入碳酸钙60mg、香兰素5g，于42℃在发酵罐中发酵5h。酸奶酸度达到80°T发酵完成，6℃条件下进行后发酵16h。

实施例六：选择100g的新鲜奶制品，采用辐射灭菌机灭菌3s，灭菌后90℃恒温水浴10min，水浴过程中不断搅拌，水浴10min后迅速冷却至43℃，加入4g蔗糖、4mg硫酸亚铁、2mg硫酸锌，均匀搅拌。接种5％干酪乳杆菌，添加1g老酸奶醪液，然后加入碳酸钙50mg、香兰素5g，于40℃在发酵罐中发酵4h。酸奶酸度达到90°T发酵完成，2℃条件下进行后发酵15h-18h。

实施例七：

选择100g的新鲜奶制品，采用辐射灭菌机灭菌3s，灭菌后90℃恒温水浴10min，水浴过程中不断搅拌，水浴10min后迅速冷却至45℃，加入6g蔗糖、4mg硫酸亚铁、3mg硫酸锌，均匀搅拌。接种6％干酪乳杆菌，添加1g老酸奶醪液，然后加入碳酸钙70mg、香兰素5g，于45℃在发酵罐中发酵8h。酸奶酸度达到90°T发酵完成，8℃条件下进行后发酵18h。

实施例八：

选择100g的新鲜奶制品，采用辐射灭菌机灭菌3s，灭菌后90℃恒温水浴10min，水浴过程中不断搅拌，水浴10min后迅速冷却至45℃，加入6g蔗糖、3.3mg硫酸亚铁、2.3mg硫酸锌，均匀搅拌。接种3％干酪乳杆菌，添加1g老酸奶醪液，然后加入碳酸钙60mg、香兰素5g，于44℃在发酵罐中发酵5.4h。酸奶酸度达到90°T发酵完成，8℃条件下进行后发酵18h。

实施例九：钙铁锌强化型酸奶发酵工艺的优化

在上述实施例一提供的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)WWMR-1 CGMCC No.8244基础上，按照实施例二至实施例八提供的利用干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)WWMR-1 CGMCC No.8244制备适用学生饮用的钙铁锌强化型酸奶的基础上，进一步确定优化的钙铁锌强化型酸奶发酵工艺。

1、单因素试验设计及结果分析

分别选取干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)WWMR-1 CGMCC No.8244的发酵接种量为2％、3％、4％、5％、6％；培养温度为33℃、36℃、39℃、42℃、45℃；发酵时间为4h、5h、6h、7h、8h；蔗糖添加量为2％、4％、6％、8％、10％；进行单因素发酵试验，通过测定酸度、糖度、粘度、持水力，进行单因素考察。

(1)不同接种量对发酵的影响

由附图1可知，42℃发酵5h后，酸乳发酵剂干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)WWMR-1 CGMCC No.8244的发酵接种量为3％、4％和5％的酸乳的滴定酸度高于接种量为2％和6％的酸乳；对粘度的测定发现，随着接种量的增加，酸乳的粘度也随之增高，可见提高酸乳的接种量，可以提高酸乳的粘度；对持水力的测定结果来看，酸乳的持水力随着酸乳发酵剂接种量的增加先增大后降低，接种量为5％时，酸乳的持水力达到最大值，为90％，与接种量为3％时酸乳的持水力差异并不大；通过对不同接种量酸乳的感官分析发现，酸乳的品质随着接种量的增加而变好，在接种量为3％时酸乳的感官评分最高，酸甜爽口，而在接种量为5％、6％时，有乳清析出，在接种量为6％时有大量乳清析出且过稠。从以上的分析结果可以看出，接种量为3％的酸乳42℃发酵5h后，酸乳的酸度、糖度适中，粘度和持水力以及感官评分均要高于其他发酵组酸乳，故3％为最佳的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)WWMR-1 CGMCC No.8244的发酵接种量。

(2)不同发酵温度对发酵的影响

由附图2可知，酸乳在33℃、36℃发酵5h的条件下，酸乳的滴定酸度明显低于在42℃的发酵条件下酸乳的滴定酸度；对载度的测定发现，随着发酵温度的增加，酸乳的粘度先增高后下降，发酵温度为42℃时达到最高，为645m Pa·s，明显高于33℃、36℃、39℃、45℃下发酵的酸乳；对持水力的测定结果来看，在33℃、36℃下发酵的酸乳的持水力趋近于1，但在39℃、42℃、45℃下发酵的酸乳持水力差值不大；通过对不同发酵温度酸乳的感官分析发现，在发酵温度为33℃、36℃时，酸乳过稀，而发酵温度为45℃时则有大量乳清析出。从以上的分析结果可以看出，发酵温度为42℃接种量2％的酸乳发酵5h后，酸乳的酸度、糖度适中，粘度和持水力以及感官评分均要高于其他发酵组酸乳，故42℃为最佳的酸乳发酵温度。

(3)不同发酵时间对发酵的影响

由附图3可知，发酵5h、6h、7h的酸乳的滴定酸度高于4h发酵酸乳的滴定酸度；不同发酵时间酸乳的粘度测定发现，发酵5h时粘度达到最高，为672m Pa·s，随着发酵时间增长，粘度逐步降低，发酵8h时明显低于发酵5h酸乳的粘度；对持水力的测定结果看出，发酵时间为4h、5h酸乳的持水力低于发酵6h以上的酸乳的持水力。通过对不同发酵时间酸乳的感官分析发现，随着发酵时间的延长，酸乳的乳清析出量有所增加，但在发酵5h时酸乳的酸度适中，粘度和持水力以及感官评分均要高于其他发酵组酸乳。

(4)不同糖添加量对发酵的影响

如附图4可知，随着蔗糖添加量的增大，酸乳的滴定酸度变化不明显:对粘度的测定发现，酸乳的粘度也随着蔗糖添加量的增加而增大；对持水力的测定结果来看，蔗糖添加量对酸乳的持水力影响不明显；通过对不同蔗糖添加量酸乳的感官分析发现，随着蔗糖添加量的增大，酸乳的品质越来越好，在蔗糖添加量为6％时酸乳的感官评分最高，在蔗糖添加量大于8％时，由于此时酸乳的甜度过高，影响酸乳口感。从以上的分析结果可以看出，蔗糖添加量为6％时，酸乳的酸度和甜均适中，粘度和持水力以及感官评分均要高于其他发酵组酸乳，故6％为最佳的蔗糖添加量。

2、响应面优化试验及结果分析

在单因素试验结果基础上，根据Box-Behnken的中心组合实验设计原理分别对影响发酵的酸度含量(Z)和粘度(Y)的三个因素：发酵时间(A)、发酵温度(B)、接种量(C)，利用响应面软件Design-Expert8.05软件，根据Box-Behnken实验组合设计进行三因素三水平实验。响应面试验的因素和水平编码值如表1。

表1：响应面试验的因素和水平编码值

发酵响应面优化分析：综合单因素试验结果，采用Box-Behnken响应面分析法对其进行优化，响应面试验设计及响应值结果见表2。

表2：响应面试验及响应值

按照表2试验数据进行多元回归方程拟合，得到发酵乳酸度(Y)及粘度(Z)分别对发酵时间(A)、发酵温度(B)、接种量(C)的拟合方程为：

酸度＝77.00+6.13A+4.13B+4.00C-0.50AB-4.75AC-3.75BC-3.50A²-6.50B²-8.75C²粘度＝668.00+168.88A+114.25B+55.13C+25.00AB+60.25AC+54.50BC-158.13A²-187.88B²-165.13C²

表3：酸度响应面试验结果及方差分析

注：表3及表4中，“*”表示显著(0.01<p<0.05)；“**”表示极显著(p<0.01)

表4：粘度响应面试验结果及方差分析

回归方程中各变量对响应值影响的显著性，由F检验来判定，概率P的值越小，则相应变量的显著程度越高。由表3、表4可知，当模型F值分别为F＝18.40，P＝0.0004<0.01，F＝43.29，P<0.0001，说明模型是极显著的。酸度与粘度的失拟项分别为F＝1.14时，P＝0.4327>0.05，F＝1.69，P＝0.3052>0.05说明模型失拟项不显著。决定系数分别为R²＝0.9594，R²＝0.9824校正系数分别为R²_Adj＝0.9073，R²_Adj＝0.9597表明实测值与预测值之间具有很好的拟合度。由此可以说明模型的建立呈显著性，说明此模型的拟合程度较好，试验操作准确可信，因此可以利用此模型对酸奶发酵过程进行分析和预测。

从表3中可以看出，一次项A、B、C与二次项B²、C²均对钙铁锌强化型酸奶发酵的Y值影响表现出极显著水平，交互项AC、BC与A²对钙铁锌强化型酸奶发酵Y值的影响表现为显著水平，交互项AB对钙铁锌强化型酸奶Y值的影响不具有显著水平的影响。从表4中可以看出一次项A、B与二次项A²、B²、C²对钙铁锌强化型酸奶发酵液的Z值影响表现出极显著水平，交互相AB、AC、BC与一次项C对钙铁锌强化型酸奶发酵液Z值的影响呈现显著水平。

响应面图分析：为了考察各个交互项对发酵液酸度和粘度的影响，在其他因素固定不变的情况下，利用Design-Expert 8.05软件对回归方程进行运算，作出交互项的响应面图，结果参见附图5至附图10。

由附图5可知，随着接种量的增大，酸度和粘度呈先上升后下降的趋势，发酵时间与发酵温度之间的交互作用对酸度影响不显著但对粘度影响显著；发酵温度及接种量的交互作用显著。

在单因素试验的基础上，利用响应面软件分析，得出钙铁锌强化型酸奶最佳发酵条件为：接种量3.52％，发酵温度为44℃，发酵时间5.4h。在此条件下酸度平均为76.9999°T，粘度为735.736mPa.s。经验证试验所测得的实际酸度、粘度与理论值差异较小，证明两个数学模型对优化钙铁锌强化型酸奶发酵工艺条件可行。

在上述条件下得到的适用学生饮用的钙铁锌强化型酸奶产品的典型性如下：

(1)感官指标：色泽：乳白色；香气：乳香味浓郁，滋味：酸甜爽口、无异味。

(2)理化指标：总酸：74.67°T，粘度718.13mPa.s。

(3)微生物指标：菌落总数(cfu/mL)≤100；大肠菌群(MPN/100mL)≤3；致病菌：未检出。

实施例十：制备的奶制品中钙铁锌含量的测定

测定方法：

将上述实施例一提供的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)WWMR-1 CGMCC No.8244基础上，按照实施例二至实施例八提供的利用干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)WWMR-1 CGMCC No.8244制备酸奶的基础上，进行钙铁锌进行测定，取新鲜牛奶、常规酸奶、钙铁锌强化型酸奶、双氧水、浓硫酸、硝酸、超纯水、钙铁锌元素的标准工作液(1000ug/ml，国家钢铁材料测试中心-钢铁研究总院)等材料仪器备用。

常规酸奶、钙铁锌强化型酸奶下述同样采用同样方法，用移液管移取4ml新鲜牛奶于坩埚中，加入4ml浓硫酸，2ml双氧水，静置约10min，然后将坩埚放在电炉上加热至冒出白烟。待其冷却至50℃-60℃，在向坩埚中加入2ml浓硫酸，盖上坩埚盖。将装有预处理样品的坩埚依次放入马弗炉中，让其灰化完全。温度调至650℃，时间为2h。取出坩埚，观察坩埚中的样品是否已成纯白色的灰分，如是则灰化已经完全。冷却后，用稀硝酸充分溶解灰分，并移入100ml容量瓶中。最后用超纯水定容，并摇匀备用。每个样品分别取3次样品，每个样品处理后分别上样测定3次，取其平均值。然后配置三元素的标准曲线，标准曲线参见表5。

表5：标准曲线的配置

测定结果：根据仪器测定元素的线性范围，适当稀释或浓缩样品溶液，测定其吸光度值。经计算器回归分析，得出回归方程，将样品测定的吸光度值代入回归方程，计算出样品中各元素的含量。

表6：钙元素测定结果表(μg/ml)

由表6可知，常规酸奶和钙铁锌强化型酸奶的钙元素含量均大于新鲜牛奶的钙元素含量。经过换算，得出钙铁锌强化型酸奶的钙元素含量最高，到达了1230.5ug/ml，常规酸奶的钙元素含量最低，其含量为765.0ug/ml。

表7：铁元素测定结果表(μg/ml)

由表7可知，常规酸奶和钙铁锌强化型酸奶的铁含量大于新鲜牛奶的铁元素含量。经过换算可得，钙铁锌强化型酸奶的铁元素含量高到3.58ug/ml，其余样品铁含量相当。

表8：锌元素测定结果表(μg/ml)

根据表8得出，钙铁锌强化型酸奶的锌含量最高，经过换算，达到4.56ug/ml。其余样品的锌含量相当，其中新鲜牛奶的锌含量最低。

根据以上3种元素含量的检测可知，三种乳制品中的3种无机营养元的含量都稍有差异。未经过加工处理的新鲜牛奶中的各元素含量较其他经过加工处理过的乳制品偏低。本申请通过对钙铁锌三种营养元素的强化，增加了乳制品的营养价值，弥补了天然牛奶存在的缺陷和不足，同时也满足国家规定的每日儿童膳食营养素推荐摄入量。

实施例十一：钙铁锌强化型酸奶对大鼠钙铁锌吸收的影响

(1)实验动物：健康成年SD大鼠，清洁级，64只，雌雄各半，体重200-220g，购自新疆农业大学医学院动物实验中心。随机分为对照组、钙铁锌强化型酸奶低剂量组、中剂量和高剂量组，每组16只，饲养周期为14天，采用常规饲养模式饲养。

(2)各组每日添加计量的确定:对照组在日常饲料中添加常规酸奶，自由进食，低剂量组、中剂量和高剂量组分别添加本申请实施例制备的钙铁锌强化型酸奶，低剂量组强饲2g饲料和5g钙铁锌强化型酸奶，中剂量强饲2g饲料和10g钙铁锌强化型酸奶，高剂量强饲2g饲料和15g钙铁锌强化型酸奶；钙铁锌强化型酸奶为按照实施例二至实施例八提供的利用干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)WWMR-1CGMCC No.8244制备。

(3)测定方法：

采用摘除眼球取血方法，收集血样，制备成血浆，采用BC-3000型血液自动分析仪测定血浆中钙、铁、锌的含量，分析所用试剂盒购自于长春汇力生物科技有限公司，7天饲喂后测定不同剂量组的大鼠粪便中钙、铁、锌含量，结果参见表9。

(4)测定结果：

表9：各组大鼠不同时间段内血浆中钙、铁、锌含量

由表9可知，14天饲喂后，对照组相和低剂量组第14d血浆中各元素含量均发生降低的情况，中剂量组有细微的升高，而高剂量组血浆中血钙浓度升高70％、血铁浓度升高165％，血锌浓度升高199％，具有明显的增幅。

综上所述，本发明利用干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)WWMR-1CGMCC No.8244制备钙铁锌强化型酸奶，通过提供辐射灭菌、混合菌种发酵和添加营养强化剂等一系列独特的制备工艺，建立一个稳定的发酵的高钙酸、高铁酸和高锌酸凝乳体系，提供了一种适于学生饮用的风味发酵乳制品，制作的酸奶钙元素含量最高可达1230.5ug/ml，铁元素含量最高可达3.58ug/ml，锌含量最高可达4.56ug/ml，动物实验结果显示，高剂量的钙铁锌强化型酸奶能够提高小鼠血液中的钙铁锌含量，其中血钙浓度升高70％、血铁浓度升高165％，血锌浓度升高199％，获得了良好的技术效果。

如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 新疆农业大学；武运

<120> 一种适用学生饮用的钙铁锌强化型酸奶及其制备方法

<130> WWMR-1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1064

<212> DNA

<213> WWMR-1

<220>

<221> WWMR-1

<222> (1)..(1064)

<400> 1

accacttttt ttcacttaga cggctcgctc cctaaagggt tacgccaccg gcttcgggtg 60

ttacaaactc tcatggtgtg acgggcggtg tgtacaaggc ccgggaacgt attcaccgcg 120

gcgtgctgat ccgcgattac tagcgattcc gacttcgtgt aggcgagttg cagcctacag 180

tccgaactga gaatggcttt aagagattag cttgacctcg cggtctcgca actcgttgta 240

ccatccattg tagcacgtgt gtagcccagg tcataagggg catgatgatt tgacgtcatc 300

cccaccttcc tccggtttgt caccggcagt cttactagag tgcccaacta aatgctggca 360

actagtcata agggttgcgc tcgttgcggg acttaaccca acatctcacg acacgagctg 420

acgacaacca tgcaccacct gtcattttgc ccccgaaggg gaaacctgat ctctcaggtg 480

atcaaaagat gtcaagacct ggtaaggttc ttcgcgttgc ttcgaattaa accacatgct 540

ccaccgcttg tgcgggcccc cgtcaattcc tttgagtttc aaccttgcgg tcgtactccc 600

caggcggaat gcttaatgcg ttagctgcgg cactgaaggg cggaaaccct ccaacaccta 660

gcattcatcg tttacggcat ggactaccag ggtatctaat cctgttcgct acccatgctt 720

tcgagcctca gcgtcagtta cagaccagac agccgccttc gccactggtg ttcttccata 780

tatctacgca tttcaccgct acacatggag ttccactgtc ctcttctgca ctcaagtttc 840

ccagtttccg atgcgcttcc tcggttaagc cgagggcttt cacatcagac ttaaaaaacc 900

gcctgcgctc gctttacgcc caataaatcc ggataacgct tgccacctac gtattaccgc 960

ggctgctggc acgtagttag ccgtgctttc tggttggata ccgtccacgc cgacaacagt 1020

tactctgccg accattcttc ttccacaaca gagtttttac gacc 1064