本发明涉及水产养殖领域，且特别涉及一种预防黄颡鱼红头病的免疫增强剂及其制备方法与应用。
背景技术：
黄颡鱼(pelteobagrusfulvidraco)，又名黄刺骨、黄腊丁、昂刺鱼等，广泛分布于中国长江、黄河、珠江及黑龙江等流域。黄颡鱼味道鲜美、营养丰富、少刺无鳞，且具有一定的滋补作用和药用价值，其价格较高，养殖前景被普遍看好，已成为我国重要的养殖经济鱼类，同时在日本、韩国、东南亚等国家也深受消费者的亲睐，是出口创汇的优良品种。随着黄颡鱼等鱼类集约化养殖的迅速发展，病害的发生成为制约黄颡鱼养殖的一大瓶颈。黄颡鱼“红头病”，又叫“裂头病”、“头肿病”，是近年来黄颡鱼养殖过程中的常见疾病，其是由“爱德华氏菌”感染造成的，感染途径是经鼻腔感染嗅觉细胞，再进入大脑，经脑膜感染头骨。每年的6～9月为红头病的发病高峰期，该病主要危害黄颡鱼，且黄颡鱼幼鱼为主要感染对象，尤其在池塘高密度精养黄颡鱼容易发病。发病初期，病鱼无明显临床表现，随着病程发展，病鱼食欲减退，离群独游，有的在水面做间歇性狂游或较长时间头朝上、尾朝下垂直悬于水中，且来回转动，更有甚者鱼体弯曲成s型，解剖可见内脏特别是肝脏已有不同程度的轻微损伤和病变，主要表现为肝的质地变脆，无弹性，有轻微的变色。发病后期，病鱼出现“一点红”症状，头顶部充血、出血、发红，头顶向上隆起形成脓包、头部皮肤溃烂，严重时头顶穿孔，头盖骨裂开，甚至露出脑组织。病鱼腹部膨大，鳍条基部、鳃盖充血，肛门充血、外突。解剖可见腹腔内含有大量含血的腹水，肝肿大，肠道充血、发炎，肠腔内充满淡黄色水样液体。红头病发病后死亡率可达90％，由于红头病的感染是从鱼脑内向脑外扩散，一旦发病，外用消毒、内服抗生素效果均不太好，治疗难度大，会引发鱼大面积死亡，使养殖户蒙受巨大经济损失，因此，红头病主要以预防为主。生产中，常通过降低饲养密度、改善水质、定期对养殖水体消毒和定期投放恩诺沙星等抗生素类添加剂的方法，以减少水体中病原菌的数量，增强鱼群的抗病能力来预防黄颡鱼红头病。但随着长期、大量的使用抗生素类添加剂，其负面效应日益明显地暴露出来，而在密集养殖的情况下，黄颡鱼的抗病力极易受各种不利因子的影响而降低，所以需定期内服功能性添加剂来提高免疫力和抗病力，以预防黄颡鱼红头病。但是目前专门用于预防黄颡鱼红头病发生的添加剂产品比较少，而且效果有待提高。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种预防黄颡鱼红头病的免疫增强剂，专门用于预防黄颡鱼红头病，效果好且稳定。本发明的第二目的在于提供一种预防黄颡鱼红头病的免疫增强剂的制备方法，该方法简单，制备条件可控性好。本发明的第三目的在于提供一种预防黄颡鱼红头病的免疫增强剂的应用，其用于制备预防黄颡鱼红头病，特别是预防黄颡鱼幼鱼红头病的饲料。本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。本发明提出一种预防黄颡鱼红头病的免疫增强剂，按质量百分数计，其包括以下组分：进一步地，在本发明较佳实施例中，按质量百分数计，其包括以下组分：进一步地，在本发明较佳实施例中，中草药添加剂是采用中草药水提得到，按重量份数计，中草药包括：五倍子3-15份、黄连2-18份、地锦草5-20份、紫草5-20份、甘草5-25份、奶蓟草3-15份。进一步地，在本发明较佳实施例中，中草药添加剂是采用中草药水提得到，按重量份数计，中草药包括：五倍子6-12份、黄连5-15份、地锦草10-15份、紫草10-15份、甘草10-20份、奶蓟草6-12份。进一步地，在本发明较佳实施例中，凝结芽孢杆菌的有效活菌含量≥1×1010cfu/g；嗜酸乳杆菌的有效活菌含量≥1.5×1011cfu/g。进一步地，在本发明较佳实施例中，载体选自脱脂米糠、稻壳粉、麦麸中的至少一种。一种上述的预防黄颡鱼红头病的免疫增强剂的制备方法，其包括以下步骤：将凝结芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、酵母甘露聚糖与膨润土混合均匀，再与中草药添加剂、海带粉、甜菜碱、维生素c、维生素e及载体混合均匀。进一步地，在本发明较佳实施例中，中草药添加剂的制备方法包括以下步骤：按配比称取干燥后的中草药粉末，按料液比1：10-15加水浸泡20-50min后加热至煮沸30-40min，过滤，收集滤液；将药渣按料液比1：5-10加水浸泡再煮沸15-20min，过滤，收集滤液；合并滤液，浓缩冻干制粉。一种上述的预防黄颡鱼红头病的免疫增强剂的应用，免疫增强剂用于制备预防黄颡鱼红头病的饲料。进一步地，在本发明较佳实施例中，免疫增强剂按质量分数0.08％-0.15％添加于黄颡鱼的饲料中。本发明实施例的预防黄颡鱼红头病的免疫增强剂及其制备方法与应用的有益效果是：本发明实施例的预防黄颡鱼红头病的免疫增强剂按质量百分数计包括以下组分：中草药添加剂1％-5％；凝结芽孢杆菌0.1％-0.5％；嗜酸乳杆菌0.05％-0.25％；膨润土1％-5％；酵母甘露聚糖5％-25％；海带粉3％-15％；甜菜碱3％-15％；维生素c2％-10％；维生素e2％-10％；余量为载体，该免疫增强剂专门用于预防黄颡鱼红头病，效果好且稳定。本发明实施例的预防黄颡鱼红头病的免疫增强剂的制备方法是将凝结芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、酵母甘露聚糖与膨润土混合均匀，再与中草药添加剂、海带粉、甜菜碱、维生素c、维生素e及载体混合均匀，即得免疫增强剂，方法简单，制备条件可控性好。本发明实施例的预防黄颡鱼红头病的免疫增强剂的应用主要是用于制备预防黄颡鱼红头病，特别是预防黄颡鱼幼鱼红头病的饲料。具体实施方式为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。下面对本发明实施例的预防黄颡鱼红头病的免疫增强剂及其制备方法与应用进行具体说明。本发明实施例提供一种预防黄颡鱼红头病的免疫增强剂，按质量百分数计，其包括以下组分：中草药添加剂1％-5％；凝结芽孢杆菌0.1％-0.5％；嗜酸乳杆菌0.05％-0.25％；膨润土1％-5％；酵母甘露聚糖5％-25％；海带粉3％-15％；甜菜碱3％-15％；维生素c2％-10％；维生素e2％-10％；余量为载体。在一些优选的实施方式中，免疫增强剂按质量百分数计可包括以下组分：中草药添加剂2％-4％；凝结芽孢杆菌0.2％-0.4％；嗜酸乳杆菌0.1％-0.2％；膨润土2％-4％；酵母甘露聚糖10％-20％；海带粉6％-12％；甜菜碱6％-12％；维生素c4％-8％；维生素e4％-8％；余量为载体。在一些更优选的实施方式中，免疫增强剂按质量百分数计还可包括以下组分：中草药添加剂3％；凝结芽孢杆菌0.3％；嗜酸乳杆菌0.15％；膨润土3％；酵母甘露聚糖15％；海带粉9％；甜菜碱9％；维生素c6％；维生素e6％；载体48.55％。其中，中草药添加剂是采用中草药水提得到，在本申请的一些实施方式中，中草药按重量份数计具体包括：五倍子3-15份、黄连2-18份、地锦草5-20份、紫草5-20份、甘草5-25份、奶蓟草3-15份。进一步的，在本申请的一些优选的实施方式中，中草药按重量份数计包括：五倍子6-12份、黄连5-15份、地锦草10-15份、紫草10-15份、甘草10-20份、奶蓟草6-12份。本实施例所选用的中草药具有以下药理作用：五倍子富含鞣酸，抗菌解毒，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有较强的抑制和杀灭作用。黄连主要成分为小劈柴，具有降脂、抗氧化、抗凋亡等功效，一定程度上弥补了五倍子成分单一的空缺，可使抑菌作用增强，对迟钝爱德华氏菌、温和气单胞菌、鲁氏不动杆菌和嗜水气单胞菌均具有明显的抑制作用。地锦草清热利湿、凉血止血、解毒消肿，全草含黄酮类化合物及没食子酸，其抗菌谱广，对革兰氏阳性菌和阴性菌有较强抑制效果，有明显的中和细菌毒素作用。紫草含有乙酰紫草素，经水解所得紫草素对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌有抑制作用，且紫草具有抗肝细胞损伤、保肝、恢复肝功能的作用，可间接增强黄颡鱼抗病能力，提高免疫保护率。甘草性平，味甘，对各种药物的效果进行调和，其含有甘草酸和甘草甙，可配合五倍子、紫草抑制肠道中的有害菌生长，并促进有益菌繁殖，改善肠道健康；甘草含有的甘草甜素对部分毒物具有吸附作用，有解毒的效果；此外，甘草还可减轻肝细胞变性和坏死程度，降低血清转氨酶活力，提高肝细胞内的糖元和dna含量，促进肝细胞再生。奶蓟草能激活肝脏蛋白的再生，恢复损伤的肝细胞的活性，还可清除自由基、维持肝脏细胞膜的通透性，降低毒素对肝脏的损伤。而且，中草药添加剂选用的中草药之间相互作用：五倍子、黄连、地锦草、紫草配伍，作用协同互补，由不同成分达到很强的抑菌作用。甘草与上述抗菌作用的中草药配伍，起到调和作用，使抑菌效果达到最佳；紫草、甘草、奶蓟草具有减轻肝细胞变性和坏死程度，促进肝细胞再生的作用，配伍使用可最大程度抗肝细胞损伤、保肝、恢复肝功能、降低毒素对肝脏的损伤，从而提高机体的抗病力。其中，凝结芽孢杆菌的有效活菌含量≥1×1010cfu/g。凝结芽孢杆菌为兼性厌氧菌，当其进入肠道后会消耗游离氧而进行肠道繁殖，有利于厌氧微生物乳酸菌和双歧杆菌的生长，同时，其对游离氧的消耗，也可以抑制需氧生存的有害菌，从而调节肠道内微生物菌群的平衡，提高机体的免疫力和抗病力，减少肠道疾病的发生；凝结芽孢杆菌在肠道繁殖的过程中会产生如维生素、氨基酸、短链脂肪酸等多种营养物质来增加小肠蠕动的速度，还会分泌淀粉酶和蛋白酶，改善肠道消化功能，促进机体对营养物质的消化和吸收；凝结芽孢杆菌还能有效激活动物机体单核吞噬细胞的吞噬活性，刺激机体分泌溶菌酶，促进b淋巴细胞的增殖和iga、igg的分泌，从而增强水产动物的免疫力；此外，凝结芽孢杆菌还能产生超氧化物歧化酶和短肽链的脂肪酸，降低机体内的自由基并中和胺类物质，降低体内毒素，减少动物肝脏的负担。其中，嗜酸乳杆菌的有效活菌含量≥1.5×1011cfu/g。嗜酸乳杆菌具备良好的耐受性，能够在动物肠道中定殖，改善肠道酸性环境，促进营养物质吸收，降低氨等毒性物质的积累、平衡肠道菌群、促进动物生长，刺激肠黏膜免疫表达，从而提高免疫力、抗病力。其中，酵母甘露聚糖是从酵母培养细胞壁中提取的抗原活性物质，可选择性地被乳酸菌、双歧杆菌等益生菌利用，促进益生菌繁殖，同时还是优良的免疫激活剂、自由基清除剂，具有、抗菌消炎、抗病毒、保护肠道的功效。其中，海带粉含有的海带多糖是一种免疫调节剂，可对巨噬细胞、t细胞直接进行免疫调节，从而提高免疫力；同时可降低肠道ph，抑制肠道大肠杆菌等有害菌繁殖，维持肠道健康。其中，甜菜碱具有甜味和鱼虾敏感的鲜味，以及适合黄颡鱼嗅觉感受器的化学结构，是理想的诱食剂，使消化液分泌加强，各种消化酶活性提高，分解消化饲料加快，胃肠蠕动加强。同时，有助于改善在疾病或应激状态下摄食量下降的状况，从而维持高营养摄入，可减轻某些病情或应激反应。其中，维生素e可提高机体合成免疫抗体的能力，有助于促进免疫系统发育，同时具有很强的抗氧化能力。动物在患病或遭受应激时，会提高对vc的需求量，但黄颡鱼不能合成足够的vc，因此本实施例加入vc。而且，维生素c可以与维生素e协同抗氧化，保护饲料中的其他营养成分，降低脂质过氧化物对肝脏的损害，具有保肝护肝作用，提高动物抗应激能力，同时维生素c还具有还原维生素e的作用。其中，载体选自脱脂米糠、稻壳粉、麦麸中的至少一种。本发明实施例的免疫增强剂所选组分安全、无有害残留，为生产绿色饲料和水产品创造了条件；配方合理，各组分间具有协同互补作用，配伍使用达到预防黄颡鱼红头病的功效，效果好且稳定。其中，中草药添加剂采用不同中草药配伍制成，不仅达到很强的抑菌作用，还可最大程度抗肝细胞损伤、保肝、恢复肝功能、降低毒素对肝脏的损伤，从而提高机体的抗病力；因黄颡鱼红头病的病原主要由肠道感染所致，凝结芽孢杆菌的兼性厌氧菌特性使其在小肠内消耗游离氧，降低肠内氧浓度，促进了厌氧菌嗜酸乳杆菌的繁殖，两者共同调节肠道微生物菌群的平衡，增加肠道免疫屏障作用；同时，酵母甘露聚糖可被凝结芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌选择利用，既可发挥益生菌的活性，又使益生菌快速和大量繁殖，使益生作用更显著持久；益生菌利用自身分泌的酶系降解中药和海带粉中的蛋白质和多糖，使其变成易于消化吸收的氨基酸、短肽及低分子糖类，同时产生各种具有抗氧化功效的生物活性物质，对中药各成分作用起增效。另外，甘草、奶蓟草、甜菜碱、ve、vc可协同提高机体抗氧化能力和抗应激能力；甜菜碱可改变整个添加剂的适口性。因此，以上组分协同增强了机体的免疫力和抗病力，降低毒素对肝脏的损伤，达到保肝作用，同时促进肠道有益菌落生长繁殖，抑制肠道内有害菌增殖，从而达到了预防黄颡鱼红头病的效果。此外，本发明实施例还提供一种上述的预防黄颡鱼红头病的免疫增强剂的制备方法，其可包括以下步骤：将凝结芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、酵母甘露聚糖与膨润土混合均匀，再与中草药添加剂、海带粉、甜菜碱、维生素c、维生素e及载体混合均匀，即得免疫增强剂。本发明实施例的免疫增强剂的制备方法先将凝结芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、酵母甘露聚糖与膨润土混合，膨润土可对益生菌本身起到保护和附着作用，提高益生菌存活率，凝结芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌与酵母甘露寡糖混合，能够使益生菌更好的发挥作用。再将含量少的组分与载体逐级混合均匀，可使各组分分布均匀。本发明实施例的免疫增强剂的制备方法简单，条件可控性好，稳定性好，具有很好的应用前景。其中，中草药添加剂是采用中草药水提得到。在本申请的一些实施方式中，中草药添加剂的制备方法可包括以下步骤：分别取中草药：五倍子、黄连、地锦草、紫草、甘草、奶蓟草，烘干、粉碎、过200目筛；然后按配比称取干燥后的中草药粉末，具体按重量份数计可称取五倍子3-15份、黄连2-18份、地锦草5-20份、紫草5-20份、甘草5-25份、奶蓟草3-15份，按料液比1：10-15加水浸泡20-50min后加热至煮沸后改文火煎煮30-40min，过滤，收集滤液；将药渣按料液比1：5-10加水浸泡再煮沸后改文火煎煮15-20min，过滤，收集滤液；合并滤液，浓缩冻干制粉。此外，本发明实施例还提供一种上述的预防黄颡鱼红头病的免疫增强剂的应用，免疫增强剂主要用于制备预防黄颡鱼红头病，特别是预防黄颡鱼幼鱼红头病的饲料。在实际应用中，具体的一种应用方式可以是：免疫增强剂按质量分数0.08％-0.15％添加于黄颡鱼的饲料中。免疫增强剂可增强黄颡鱼的免疫力和抗病力，提高肠道功能，保护肝脏，达到预防黄颡鱼红头病的效果，同时还可提高黄颡鱼的生长性能、改善体色，提高经济价值。以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。实施例1本实施例提供一种免疫增强剂，其是采用以下制备方法制得：先制备中草药添加剂：分别取五倍子、黄连、地锦草、紫草、甘草、奶蓟草，烘干、粉碎、过200目筛；然后称取过筛后的五倍子1kg、黄连1kg、地锦草1kg、紫草1kg、甘草1.5kg、奶蓟草1kg，按料液比1：12加水浸泡30min后加热至煮沸后改文火煎煮40min，过滤，收集滤液；将药渣按料液比1：8加水浸泡再煮沸后改文火煎煮18min，过滤，收集滤液；合并滤液，浓缩冻干制粉。准备原料：中草药添加剂1g、凝结芽孢杆菌0.1g、嗜酸乳杆菌0.05g、膨润土1g、酵母甘露聚糖5g、海带粉3g、甜菜碱3g、vc2g、ve2g、脱脂米糠82.85g，共100g。将凝结芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、酵母甘露聚糖与膨润土混合均匀，再与中草药添加剂、海带粉、甜菜碱、vc、ve及脱脂米糠混合均匀，即得免疫增强剂。实施例2本实施例提供一种免疫增强剂，该免疫增强剂的制备方法与实施例1的制备方法大致相同，不同之处在于：准备原料：中草药添加剂2g、凝结芽孢杆菌0.2g、嗜酸乳杆菌0.1g、膨润土2g、酵母甘露聚糖10g、海带粉6g、甜菜碱6g、vc4g、ve4g、脱脂米糠65.7g，共100g。实施例3本实施例提供一种免疫增强剂，该免疫增强剂的制备方法与实施例1的制备方法大致相同，不同之处在于：准备原料：中草药添加剂3g、凝结芽孢杆菌0.3g、嗜酸乳杆菌0.15g、膨润土3g、酵母甘露聚糖15g、海带粉9g、甜菜碱9g、vc6g、ve6g、脱脂米糠48.55g，共100g。实施例4本实施例提供一种免疫增强剂，该免疫增强剂的制备方法与实施例1的制备方法大致相同，不同之处在于：准备原料：中草药添加剂4g、凝结芽孢杆菌0.4g、嗜酸乳杆菌0.2g、膨润土4g、酵母甘露聚糖20g、海带粉12g、甜菜碱12g、vc8g、ve8g、脱脂米糠31.4g，共100g。实施例5本实施例提供一种免疫增强剂，该免疫增强剂的制备方法与实施例1的制备方法大致相同，不同之处在于：准备原料：中草药添加剂5g、凝结芽孢杆菌0.5g、嗜酸乳杆菌0.25g、膨润土5g、酵母甘露聚糖25g、海带粉15g、甜菜碱15g、vc10g、ve10g、脱脂米糠14.25g，共100g。实施例6本实施例提供一种免疫增强剂，该免疫增强剂的制备方法与实施例1的制备方法大致相同，不同之处在于：先制备中草药添加剂：分别取五倍子、黄连、地锦草、紫草、甘草、奶蓟草，烘干、粉碎、过200目筛；然后称取过筛后的五倍子0.5kg、黄连0.5kg、地锦草1.5kg、紫草1.5kg、甘草1kg、奶蓟草1.5kg，按料液比1：10加水浸泡50min后加热至煮沸后改文火煎煮35min，过滤，收集滤液；将药渣按料液比1：5加水浸泡再煮沸后改文火煎煮20min，过滤，收集滤液；合并滤液，浓缩冻干制粉。实施例7本实施例提供一种免疫增强剂，该免疫增强剂的制备方法与实施例2的制备方法大致相同，不同之处在于：先制备中草药添加剂：分别取五倍子、黄连、地锦草、紫草、甘草、奶蓟草，烘干、粉碎、过200目筛；然后称取过筛后的五倍子1.5kg、黄连1.5kg、地锦草1.5kg、紫草0.5kg、甘草1kg、奶蓟草1.5kg，按料液比1：15加水浸泡20min后加热至煮沸后改文火煎30min，过滤，收集滤液；将药渣按料液比1：10加水浸泡再煮沸后改文火煎煮15min，过滤，收集滤液；合并滤液，浓缩冻干制粉。实施例8本实施例提供一种免疫增强剂，该免疫增强剂的制备方法与实施例3的制备方法大致相同，不同之处在于：先制备中草药添加剂：分别取五倍子、黄连、地锦草、紫草、甘草、奶蓟草，烘干、粉碎、过200目筛；然后称取过筛后的五倍子0.5kg、黄连0.5kg、地锦草1.5kg、紫草1.5kg、甘草1kg、奶蓟草1.5kg，按料液比1：10加水浸泡50min后加热至煮沸后改文火煎煮35min，过滤，收集滤液；将药渣按料液比1：5加水浸泡再煮沸后改文火煎煮20min，过滤，收集滤液；合并滤液，浓缩冻干制粉。实施例9本实施例提供一种免疫增强剂，该免疫增强剂的制备方法与实施例4的制备方法大致相同，不同之处在于：先制备中草药添加剂：分别取五倍子、黄连、地锦草、紫草、甘草、奶蓟草，烘干、粉碎、过200目筛；然后称取过筛后的五倍子1.5kg、黄连1.5kg、地锦草1.5kg、紫草0.5kg、甘草1kg、奶蓟草1.5kg，按料液比1：15加水浸泡20min后加热至煮沸后改文火煎30min，过滤，收集滤液；将药渣按料液比1：10加水浸泡再煮沸后改文火煎煮15min，过滤，收集滤液；合并滤液，浓缩冻干制粉。对比例1对比例提供一种免疫增强剂，该免疫增强剂的制备方法与实施例3的制备方法大致相同，不同之处在于：准备原料：凝结芽孢杆菌0.3g、嗜酸乳杆菌0.15g、膨润土3g、酵母甘露聚糖15g、海带粉9g、甜菜碱9g、vc6g、ve6g、脱脂米糠51.55g，共100g。对比例2对比例提供一种免疫增强剂，该免疫增强剂的制备方法与实施例3的制备方法大致相同，不同之处在于：准备原料：中草药添加剂3g、凝结芽孢杆菌0.3g、膨润土3g、酵母甘露聚糖15g、海带粉9g、甜菜碱9g、vc6g、脱脂米糠54.7g，共100g。对比例3对比例提供一种免疫增强剂，其采用以下制备方法制得：取小檗提取物40kg，苦楝叶提取物10kg，氯化钠25kg，柠檬酸6kg，氨基磺酸10kg，椰油酰胺丙基甜菜碱9kg，混合均匀即可完成制备。其中小檗提取物的制备方法为：取小檗果实在80℃条件下烘干，将烘干后的小檗果实粉碎后即得；苦楝叶提取物的制备方法为：取新鲜苦楝叶10kg，捣碎后放入20l容器中，注满清水后搅拌均匀，阴凉处发酵7天，然后将残渣用20目筛网过滤，剩余液体在50℃条件下烘干即得。以下通过饲喂试验对本实施例的免疫增强剂的效果进行检测。试验例1采用单因子设计，将鱼驯化一周后，挑选体格健壮、规格整齐(均重为1±0.03g)的黄颡鱼幼鱼960尾，随机分成6个处理组(每个处理组分为4个重复组，每个重复组40尾)，分别为对照组和5个试验组(试验组1、试验组2、试验组3、试验组4和试验组5)。6个处理组的试验鱼于24个水族箱中(圆柱形，装水量50l)养殖，每日投喂3次(时间分别在7：30、12：30、17：30)，饱食投喂，每次投喂持续30min，尽可能保证饲料被鱼摄食，减少饲料浪费，记录投喂量，养殖期为8周。6个处理组的饲料配方如表1和表2所示，饲料用小型颗粒机加工成粒径为2mm左右的颗粒，常温风干后置于4℃冰箱保存备用。其中，对照组的饲料为基础日粮，5个试验组的饲料分别为对应添加有实施例1-5的免疫增强剂的基础日粮(免疫增强剂的添加量均为饲料总量的0.1％)。另外，每天定时(7：30和17：30)测定水族箱内水体的水温、溶氧和ph，并定期测定水质。养殖期间，采取自然光照条件(昼夜比为10h：14h，水温控制在(27±3)℃，保持水体ph值为7.5-8.0，溶解氧含量大于5mg·l-1，氨氮含量小于0.4mg·l-1，亚硝酸盐含量小于0.06mg·l-1。表1基础日粮组成日粮组成对照组/％试验组(5组)/％鱼粉3333酪蛋白27.527.5糊精25.1725.17豆油3.043.04鱼油3.043.04微晶纤维素5.455.35磷酸二轻钙1.81.8复合预混料11免疫增强剂00.1(分别为5组免疫增强剂)合计100100注：预混料为每千克饲料提供以下矿物质(g·kg-1ofdiet)和维生素(iuormg·kg-1ofdiet):cuso4·5h2o0.02g；feso4·7h2o0.25g；znso4·7h2o0.22g；mnso4·4h2o0.07g；na2seo30.0004g；ki0.00026g；cocl2·6h2o0.001g；维生素a9000iu；维生素d2000iu；维生素e45mg；维生素k32.2mg；维生素b13.2mg；维生素b210.9mg；烟酸20mg；维生素b65mg；维生素b120.016mg；维生素c50mg；泛酸10mg；叶酸1.65mg；胆碱600mg；肌醇10mg；生物素0.012mg。表2不同处理组的免疫增强剂组成养殖试验结束，禁食24h。统计每一水族箱中鱼的尾数并称总重。然后每个重复组挑选30尾体表无损伤的健康试验鱼浸泡在浓度为3.0×107cfu/ml的细菌悬液中1h，随后放回水族箱中继续养殖，记录死亡情况，捡出死鱼，连续观察5天。其中，细菌悬液配制方法为：取发病症状典型的病鱼，用无菌生理盐水冲洗病鱼体表，在无菌条件下解剖后，用接种环自肝脏、肾脏和头部发红部位的脑组织取样，普通营养琼脂培养基平板划线，28℃恒温摇床培养24h，挑取形态一致的优势菌落，接种tsb液体培养基中，28℃恒温摇床培养24h，-20℃保存备用。取-20℃保存的试验用菌株接种tsa平板，28℃培养48h，采用灭菌水洗下培养物稀释成浓度为3.0×107cfu/ml的菌悬液。攻毒试验结束后，统计水族箱中鱼的尾数，将所有无发病症状的鱼用浓度为100mg·l-1的ms-222(sigma,美国)麻醉，置于冰盘上尾静脉采血，血液采集后置于预先制好的抗凝管中，3000r·min-1离心10min(4℃)，收集上清液，样品于-20℃冰箱冷冻保存、待测。试验鱼生长性能指标的计算公式如下：增重率(％)＝(末均重-初均重)/初均重×100％；饲料系数(fcr)＝投饵量/(末均重-初均重)；存活率(％)＝试验结束时总尾数/试验开始时总尾数×100％；发病率％＝出现红头病典型症状总尾数/攻毒总尾数。表3攻毒前不同处理组增重率、饲料系数的比较项目对照组试验组1试验组2试验组3试验组4试验组5存活率％90％b92.5％a95％a97.5％a95％a95％a增重率％115.09b118.05a120.09a120.46a119.20a118.45a饲料系数3.10a2.69bc2.38c2.32c2.42c2.86b注：同行上标没有相同字母表示差异显著(p<0.05)，下同。由表3可知，攻毒前试验组(添加有免疫增强剂)存活率和增重率显著高于对照组(p<0.05)；试验组饵料系数显著低于对照组(p<0.05)，表明添加本发明实施例的免疫增强剂可提高黄颡鱼幼鱼的生长和存活，节省饲料。表4攻毒后不同处理组死亡情况及存活率的比较项目对照组试验组1试验组2试验组3试验组4试验组5出现异常时间h24b72a82a96a96a72a出现死亡时间h70b89a96a--91a5天内发病率％40a6.67b6.67b3.33b3.33b6.67b5天后存活率％66.7b93.3a96.7a100a100a93.3a由表4可知，攻毒后，试验组与对照组相比，发病率显著减少，存活率显著上升，表明添加本发明实施例的免疫增强剂可显著减少黄颡鱼幼鱼红头病的发病率(p<0.05)，提高其存活率(p<0.05)，还具有一定的治疗效果。表5攻毒后不同处理组免疫指标和肝损伤比较由表5可知，攻毒后，试验组的谷草转氨酶、谷丙转氨酶活性与对照组相比显著降低(p<0.05)，表明添加本发明实施例的免疫增强剂可减少黄颡鱼幼鱼肝脏损伤；试验组的补体ach50含量和溶菌酶活性与对照组相比显著增高(p<0.05)，表明添加本发明实施例的免疫增强剂可提高黄颡鱼幼鱼机体免疫力。试验例2按照试验例1的方法进行试验，分组分别为对照组和4个试验组，对照组得饲料为基础日粮，4个试验组的饲料分别对应为添加有实施例6-9的免疫增强剂的基础日粮(免疫增强剂的添加量均为饲料总量的0.1％)。攻毒前不同处理组增重率、饲料系数的比较结果显示：攻毒前试验组(添加有免疫增强剂)存活率和增重率显著高于对照组；试验组饵料系数显著低于对照组；攻毒后不同处理组死亡情况及存活率的比较结果显示：攻毒后，试验组与对照组相比，发病率显著减少，存活率显著上升；攻毒后不同处理组免疫指标和肝损伤比较结果显示：攻毒后，试验组的谷草转氨酶、谷丙转氨酶活性与对照组相比显著降低，试验组的补体ach50含量和溶菌酶活性与对照组相比显著增高。试验例3按照试验例1的方法进行试验，分组分别为3个对照组(对照组1、对照组2、对照组3)和2个试验组(试验组1、试验组2)，3个对照组的饲料分别对应为添加有对比例1-3的免疫增强剂的基础日粮，2个试验组的饲料分别为添加有实施例1、实施例6的免疫增强剂的基础日粮，免疫增强剂的添加量均为饲料总量的0.1％。攻毒前不同处理组增重率、饲料系数的比较结果显示：攻毒前试验组存活率和增重率显著高于对照组3，高于对照组1-2，且试验组中，试验组1的存活率和增重率高于试验组2；攻毒后不同处理组死亡情况及存活率的比较结果显示：攻毒后，试验组的发病率显著低于对照组3，低于对照组1-2，且试验组中，试验组1的发病率低于试验组2；攻毒后不同处理组免疫指标和肝损伤比较结果显示：攻毒后，试验组的谷草转氨酶、谷丙转氨酶活性与对照组相比显著降低，试验组的补体ach50含量和溶菌酶活性与对照组相比显著增高。由上述试验可知，本发明实施例的免疫增强剂添加于饲料中应用，可预防黄颡鱼幼鱼红头病，增强黄颡鱼的免疫力和抗病力，提高肠道功能，保护肝脏，此外还可促进黄颡鱼幼鱼生长，节省饲料。综上所述，本发明实施例的预防黄颡鱼红头病的免疫增强剂专门用于预防黄颡鱼红头病，效果好且稳定；本发明实施例的预防黄颡鱼红头病的免疫增强剂的制备方法简单，制备条件可控性好；本发明实施例的预防黄颡鱼红头病的免疫增强剂的应用用于制备预防黄颡鱼红头病，特别是预防黄颡鱼幼鱼红头病的饲料。以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。当前第1页12