本发明涉及施用tgf-β与一种或多种包含β-乳球蛋白的特异性序列的肽的组合。所述肽是低变应原性的，但保留诱导对天然蛋白质的耐受性的能力。tgf-β与这些肽中的一种或多种的组合具有诱导和维持对新引入的蛋白质的口服耐受性的治疗效果，特别是在断乳期。所述组合可调节婴儿和学步儿对变应原的免疫应答。
背景技术：
食物变态反应(生命中最开始发生的通常是牛乳变态反应)在大多数情形中是由对食物中的蛋白质的反应而引起。在生命的最初几年中，免疫系统仍在发育并且可能不能产生对膳食抗原的耐受性(这也可以描述为口服耐受诱导不足)。结果是，婴孩或儿童或幼年动物发生对膳食蛋白过度的免疫应答并且对其产生变应性应答。食物变态反应不仅可以影响人类，而且还可以影响其它哺乳动物诸如狗和猫。
通常，在易感婴孩、儿童或幼年动物第一次遇到含有潜在变应原的新食物后会立刻发生食物超敏反应。除其母乳(其可含有来自母亲膳食的食物蛋白)外，人类婴孩通常遇到的第一种膳食蛋白至少是牛乳蛋白。牛乳变态反应(cma)是人类婴孩中最常见的食物变态反应，累及大约全部婴儿的2.5％[sicherershetal.(2010),foodallergy,sampsonha,j.allergyclin.immunol.(125)(sicherersh等人，2010年，食物变态反应，sampsonha，《变态反应与临床免疫学杂志》，第125卷)]。大约85％的儿童在2岁到3岁大之前因为长大而不再对牛乳发生变态反应。因此，cma对其它年龄组的影响不太普遍。
通常公认的是，具有确立的牛乳变态反应的婴孩具有增加的产生对其它膳食蛋白诸如蛋和谷蛋白的变态反应的风险。这些变态反应自身在临床上可以表现为特应性疾病诸如特应性皮炎、湿疹和哮喘。甚至那些成功产生了对牛乳蛋白的口服耐受性的婴孩后来也可能会产生对其它膳食蛋白诸如蛋和谷蛋白(当断乳时将这些物质引入饮食中时)的变态反应。
除了母乳喂养，预防cma的首要推荐方法是使用部分水解的低变应原性配方食品，其被推荐开具给父母患有特应症的“有风险的”无症状婴儿。该方法已证明存在于配方食品中的水解蛋白质(肽)和残留的天然(全长)蛋白质(但存在的量比非水解配方食品中的量低很多)能有效预防致敏作用。
因而，欧洲专利申请ep2332428公开了一种配方食品，其包含能够诱导口服耐受性的含牛乳肽的水解产物。所考虑的肽被鉴定为来自牛酪蛋白。
目前市场上基于酪蛋白或乳清的部分水解的低变应原性配方食品的示例有很多(如来自雀巢公司(nestlé)的
对于已经表现出cma症状的婴儿，深度水解配方食品(如来自雀巢公司的alfaretm、altératm)、非变应原性代乳品配方食品诸如游离氨基酸(如来自雀巢公司的alfaminotm)或基于大豆的配方食品(诸如来自纽约市惠氏婴儿营养品公司的
因而，迄今在为患有对牛乳的变态反应的儿童提供营养方面的首要关注点在于寻求不会诱导变应性应答的制品，即提供非变应原性制剂。给婴儿施用非变应原性配方食品(含有游离氨基酸或深度水解的牛乳蛋白)或基于大豆的乳的缺点之一是，虽然这些制剂使得对牛乳发生变态反应的婴儿能避免变应性应答，但它们不能让那些孩子产生对牛乳蛋白变应原的口服耐受性以便他们可在以后的生活中继续饮用未改变的乳制品。
口服耐受性是通过先前以口服途径施用抗原而特异性地抑制对所述抗原的细胞和/或体液免疫反应。这是出生后头几个月内免疫系统发育的重要部分，使得婴儿能食用食品而不会有不良反应。不能建立口服性耐受会导致变态反应。口服耐受性的产生与正常的免疫系统教育相关，从而导致对食物抗原的反应减少。
数种因素已被鉴定为影响口服耐受性的诱导和维持，其中有，食物蛋白质的结构、抗原施用的剂量和频率以及宿主的免疫状态。
在一定程度上，口服耐受性可通过母乳喂养在婴儿中诱导[mosconie,etal.(2010)breastmilkimmunecomplexesarepotentinducersoforaltoleranceinneonatesandpreventasthmadevelopment.mucosalimmunol；3:461-74(mosconie等人，2010年，母乳免疫复合物是新生儿中口服耐受性的强效诱导物并且可预防哮喘发生。《粘膜免疫学》；第3卷：第461-474页)，以及verhasseltetal(2008)breastmilkmediatedtransferofanantigeninducestoleranceandprotectionfromallergicasthma,natmedecine；14(2):170-5(verhasselt等人，2008年，母乳介导的抗原转移可诱导耐受性并防御变应性哮喘，《自然-医学》；第14卷(第2期)：第170-175页)]。因而，由已暴露于某些变应原性食物如蛋、坚果等并对其产生免疫的母亲母乳喂养的婴儿可产生对这些变应原的口服耐受性。
因而，需要进一步鉴定可能会影响口服耐受性诱导的因素。高度期望提供低变应原性或非变应原性组合物，这些组合物能够在婴儿中诱导和维持口服耐受性，尤其是在给幼年哺乳动物引入新食物的断乳期施用。
需要提供可预防或缓解发生变态反应的营养解决方案，尤其是在婴儿和学步儿中，尤其是具有发生变态反应的风险的那些。需要诱导对各种变应原(包括乳、蛋、(树)坚果、花生、贝类、小麦和大豆)的耐受性。需要在引入后来的变应原的断乳期期间预防或缓解变态反应的发生。需要维持已经通过母乳而诱导的对某些变应原的口服耐受性。
需要设计和生产营养干预物(尤其是通过合成的成分或成分的组合)，可在生命的最初几年将该干预物施用给婴儿和学步儿，并且该干预物可降低以后生活中出现变应性或变成变应性的或者发展变态反应的可能性或严重程度。
对于一般的婴儿和学步儿群体以及对于对变态反应有易感性或患有明确的变态反应的婴儿和学步儿亚群存在这种需要。
普遍需要缓解变态反应或变态反应症状以及开发诱导和维持对常见变应原(诸如乳，包括乳、蛋、(树)坚果、花生、贝类、小麦和大豆)的耐受性的手段，尤其是在婴儿和学步儿中。
技术实现要素：
本发明涉及一种组合物，该组合物包含至少一种长度介于五至十二个氨基酸的致耐受性肽与tgf-β的组合。致耐受性肽在pct/ep2013/076643和wo2000/42863中进行了描述，并且证明可诱导对乳蛋白、尤其是β-乳球蛋白的耐受性。
tgf-β是存在于初乳以及在较小程度上，存在于成熟母乳中的生物活性肽。其已被鉴定为特应性疾病的强效调节剂并且已经证明，与非变应性母亲相比，tgf-β-1在变应性母亲的成熟乳中显著较少地分泌[rigottieetal.,(2006)“transforminggrowthfactor-betaandinterleukin-10inbreastmilkanddevelopmentofatopicdiseasesininfants.”clinexpallergy.36(5):614-8(rigotti等人，2006年，“母乳中的转化生长因子-β和白介素-10以及婴儿中特应性疾病的发展”，《临床和实验变态反应》，第36卷(第5期)：第614-618页)]。在国际专利申请wo2009/040310中，描述了施用tgf-β来在断乳期的幼年哺乳动物中初级预防对新引入的膳食蛋白的变应性反应的方式。
tgf-β也存在于牛乳中；已在多种牛乳级分和市售的非水解婴儿配方产品(如来自雀巢公司的
在本发明的组合物中，tgf-β与一种或多种致耐受性肽的组合得到一种组合物，该组合物可调节在给幼年哺乳动物引入新的食物的断乳期期间和之后对变应原的哺乳动物免疫应答。该组合物可诱导对乳蛋白、特别是β-乳球蛋白(blg)的口服耐受性，并且还可以延长这种获得的对blg的口服耐受性以及延长已通过食用母乳获得的对其它食物蛋白的口服耐受性。具体地讲，可以延长口服耐受性，其中所述幼年哺乳动物已经喂食了来自已暴露于变应原和/或被该变应原致敏的母亲的母乳，所述变应原为诸如乳、或者蛋、或者(树)坚果、或者花生、或者贝类、或者小麦或大豆、或者任何其它食物蛋白。
在人类婴儿中，在断乳期期间施用本发明的组合物将会(i)通过所述肽和tgf-β的存在来诱导和延长对blg的口服耐受性、(ii)在断乳时，延长已经通过母乳喂养被婴儿或学步儿获得的对食物蛋白的口服耐受性。
可将该组合物施用给哺乳动物，尤其是施用给有食物变态反应(包括对乳蛋白的变态反应)风险的幼年婴儿和学步儿，以诱导对牛乳的口服耐受性，并维持对牛乳的耐受性以及在断乳开始后维持母乳喂养诱导的对各种各样的蛋白质的口服耐受性。
还可以将所述肽用于诱导对山羊的乳蛋白和水牛的乳蛋白、尤其是β-乳球蛋白的耐受性。
可将该组合物以其纯的形式施用；稀释于合适液体中施用，或以药物组合物、营养组合物或营养补充剂的形式施用。
根据本发明的一个实施方案，该组合物中的一种或多种肽的形式为(i)水解含有blg的蛋白质材料所得的分离的肽级分，和/或(ii)通过合成制备的肽。
根据本发明的一个实施方案，该组合物中的tfg-β的形式为天然含有或富含tgf-β的乳清或酪蛋白分离物。
这种组合物的主要优点是可在哺乳动物中诱导和维持对奶牛、绵羊、水牛或山羊乳蛋白、特别是β-乳球蛋白的口服耐受性。此外，可通过食用本发明的组合物延长这些哺乳动物中已通过母乳获得的口服耐受性的时间，渡过和超出关键的断乳期。
这些哺乳动物可以是幼年哺乳动物，并且尤其是人类婴儿或学步儿，其双亲至少一方或至少一个同胞具有变态反应而有发生食物变态反应、特别是牛乳变态反应的“风险”，或其不具“风险”。因而，本发明的组合物对一般的幼年哺乳动物群体有利。
可将该组合物施用给伴侣动物，例如狗和猫。
在一个优选的实施方案中，该组合物包含肽级分形式的至少一种肽，所述肽长度为五至十二个氨基酸并且包含肽序列seqidno.1至seqidno.8中的一者。可施用给幼年哺乳动物或成年哺乳动物的一种或多种肽的剂量可以介于0.4-50μmol/kg体重/天之间、优选介于0.9-40μmol/kg体重/天之间。
可施用给幼年哺乳动物的tgf-β的剂量可以介于600-4000ng/kg体重/天之间、优选介于900-1600ng/kg体重/天之间，更优选介于950-1300ng/kg体重/天之间。
该组合物的施用优选在断乳期期间，但是其可以在开始断乳期之前进行。在人类中，施用可从出生开始，或从一个月、两个月、三个月、四个月、五个月或六个月大开始，或在第一次将非人乳引入进婴儿或学步儿饮食中时或正好在将非人乳引入进婴儿或学步儿饮食之前。通常每天或每两天施用该组合物。然而，施用也可以没那么规律，例如，每三天一次。施用期可以持续至少一个月，优选至少三个月，更优选持续至少6个月或多达一年。施用可以持续更长，例如多达三年。
可将该组合物添加至基础组合物，该基础组合物为例如人乳强化剂、1段婴儿配方食品(starterinfantformula)、或2段婴儿配方食品(follow-upinfantformula)或成长乳(growingupmilk)。该基础组合物可为“非变应原性”或“低变应原性”组合物。
可将该组合物以包含另外的成分或益生元的组合物施用，所述另外的成分或益生元优选选自2’岩藻糖基乳糖、乳-二岩藻四糖、3岩藻糖基乳糖、乳-n-岩藻五糖i、乳-n-岩藻五糖ii、乳-n-岩藻五糖iii、乳-n-新四糖、乳-n-四糖、3’唾液酸乳糖、6’唾液酸乳糖、3’唾液酸乳-n-四糖、6’唾液酸-乳-n-新四糖、菊粉、低聚果糖(fos)、短链低聚果糖(短链fos)、菊粉、低聚半乳糖(gos)、低聚木糖(xos)、神经节苷脂、部分水解的瓜尔豆胶、阿拉伯树胶、大豆胶或它们的混合物。
可将该组合物以包含另外的成分或益生菌的组合物施用，所述另外的成分或益生菌优选选自副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)、鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)、长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)、乳双歧杆菌(bifidobacteriumlactis)以及短双岐杆菌(bifidobacteriumbreve)。
附图说明
图1：食物变应性腹泻。在第12周针对它们对食物变应性腹泻的易感性测试了六组小鼠：由空白
用曼-惠特尼非参数检验(mann-whitneynonparametrictest)测定的指定组之间的统计显著性由写在对比条柱上方的p值指示。
具体实施方式
在本发明中，术语“耐受性”应理解为特异性免疫无应答性的状态。免疫应答的体液(抗体)途径和细胞介导(淋巴细胞等)途径二者均可受到耐受性诱导的抑制。口服耐受性受破坏被认为是食物变态反应的根本原因。
术语“变应原”应理解为能够在哺乳动物、特别是“有风险的”幼年哺乳动物(包括婴儿和学步儿)中引发变应性反应的蛋白质或肽。当双亲至少一方或至少一个同胞为特应性体质时，则年幼的婴儿和学步儿被认为有蛋白质变态反应的“风险”。
术语“致耐受性肽”应理解为蛋白质片段，其对应于天然蛋白质的一部分，大小为300da至6000da(3至50个氨基酸)，优选为500da至3000da，更优选为500da至1400da，并能够诱导对天然蛋白质的特异性口服耐受性。
术语“非变应原性”组合物应理解为氮源含有均衡的氨基酸组成的组合物。“非变应原性”对于乳蛋白被定义为残留的乳清蛋白不超过1ppm，以及被定义为残留的总酪蛋白不超过10ppm。
术语“低变应原性组合物”应理解为具有低变应原性的组合物。
术语“致敏”意指在暴露于变应原后已产生变应原特异性的igg1和/或ige抗体。
术语“水解程度”意指组合物中的蛋白质级分被水解的程度。可使用与蛋白质水解产物中的游离氨基氮基团反应的试剂诸如三硝基苯磺酸(tnbs)来测量水解程度。对于基于乳清蛋白的水解产物，在“部分”蛋白质水解产物中，tnbs反应性氮(表示为％氨基-n/tn)通常在8％-15％的范围内，并且一般而言，深度蛋白质水解产物表征为tnbs反应性氮(％氨基n/tn)为30％-45％。
术语“断乳”意指引入人母乳替代物(诸如婴儿配方食品)和/或补充性液体或固体食物。
术语“婴儿”意指生命最早阶段的儿童，从出生直到其可以走路(通常大约12个月)。
术语“学步儿”意指幼童，通常年龄介于一岁至两岁半之间的儿童。
“tgf-β”或“转化生长因子-β”指一组至少五种不同但密切相关的生物活性肽，其被命名为tgf-β1、tgf-β2等并且尤其是存在于人乳中(tgf-β1和tgf-β2)(lietal,transforminggrowthfactor-bregulationofimmuneresponses,annu.rev.immunol.200624:99-146(li等人，免疫应答的转化生长因子-b调节，《免疫学年鉴》，2006年，第24卷：第99-146页))。tgf-β在物种之间高度保守(大于98％的氨基酸序列同源性)。
本发明涉及一种用于在断乳时在幼年哺乳动物中初级预防对乳蛋白以及对新引入的膳食蛋白的变应性反应的组合物，该组合物包含特定的一组致耐受性肽中的至少一种与tgf-β的组合，所述致耐受性肽源自blg，长度介于5至12个氨基酸之间。
本发明的组合物中存在至少一种长度介于5至12个氨基酸之间并且包含序列seqidno1-8中的一者的肽。肽序列seqidno1-8在表1中示出。致耐受性肽序列seqidno1-5的鉴定和表征在国际专利申请pct/ep2013/076643中进行了描述。
肽seqidno.6(idalnenk)、肽seqidno.7(vldtdy)和肽seqidno.8(evddealek)此前在wo2000/42863中被鉴定为口服耐受性的诱导物。在后一篇文献中这些序列被鉴定为较长肽序列的一部分。
在pct/ep2013/076643中，发明人利用基于细胞的测定法使用表达主要组织相容性复合体(mhc)ii类受体hla-dr的人细胞，鉴定了存在于部分水解的婴儿配方食品
在该专利申请中，解释了作为口服耐受性诱导的第一步，hla受体是如何将肽序列递呈给t细胞，从而诱导耐受性。因而，耐受性的发展很大程度上依赖于mhc对所述肽序列的识别。mhc的肽结合区识别由平均十个氨基酸、最少五个氨基酸构成的肽序列或肽装配物。这些五肽可包含在更长的肽序列(或甚至蛋白质)中，因为它们在胃肠道中会被消化，而得到这种5-18个氨基酸的较小肽尺寸。这在某种程度上解释了由游离氨基酸、二肽、三肽和四肽所构成的深度水解产物无法诱导口服耐受性的原因。
pct/ep2013/076643在blg致敏的实验小鼠模型中进一步确认了表1的肽在体内诱导口服耐受性的能力。
本发明组合物中所包含的一种或多种肽具有5至12个氨基酸长度，并且每种肽包含选自seqidno.1-8的序列(见表1)。所述一种或多种肽因而具有特定的长度(5-12个氨基酸)。
短于五聚物(五个氨基酸长)的肽可能不会提供致耐受效果，而长于12聚物的肽被认为具有增大的变应原性风险。
因此，所述肽可为包含选自seqidno.1-8的序列中任一者的5聚物、6聚物、7聚物、8聚物、9聚物、10聚物、11聚物或12聚物。因此，所述肽可为任一种这样的肽：其为包含序列ivtqtm(seqidno.1)或ivtqtm(seqidno.1)、或kgldiqk(seqidno.2)、或daqsaplr(seqidno.3)、veelkptpe(seqidno.4)、iiaek(seqidno.5)、idalnenk(seqidno.6)、vldtdy(seqidno.7)、或evddealek(seqidno.8)的5聚物、6聚物、7聚物、8聚物、9聚物、10聚物、11聚物或12聚物。
本发明组合物中所包含的肽可以为包含序列seqidno.1-8的肽中的任一种、或两种、或三种、或四种、五种、六种、七种或全部八种肽的组合。
根据本发明的一个实施方案，可以根据技术人员已知的标准方法合成制备所述分离的肽。作为另一种选择，根据本发明的另一个实施方案，它们可从天然来源诸如乳(如牛乳)或乳级分浓缩或提取，所述乳级分优选经过改性、处理以便例如产生或浓缩这些肽。可通过本领域已知的方法生成其中乳蛋白已通过酶或其它手段水解的乳水解产物。从乳水解产物中提取、分离和鉴定含有本发明的肽的肽级分的方法也是技术人员已知的。本发明的肽可通过这些方法生成。
pct/ep2013/076643中详细描述了肽seqidno.1至5的制备和表征。可将其中描述的方法用于制备供包括在本发明组合物中的肽。wo2000/42863中详细描述了肽seqidno.6至8的制备和表征。
根据本发明的一个实施方案，所施用的一种或多种肽的剂量在0.4-50μmol/kg体重/天的范围内，优选在0.9-40μmol/kg体重/天的范围内。例如，如果这些肽作为婴儿配方食品的一部分施用，则这些肽可以50-150μg/g粉末的浓度存在于该配方食品中。供婴儿食用的婴儿配方食品的典型剂量是：对五个月大的婴孩，每天三瓶，每瓶七勺粉末；对六个月大或六个月以上的婴孩来说，每天两瓶，每瓶七勺粉末。所述剂量是基于以下婴孩平均体重：六个月大时，约8千克；十二个月大时，约9.5千克。
pct/ep2013/076643中描述道，序列seqidno.1-5已被鉴定为在奶牛、水牛、家山羊、绵羊和摩弗伦羊的blg中是高度保守的(100％序列同一性)。因而，据信含有这些序列的这些乳源中的任一种都可诱导对牛乳的口服耐受性，反之亦然。因而，本发明人推测，本发明人鉴定出的肽可诱导对来自这些来源中任一者的blg的口服耐受性。
根据本发明的一个实施方案，以足以诱导对牛blg的口服耐受性(优选诱导对牛blg的完全口服耐受性)的量施用本发明的组合物。blg也可来自绵羊或山羊。完全口服耐受性意指在用牛乳(特别是牛blg)进行dbpcfc(双盲安慰剂对照食物激发试验)后未观察到变应性反应。
根据本发明的一个实施方案，这些肽可以总蛋白质的0.01％至5％、优选0.1％至0.5％的量存在。
本发明的组合物还包含tgf-β。
tgf-β可以以分离自乳的多肽生长因子的形式(如例如ep313515或wo92/00994中所述)存在。作为另一种选择，如果优选的话，可使用重组tgf-β。
此外，tgf-β主要以活性形式存在于哺乳动物乳的乳清和酪蛋白两种级分中。因此，要包含在本发明组合物中的tgf-β的形式可以为来自哺乳动物乳，例如来自奶牛、山羊、水牛或骆驼乳的乳清或酪蛋白级分。
可用于本发明的含有tgf-β的乳级分是可以商品名tm0301tm、protarmor865sbtm或vitalarmor购自法国的armorproteines公司或以商品名xp-828ltm购自加拿大的advitech公司的含有tgf-β的乳清蛋白级分。
根据本发明的一个实施方案，本发明的组合物是人乳强化剂、婴儿配方食品，优选较大婴儿配方食品(follow-onformula)，其每克干组合物含有12至300ngtgf-β、优选每克干组合物含有45-100ngtgf-β、更优选每克干组合物含有65-85ngtgf-β。
根据本发明的一个实施方案，所施用的tgf-β的剂量范围为600-4000ng/kg体重/天、优选900-1600ng/kg体重/天并且更优选950-1300ng/kg体重/天。
优选地，根据本发明的一个实施方案，该组合物含有tgf-β1和tgf-β2二者。优选地，tgf-β1和tgf-β2的比率介于2:1和1:20之间，更优选比率介于1:10和1:20之间，例如1:16。
所述组合物可被单独地(以其纯的形式，或稀释于例如水或母乳中)或作为组合物(其为婴儿配方奶粉、较大婴儿配方食品或成长乳，或者食物补充剂，例如人乳强化剂)直接经口施用给幼年哺乳动物。其也可以在营养性喂养期间所用的任何乳载体、非乳基婴儿配方食品、婴孩谷类食物或酸乳、婴孩餐奶酪布丁、乳制品或果汁饮料、果昔(smoothy)、小吃或饼干或者其它烘焙食品中施用。其也可以以宠物食物和饮料(诸如任何干燥食物或粗磨食物、湿润食物或罐装形式、或者补充剂)施用。
根据本发明的一个实施方案，该组合物以低变应原性或非变应原性组合物施用。其可以例如以低变应原性人乳强化剂、早产儿配方食品、1段婴儿配方食品、较大婴儿配方食品、食物补充剂或成长乳施用。其可以例如以非变应原性人乳强化剂、早产儿配方食品、1段婴儿配方食品、较大婴儿配方食品、食物补充剂或成长乳施用。低变应原性和非变应原性组合物通常含有部分水解或深度水解的蛋白质分离物。在一个优选的实施方案中，该组合物以低变应原性组合物施用，该低变应原性组合物包含水解程度介于8％和15％之间的乳水解产物。在其中所述组合物的蛋白质级分以部分水解产物或深度水解产物存在的情形中，可单独地添加tgf-β以确保全长(未水解的)tgf-β(tgf-β1和tgf-β2)存在于所述组合物中。
另一方面，根据本发明的一个实施方案，如果该组合物含有非水解的(例如，乳清)蛋白质级分，则可能需要添加很少或不需要进一步添加tgf-β来使tgf-β含量达到所需水平。根据其中所述组合物的蛋白质分离物未水解或未深度水解的本发明实施方案，将包含序列seqidno.1-8的致耐受性肽单独地添加至所述组合物。就包含部分水解的蛋白质分离物的低变应原性组合物而言，也可以将包含序列seqidno.1-8的致耐受性肽单独地添加至所述组合物。
本发明的组合物可以按指示的剂量用作营养溶液或药物，以在断乳时在幼年哺乳动物中预防对新引入的膳食蛋白的变应性反应。因而，具体地讲，所述组合物用于诱导对blg(来自奶牛、水牛、家山羊、绵羊和摩弗伦羊中的任一者)的口服耐受性，并且还用于维持已获得的对blg的口服耐受性或已通过幼年哺乳动物食用母乳而获得的对其它食物蛋白的口服耐受性。
通过在断乳期期间以及任选在断乳期之前将所述组合物喂食给幼年哺乳动物来获得所指出的治疗效果。可将这些组合物施用给婴儿和学步儿或表现出变态反应症状或变态反应易感性的婴儿和学步儿亚群。
本发明组合物所诱导的对blg的口服耐受性可在中期(在治疗期间或治疗后1、6、12或18个月内)缓解变态反应。
另外，延长或维持已通过食用母乳而获得的口服耐受性会导致在断乳期期间防止产生对新引入的食物的变应性症状。已经知道的是，已通过食用母乳而获得的口服耐受性在一定时期后丧失(例如在小鼠中在第12周时丧失[mosconi等人，2010年])。因而，尽可能长地延长或维持这种已获得的口服耐受性是降低食物变态反应和特应性疾病的发生率的高度有效的方法。
实施例1的卵清蛋白变态反应小鼠模型实验中证实了这种效果。在该实施例中，给断乳的小鼠幼仔组喂食(i)水、(ii)
然后让小鼠幼仔接受食物变态反应诱导规程，简而言之，该诱导规程包括腹膜内注射卵清蛋白/氢氧化铝(佐剂)，然后进行口服ova激发。然后测量它们的变态反应症状，特别是腹泻(实验1)。进行第二组ova激发(实验2)并再次测量变态反应症状，特别是腹泻。
图1示出了该实验的结果并证明，在所进行的两个实验中，相较于由空白母鼠哺乳并且在断乳后接受水的小鼠(对照组)，由暴露于ova且被免疫的母鼠哺乳并且在断乳后接受富含tgf-β的
当将实验1和实验2二者一起分析时，由暴露于ova的母鼠哺乳并且进一步接受富含tgf-β的
在食物变态反应比第一个实验中更严重的第二个实验中，存在比实验1中甚至更好的保护。确实，在对照组中最后2次激发中80％的小鼠具有变应性腹泻，而在由ova免疫和暴露的母鼠哺乳并且在断乳后接受富含tgf-β的
当汇总2个实验中获得的结果时，在由ova免疫和暴露的母鼠哺乳并且在断乳时接受
在未在这里示出的数据中，还已经观察到在这样的幼仔中诱导了口服耐受性并延长了口服耐受性：其由在喂养它们的幼仔的同时(即在喂养期间)暴露于变应原但未被该变应原致敏的母鼠喂养。相比于在由暴露于变应原并被该过敏原致敏的母鼠喂养的幼鼠中观察到的效果，该效果较不明显。因而，总体而言，本发明的组合物可诱导对blg的口服耐受性并可延长已通过食用来自暴露于食物变应原但不一定被其致敏的母亲的母乳而诱导的对这些食物变应原的口服耐受性。通过母亲而暴露于食物变应原通常是在喂食期间。一般而言，在断乳时给幼年哺乳动物施用本发明的组合物可在已喂食来自这样的母亲的乳的幼年哺乳动物中延长对食物变应原的口服耐受性：所述母亲通常在喂食期间已暴露那些食物变应原并任选被那些食物变应原致敏。食物变应原可以是例如乳、或者蛋、或者(树)坚果、或者花生、或者贝类、或者小麦或大豆、或者任何其它食物蛋白。口服耐受性的延长效果在由已被所述食物变应原致敏的母亲喂养的那些幼年哺乳动物中较大。
富含tgf-β的
因而，本申请人已证明，本发明组合物可延长/维持已通过食用母乳而诱导的对变应原的口服耐受性，并且可在断乳期期间暴露于这些变应原后在年幼哺乳动物中预防变态反应症状的发生。
根据本发明的组合物还能够诱导对blg的口服耐受性，无论被施用所述组合物的年幼哺乳动物是否已食用来自已暴露于blg并被blg致敏的母亲的乳。
该组合物还能够维持年幼哺乳动物已通过食用来自已暴露于变应原并且任选被所述变应原致敏的母亲的母乳而获得的口服耐受性，所述变应原特别是乳、或者蛋、或者(树)坚果、或者花生、或者贝类、或者小麦或大豆、或者任何其它食物蛋白。
根据本发明的一个实施方案，可施用该组合物以用于在幼年哺乳动物中在断乳期间和断乳后初级预防对乳蛋白以及对新引入的膳食蛋白的变应性反应。根据本发明的一个实施方案，可施用该组合物以用于在幼年哺乳动物中在断乳期间和断乳后初级预防特应性疾病。根据一个实施方案，幼年哺乳动物有发展变态反应的风险。
组合物的施用优选在给幼年哺乳动物引入新食物的断乳期期间进行。然而，可在断乳期已经开始之前进行施用以“初免(prime)”免疫系统。在人类中，如果自出生母亲就只母乳喂养，则断乳期通常在约四个月、或者五个月或六个月大时发生。另一方面，如果自出生母亲并非仅仅母乳喂养，则断乳期(引入除了母乳以外的食物时)也可以更早发生，在一个月、两个月或三个月大时或者甚至在一周或两周或三周大时，或者甚至从出生就发生。
从而本发明的组合物可发挥最大的治疗效果，其施用应该规律且频繁，例如，每天一次、或者每两天一次。然而，施用也可以没那么规律，例如，每三天一次。施用可以是至少每天一次。该施用可以在每次喂食时，或者没那么频繁。其可以是例如，每天一次或两次或三次或四次或五次或更多次。每天施用组合物的次数也取决于婴儿或学步儿的年龄、其喂食的频率以及照料者的意愿。
施用期可以持续至少一个月，优选至少三个月，更优选持续至少六个月或多达一年。施用可以持续更长，例如多达三年。
本发明的肽的施用周期可以是连续的，也可以是不连续的。要获得更持续的功效，连续施用是优选的。然而，据认为，不连续模式(例如，每两天一次，或每个月在一周期间每日施用，或每个月内隔周每日施用)可引起对幼年哺乳动物或成年哺乳动物的积极效果。
优选地，施用是通过每日摄入(每天服用一次或数次)，或通过每周摄入(每周服用四次、或三次、或两次、或一次)。
一种或多种致耐受性肽(包含序列seqidno.1-8中的任一者)与tgf-β的组合可在不含其它化合物的情况下单独施用(纯的，或稀释于例如水或乳(包括人母乳)中)，或与其它化合物(诸如膳食补充剂、营养补充剂、药物、载体、调味剂、易消化或不易消化的成分)混合施用。
该组合可例如作为组合物(其为人乳强化剂，或其它营养补充剂)的一部分施用给年幼的婴儿或学步儿。包含一种或多种肽与tgf-β的组合的组合物也可以以药物组合物施用。
根据本发明的一个实施方案，一种或多种肽与tgf-β的组合可加入到或包含在基础组合物中，该基础组合物为旨在用于哺乳动物、特别是人类和宠物的组合物。该基础组合物可以含有完整的(非水解的)蛋白质。该基础组合物可以为用于婴儿或学步儿的婴儿配方食品、2段婴儿配方食品或营养组合物。
根据本发明的一个实施方案，一种或多种肽与tgf-β肽的组合可加入到或包含在基础组合物中，该基础组合物为旨在用于哺乳动物、特别是人类和宠物的低变应性组合物。因此，其中添加有这些肽或其中可含有这些肽的基础配方食品可为例如其中乳蛋白被部分水解的低变应原性(ha)配方食品。其还可以是非变应原性配方食品(其中乳蛋白被深度水解或被替换为游离氨基酸)，或牛乳替代品诸如基于大豆的产品。其可例如为用于具有特定生理/病理状态的婴儿或学步儿的婴儿配方食品、2段婴儿配方食品或营养组合物。
在一个实施方案中，配方食品是元素性婴儿配方食品，并且该基础配方食品不包含肽或蛋白质，而仅包含氨基酸。
在一个实施方案中，基础配方食品的蛋白质或肽部分或完全来源于完整的甜乳清或已去除cgmp的甜乳清水解产物。在这方面可参见ep880902，其中的一种工艺允许去除牛乳清中几乎所有酪蛋白-糖-巨肽(富含苏氨酸且色氨酸含量很低的级分)，从而提高α-乳白蛋白比例(色氨酸非常丰富的级分)。通过将该改性甜乳清级分与脱脂乳相结合，同时加入一些游离l-组氨酸和l-精氨酸(以便达到ec指令所要求的这些氨基酸的最小量)，所述配方具有更接近人乳的氨基酸分布，其特征特别在于具有相当的色氨酸和苏氨酸水平，从而允许将其蛋白质含量调整为人乳的蛋白质含量。
当与上述优化的蛋白质分布一起施用时，应当理解，所述的一种或多种肽与tgf-β的组合可与优化的蛋白质分布协同地作用，从而不仅实现口服耐受性的诱导和维持，同时还提供优化的蛋白质营养价值(这可通过以最适定量方式满足蛋白质需求来增强所述肽与tgf-β的效果)。
可将本发明组合物的肽例如作为婴儿配方食品的一部分，以50-150μg/g粉末的浓度施用。
在一个实施方案中，添加了所述的一种或多种肽与tgf-β的组合的基础低变应原性组合物可含有作为氮源的肽或游离氨基酸，其特别是来自奶牛或山羊或绵羊的乳蛋白，诸如乳清蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、牛血清白蛋白、酪蛋白酸、酪蛋白酸盐、或α、β、κ-酪蛋白。氮源可提供总能量的至少7％至25％。
维生素和矿物质是典型膳食补充剂的示例。在一个优选的实施方案中，将该组合物与可增强所描述的对幼年哺乳动物的免疫力的效果的其它化合物一起施用。这类化合物也可以是协同影响或单独影响婴儿的免疫应答和/或增强所述肽的效果的其它活性化合物，诸如益生菌和益生元。
已知的复合益生菌的示例为芽孢杆菌属(bacillus)、双歧杆菌属(bifidobacterum)、乳杆菌属(lactobacillus)、酵母属(saccharomyce)、嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)、屎肠球菌(e.faecium)、尼氏大肠杆菌(e.colinissle)。具体地讲，益生菌和非复制型益生菌，诸如乳杆菌属、双歧杆菌属或它们的组合，例如副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、长双歧杆菌、乳双歧杆菌、短双岐杆菌或它们的组合，以及这些细菌的应用。
益生元和另外的成分优选选自2’岩藻糖基乳糖、乳-二岩藻四糖、3岩藻糖基乳糖、乳-n-岩藻五糖i、乳-n-岩藻五糖ii、乳-n-岩藻五糖iii、乳-n-新四糖、乳-n-四糖、3’唾液酸乳糖、6’唾液酸乳糖、3’唾液酸乳-n-四糖、6’唾液酸-乳-n-新四糖、菊粉、低聚果糖(fos)、短链低聚果糖(短链fos)、低聚半乳糖(gos)、低聚木糖(xos)、神经节苷脂、部分水解的瓜尔豆胶、阿拉伯树胶、大豆胶或它们的混合物。
可存在其它碳水化合物，诸如与第一碳水化合物协同作用的第二碳水化合物，其选自低聚木糖(x0s)胶、阿拉伯树胶、淀粉、部分水解的瓜尔豆胶或它们的混合物。所述一种或多种碳水化合物可以约lg至20g存在，或者以占组合物日剂量的1％至80％或20％至60％存在。作为另一种选择，碳水化合物以干燥组合物的10％至80％存在。
在一个实施方案中，根据wo2007/090894(一般教导内容，特别是实施例1)，该营养组合物包含低聚糖的混合物。其可特别是与gos联合使用。基础配方食品可提供低聚糖混合物，该低聚糖混合物包含5-70重量％的选自galnacα1,3galβ1,4glc和galβ1,6galnacα1,3galβ1,4glc的n-乙酰化低聚糖、20-90重量的至少一种选自galβ1,6gal、galβ1,6galβ1,4glc、galβ1,6galβ1,6glc、galβ1,3galβ1,3glc、galβ1,3galβ1,4glc、galβ1,6galβ1,6galβ1,4glc、galβ1,6galβ1,3galβ1,4glc、galβ1,3galβ1,6galβ1,4glc和galβ1,3galβ1,3galβ1,4glc的中性低聚糖以及5-50重量％的至少一种选自neuacα2,3galβ1,4glc和neuacα2,6galβ1,4glc的唾液酸化低聚糖。
该组合物中可包含一种或多种必需的长链脂肪酸(lc-pufa)。可加入的lc-pufa的示例是二十二碳六烯酸(dha)和花生四烯酸(aa)。可以使得lc-pufa占该组合物中存在的脂肪酸的大于0.01％的浓度加入lc-pufa。
如果需要，可在营养组合物中包含一种或多种食品级的乳化剂；例如二乙酰基酒石酸单和双甘油酯、卵磷脂以及单和双甘油酯，或它们的混合物。可包含类似的合适盐和/或稳定剂。可在组合物中加入调味剂。
所述的一种或多种肽与tgf-β的组合可掺入到或存在于如下组合物中：该组合物为适用于未足月产下的婴儿或出生体重低的婴儿的婴儿“早产儿配方食品”、“1段婴儿配方食品”或“较大婴儿配方食品”。实施例2给出了此类一段配方食品的一个实施例。
实施例1：
进行体内实验来研究在断乳期给幼鼠施用包含具有序列seqno.id1-8的肽和tgf-β的组合物的效果。具体地讲，测量在施用所述组合物后小鼠幼仔对食物变态反应的防御。
该实验设计用于利用这样一个事实：可通过经卵清蛋白(ova)暴露和免疫的母亲的母乳传递ova来诱导对食物变态反应的暂时预防。在第12周评估在断乳后施用部分水解的婴儿配方食品
进行了两个独立的实验(相同的设置)测试以下六个组：
-由空白母鼠哺乳并且在断乳后经口接受以下方案的幼鼠：
水或
-由暴露于ova且被免疫的母鼠哺乳并且在断乳后经口接受以下方案的幼鼠：
水或
在实验1中，每组6只小鼠，在实验2中，每组10-11只小鼠。简而言之，在交配前，通过两次腹膜内注射用吸附于明矾上的ova免疫小鼠或不用其免疫小鼠。在递送时，由空白母鼠或经免疫的母鼠养育空白幼仔，母鼠在三周(哺乳期)期间，每周三次经口接受2mg的ova。在第三周，给小鼠断乳，并在12周大时，使小鼠接受食物变态反应诱导规程(改良自brandt等人，2003年)，简而言之，该规程包括：在第13周和第15周腹膜内注射ova(50ug)/明矾(1mg)，然后从第17周开始进行胃内ova(50ug)激发，一周三次。
当对照组(空白母鼠，断乳后接受水)中超过50％的小鼠表现出腹泻时处死小鼠。
在激发后一个小时根据腹泻分值确定食物变态反应：
-0：正常/硬的粪便
-1：软/粘/形状良好的粪便
-2：不成形的粪便
-3：一次水泻
-4：两次或更多次水泻
结果用曼-惠特尼非参数检验进行比较并在图1中示出。
实施例2：
以下给出根据本发明所用的婴儿配方食品的组成的示例。该组成仅以举例的方式给出。