用于制造发酵瓜尔豆粉的方法与流程

本公开涉及制备发酵瓜尔豆粉的方法、通过该方法制备的发酵瓜尔豆粉和包含发酵瓜尔豆粉的饲料组合物。

背景技术：

瓜尔豆(cyamopsistetragonoloba)属于豆科(fabaceae)，并且用作刺槐豆胶(locustbeangum)的替代品。

已知瓜尔豆种子由14％至18％的壳、34％至42％的胚乳、和43％至47％的胚芽构成。具体地，瓜尔豆胚乳包含大量半乳甘露聚糖胶(瓜尔豆胶)，并且已知瓜尔豆胚乳被用作食品添加剂，如乳化剂、增稠剂、和食品粘合剂以及用于页岩(shale)油和页岩气的液压压裂法(fracking)(水力压裂法)提取。

瓜尔豆胚芽和瓜尔豆壳在瓜尔豆胶生产期间作为副产物产生。瓜尔豆粉指代胚芽和壳的混合物，并且通常用作饲料的原料。然而，瓜尔豆粉与动物蛋白相比具有相对低的蛋白质含量，且与幼畜饲料(如，鱼粉、牛奶等)中的动物蛋白相比必需氨基酸、维生素、矿物和ugf(未知生长因子)的含量贫乏，并且包含抗营养因子(anf)，如胰蛋白酶抑制剂、皂苷、残留瓜尔豆胶、和单宁。由于这个原因，当使用瓜尔豆粉作为饲料时，其可降低牲畜的消化率。具体地，由于抗营养因子(如胰蛋白酶抑制剂(ti)和皂苷)可降低幼畜的消化率并且可抑制其生长，因此不会将其添加到幼畜的饲料中，而且其用于养猪或养牛的饲料的用途也非常受限。

为解决瓜尔豆粉的这些问题，已经开发了浓缩瓜尔豆蛋白，但是缺点在于其生产成本高。进一步，已经提议使用复合菌株的瓜尔豆粉发酵方法和使用乳酸菌和酵母的厌氧固态发酵方法(中国专利公开号2015-10384290和2010-10228079)。然而，这些方法具有各种问题：需要长的发酵时间和干燥过程，并且由于厌氧复合菌株和连续输送机的使用还需要质量控制。

技术实现要素：

技术问题

在此背景下，本发明人已经做出大量努力以解决以上问题，结果，他们发现当用芽孢杆菌属(bacillus)菌株发酵瓜尔豆粉时，可提高营养成分和消化率，从而完成了本公开。

技术方案

本公开的一个目的是提供制备发酵瓜尔豆粉的方法，该方法包括以下步骤：(1)预处理瓜尔豆粉；(2)在预处理的瓜尔豆粉中接种芽孢杆菌属菌株；和(3)固态发酵接种在瓜尔豆粉中的菌株以获得发酵瓜尔豆粉。

本公开的另一目的是提供通过以上方法制备的发酵瓜尔豆粉。

本公开的又一目的是提供包含发酵瓜尔豆粉的饲料组合物。

有益效果

制备本公开的发酵瓜尔豆粉的方法可用于制备发酵瓜尔豆粉(其是具有提高的营养成分和消化率的高质量植物蛋白源)，从而提供包含发酵瓜尔豆粉的蛋白质饲料组合物，该蛋白质饲料组合物具有降低的饲料掺合比和益生菌效果。另外，可降低瓜尔豆粉中瓜尔豆胶的粘度，且具体地，可显著降低瓜尔豆粉中难消化的低聚糖和胰蛋白酶抑制剂(ti)的含量，从而制备具有更提高的消化率的高质量发酵瓜尔豆粉。

附图说明

图1是示例制备本公开的发酵瓜尔豆粉的方法的每一个步骤的流程图；

图2是具体示例制备本公开的发酵瓜尔豆粉的方法中的预处理步骤的流程图；

图3是显示瓜尔豆胶粘度根据酶的类型和浓度变化的图；和

图4是显示瓜尔豆粉蛋白质根据菌株的种类的水解程度的图。

最佳实施方式

将如下详细描述本公开。同时，本文公开的各个描述和实施方式也可应用于其它描述和实施方式。即，本文公开的各种要素的所有组合都落入本公开的范围内。进一步，本公开的范围不受下述具体描述的限制。

在一个方面，为实现以上目的，本公开提供了制备发酵瓜尔豆粉的方法，该方法包括以下步骤：(1)预处理瓜尔豆粉；(2)在预处理的瓜尔豆粉中接种芽孢杆菌属菌株；和(3)固态发酵接种在瓜尔豆粉中的菌株以获得发酵瓜尔豆粉。

瓜尔豆(cyamopsistetragonoloba)(也称为瓜胶豆(clusterbean))是属于豆科的植物，并且长至高达2m至3m并与固氮细菌共生。成熟的瓜尔豆主要用作牲畜的饲料，并且也用作绿肥以为土壤提供营养成分。瓜尔豆的豆含有多种营养，但使用瓜尔豆的豆作为食物并不容易，除非从中去除抗营养因子，如胰蛋白酶抑制剂。

瓜尔豆胶(也称为瓜兰(guaran))指代瓜尔豆中含有的半乳甘露聚糖。瓜尔豆胶是由半乳糖和甘露糖组成的多糖，并且是广泛用于化学和医学领域的物质。

瓜尔豆粉是瓜尔豆胶生产期间产生的副产物，并且是约25％胚芽和约75％壳的混合物。虽然瓜尔豆粉由于丰富的蛋白质而可用作饲料组合物，但是存在由于抗营养因子等导致的低消化率问题。

在本公开中，为解决当瓜尔豆粉被用作饲料组合物时产生的问题，证实了当用芽孢杆菌属菌株发酵瓜尔豆粉时，可增加粗蛋白的含量，可减少难消化的低聚糖，并且可降低抗营养因子(如胰蛋白酶抑制剂)以增加消化率，因此，用芽孢杆菌属菌株发酵的发酵瓜尔豆粉可用作饲料组合物。

对步骤(1)的瓜尔豆粉的预处理步骤可包括以下步骤：(1-1)向瓜尔豆粉中添加水以控制其含水量；(1-2)热处理含水量控制的瓜尔豆粉；和(1-3)冷却热处理的瓜尔豆粉。

步骤(1-1)是向瓜尔豆粉中添加水以控制其含水量的加水步骤，并且关于本公开的目的，该步骤对应于通过在瓜尔豆粉中接种细菌而发酵瓜尔豆粉必需的预处理步骤。作为向瓜尔豆粉中添加水的方法，可没有限制地使用本领域已知的方法。

具体地，步骤(1-1)的含水量控制的瓜尔豆粉可具有30％至60％(w/w)，具体地35％至50％(w/w)，且更具体地40％至45％(w/w)的含水量，但不限制于此。具有以上范围内的含水量的瓜尔豆粉可防止由于低水分引起的发酵延迟，可改善在转移和发酵瓜尔豆粉后在干燥过程中需要高成本的问题，并且在热效率方面可以是有利的。

当含水量太低时，不发生瓜尔豆粉的充分发酵，从而产生由于污染菌(contaminants)导致的质量劣化的问题。当含水量太高，例如，含水量为50％或更高时，质量没有问题，但是难以设计过程(process)，并且在固态发酵过程中可加工性和生产成本竞争力可显著下降(deteriorated)。

步骤(1-2)是热处理含水量控制的瓜尔豆粉的加热步骤，并且热处理的目的是杀死生瓜尔豆粉中的杂菌(germs)，同时破坏瓜尔豆粉的细胞壁，并且使蛋白质变性，从而提供其中期望的微生物能够旺盛(vigorously)生长的环境。可使用本领域已知的各种方法进行热处理。

当热处理温度低或当处理时间短时，存在可降低对杂菌的杀菌效果并且随后的发酵过程不能顺利地进行的问题。当热处理温度高或当处理时间长时，由于瓜尔豆粉中蛋白质的变性可降低消化率，因此，存在最终产品的质量可能劣化的问题。

通过此热处理过程，瓜尔豆粉中存在的多数污染菌被杀死，可产生其中可顺利地进行随后发酵过程的化学环境，并且期望减少抑制消化率的抗营养因子，如胰蛋白酶抑制剂(ti)。当热处理温度低或当处理时间短时，存在的问题是：可不发生抗营养因子(如ti)的减少，并且可不杀死瓜尔豆粉原料中的微生物，例如，异源芽孢杆菌属菌株、真菌和病原体。

具体地，步骤(1-2)的热处理是在85℃至95℃下，且更具体地在90℃至95℃下处理瓜尔豆粉，但不限制于此。

具体地，步骤(1-2)的热处理是在85℃至100℃下处理瓜尔豆粉20分钟至35分钟，且具体地在90℃至95℃下处理25分钟至30分钟。可在100℃或更低的温度下处理瓜尔豆粉而无需热力学加压。

步骤(1-3)是冷却热处理的瓜尔豆粉并在瓜尔豆粉中接种芽孢杆菌属菌株，并且是通过冷却加热步骤中升高的瓜尔豆粉的温度以及通过接种芽孢杆菌属菌株作为发酵菌株以诱导发酵所需的过程。

在终止热处理后可自然地进行冷却。为通过提高冷却速率防止过热并进行均匀冷却，可利用输送式冷却设备通过输送过程容易地进行冷却。

具体地，步骤(1-3)的冷却可在20℃至60℃的温度，且更具体地在30℃至50℃的温度下进行，但不限制于此。

步骤(1-3)的芽孢杆菌属菌株可以是枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)或解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)，且更具体地，一种枯草芽孢杆菌(atcc21770)和四种解淀粉芽孢杆菌(解淀粉芽孢杆菌k2g(韩国专利号10-1517326)、atcc23842、atcc23843、和atcc23845)。作为培养芽孢杆菌属菌株的方法，可没有限制地使用本领域已知的方法，且具体地，方法可以是液态培养。

可以按瓜尔豆粉的重量计5重量％至20重量％的量接种芽孢杆菌属菌株，但不限制于此。

在本公开中，步骤(3)是固态发酵接种在瓜尔豆粉中的菌株以获得发酵瓜尔豆粉的步骤，并且此步骤对应于本公开的制备发酵瓜尔豆粉的方法中的培养和发酵步骤。

可以固态进行培养，例如，可使用填充床发酵罐等进行发酵来培养。

如本文所用，术语“固态发酵”指代在固体培养基(如琼脂、明胶等)上培养微生物或动物或植物的细胞，并且作为方法，可没有限制地使用本领域已知的方法。

填充床发酵罐可包括各种类型，如分批式曝气发酵罐(batch-typeaerationfermentor)、密闭式发酵罐、连续曝气发酵罐(continuousaerationfermentor)等，并且只要其对于瓜尔豆粉的固态发酵是有用的，就可在本公开的方法中没有特别限制地使用任何类型。可根据生产规模选择适当的设备然后使用。

当使用酵母、乳酸菌或真菌时，一般发酵过程可涉及48小时至72小时的固体发酵过程，因为生物活性(如代谢和酶活性)可根据每种菌株而不同。然而，当使用芽孢杆菌属菌株时，发酵过程可在24小时内终止，且具体地，可进行约16小时。

具体地，步骤(3)的固态发酵可在30℃至50℃的温度下进行15小时至25小时，且更具体地，在37℃至45℃的温度下进行14小时至16小时。

在步骤(3)中制备的发酵瓜尔豆粉中，可存在相当数量的活细菌，从而表现出益生菌效果。活细菌的数量可具体地为10⁷cfu/g至10⁸cfu/g，但不限制于此。

如本文所用，术语“益生菌”指代进入体内对健康表现出有益效果的活微生物。

本公开的方法在以上步骤(3)之后可进一步包括干燥和粉碎发酵瓜尔豆粉的步骤(4)。

在发酵期间，瓜尔豆粉中的一部分水被蒸发，但是在终止发酵后即时剩余的水含量相当高。然而，为了控制发酵瓜尔豆粉产品中最终的含水量，可进一步需要干燥过程。

进一步，当使用根据本公开的解淀粉芽孢杆菌属菌株进行固态发酵时，发酵瓜尔豆粉的条件非常有利，但其部分地形成松散的聚集体。因此，在干燥后将发酵瓜尔豆粉粉碎成均匀的粒度是必要的。

可通过本领域已知的各种方法进行干燥和粉碎。然而，当在过高的温度下进行干燥时，可杀死发酵瓜尔豆粉中的多数活细菌，因此需要小心。由于这个原因，干燥必须在不杀死活细菌的低温下进行，并且可使用具有低温和低湿度的热空气进行，但不限制于此。可进行粉碎以根据预期的使用目的将发酵瓜尔豆粉粉碎成各种尺寸。可使用例如锤磨机进行粉碎的方法。

在本公开的另一方面中，本公开提供了通过制备发酵瓜尔豆粉的方法制备的发酵瓜尔豆粉。

具体地，发酵瓜尔豆粉可包含芽孢杆菌属菌株，且更具体地，芽孢杆菌属菌株可以是解淀粉芽孢杆菌，但不限制于此。

当根据本公开的上述方法使用解淀粉芽孢杆菌菌株发酵瓜尔豆粉时，可获得一种发酵瓜尔豆粉，其中瓜尔豆粉中的各种抗营养因子(包括ti)可减少、消化率可由于蛋白质的水解和低分子化而提高、并且粗蛋白的含量可增加。由于此发酵瓜尔豆粉具有改善的作为饲料的绝对价值，因此其是作为动物蛋白的替代品的高质量饲料物质，因此，其可用性非常高。

进一步，瓜尔豆粉包含4％至6％的低聚糖。在低聚糖中，作为难消化低聚糖(即，低聚半乳糖(下文，称为gos)的棉子糖和水苏糖占2％至3％。难消化低聚糖的问题在于其可用作有害肠道微生物的营养来源或可引起腹泻。然而，根据本公开的方法发酵的瓜尔豆粉中难消化的低聚糖的含量显著降低。因此，当发酵瓜尔豆粉被用作饲料组合物时，其可表现出优异的消化率。

具体地，通过本公开的方法制备的发酵瓜尔豆粉中胰蛋白酶抑制剂的含量可以为按未经历步骤(1)至(3)的瓜尔豆粉中胰蛋白酶抑制剂(ti)的含量计约30％至约50％。进一步，通过本公开的方法制备的发酵瓜尔豆粉中难消化低聚糖的含量可以为按未经历步骤(1)至(3)的瓜尔豆粉中难消化低聚糖的含量计约10％至约40％。

进一步，本公开的发酵瓜尔豆粉在嗜好性上(inpreference)没有问题，并且其饲料转化率也与大豆粉相似，因此，发酵瓜尔豆粉可广泛作为蛋白质来源使用以代替大豆粉。

在本公开的又一方面，本公开提供了包含通过制备发酵瓜尔豆粉的方法制备的发酵瓜尔豆粉的饲料组合物。

如本文所用，术语“饲料组合物”指代提供维持对象的生命或饲养对象所必需的有机或无机营养物的物质。饲料组合物可包含消耗饲料的对象所需的营养物，如能量、蛋白质、脂质、维生素、矿物等。饲料组合物可以是，但不特别限于植物性饲料，如谷物、坚果、食物副产品、藻类、纤维、油、淀粉、粉、谷物副产品等，或动物性饲料，如蛋白质、无机物质、脂肪、矿物、单细胞蛋白质、浮游动物、鱼粉等。在本公开中，饲料组合物是涵盖添加到饲料的物质(即，添加剂)、饲料原料、或喂养给对象的饲料本身的概念。

对象指代待饲养的对象，并且只要其能够摄取本公开的饲料，就可没有限制地包括任何活有机体。因此，本公开的饲料组合物可应用于用于多数(largenumberof)动物(包括哺乳动物、家禽、鱼和甲壳动物)的饮食，即饲料。其可用于商业上重要的哺乳动物，如猪、牛、山羊等；动物园动物，如大象、骆驼等；牲畜，如狗、猫等。商业上重要的家禽可包括鸡、鸭、鹅等。也可包括商业上饲养的鱼类和甲壳动物，如鳟鱼和虾。

可根据牲畜的种类和年龄、应用类型、期望的效果等适当地控制根据本公开的饲料组合物中的发酵瓜尔豆粉的含量，并且该含量可以是例如1重量％至99重量％，具体地10重量％至90重量％，且更具体地20重量％至80重量％，但不限制于此。

对于施用，除发酵瓜尔豆粉外，本公开的饲料组合物可包含以下中的一种或多种的混合物：有机酸，如柠檬酸、富马酸、己二酸、乳酸等；磷酸盐，如磷酸钾、磷酸钠、多磷酸盐等；天然抗氧化剂，如多酚、儿茶素、生育酚、维生素c、绿茶提取物、壳聚糖、丹宁酸等。根据需要，饲料组合物可包含其它常见的添加剂，如抗流感剂(anti-influenzaagent)、缓冲剂、制菌剂等。进一步，饲料组合物还可被配制成可注射的制剂，如水溶液、悬浮液、乳剂等、通过另外添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂或润滑剂的胶囊、颗粒或片剂。

进一步，本公开的饲料组合物可包含各种辅助物质，如氨基酸、无机盐、维生素、抗氧化剂、抗真菌剂、抗微生物剂等；主要成分，如植物性蛋白质饲料(如粉碎或压碎的小麦、大麦、玉米等)、动物性蛋白质饲料(如血粉、肉粉、鱼粉等)、动物脂肪和植物油；以及营养补充剂、生长促进剂、消化促进剂和预防剂(prophylacticagent)。

当本公开的饲料组合物被用作饲料添加剂时，可直接添加饲料组合物或与其它成分一起使用，并且可根据常规方法适当地使用饲料组合物。饲料组合物的施用形式可被制备成与无毒的药学上可接受的载体结合的速释制剂(immediatereleaseformulation)或缓释制剂。这种可食用载体可以是玉米淀粉、乳糖、蔗糖或丙二醇。在固体载体的情况下，其可以片剂、粉末、锭剂等形式施用。在液体载体的情况下，其可以糖浆、液体悬浮液、乳剂、溶液等形式施用。另外，施用剂可包括防腐剂、润滑剂、溶液促进剂、稳定剂，并且可包括用于改善炎性疾病的其它剂和用于病毒预防的物质。

根据本公开的饲料组合物可以按牲畜饲料的干重计约10g-500g/1kg，且具体地10g-100g/1kg的量混合。在完全混合后，可将饲料组合物提供至网孔(mesh)或可通过另外的方法使其经历造粒(pelletization)、膨胀和挤压过程，但不限制于此。

进一步，饲料组合物可进一步包含选自半乳甘露聚糖酶(galactomannanase)、纤维素酶(celluclast)和戊聚糖复合酶(viscozyme)中的任一种酶。

具体地，可以按发酵瓜尔豆粉的重量计0.1％(w/w)至1.0％(w/w)，更具体地0.1％至0.5％(w/w)，且更具体地0.2％(w/w)的量包含酶，但不限制于此。

酶可以是能够降低瓜尔豆粉中瓜尔豆胶的粘度的酶。当该酶被进一步包含在饲料组合物中时，可降解瓜尔豆粉中存在的1％至3％的瓜尔豆胶，从而改善消化率。

具体实施方式

下文，将参考实施例更详细地描述本公开。然而，这些实施例仅用于示例性目的，并且本公开不旨在受这些实施例限制。

实施例1-1：根据瓜尔豆粉的热处理温度的瓜尔豆粉的营养成分的变化

制备本公开的发酵瓜尔豆粉的方法可包括热处理含水量控制的瓜尔豆粉的步骤。测量了根据热处理温度的发酵瓜尔豆粉中的细菌计数和胰蛋白酶抑制剂(ti)。

详细地，制备了100g瓜尔豆粉，并添加了水使得瓜尔豆粉的含水量为42％(w/w)。随后，将瓜尔豆粉分别在70℃、80℃、90℃、和95℃下热处理30分钟。

在不同温度下热处理后，测量瓜尔豆粉中的细菌计数和胰蛋白酶抑制剂(ti)，并计算其相对于作为对照组的未热处理瓜尔豆粉的相对比率(％)并显示于下表1中。

[表1]

根据不同温度下热处理的细菌计数和ti含量的变化(30分钟，基于42％的含水量)

参考以上表1，随着热处理温度的升高，瓜尔豆粉中的细菌计数和ti含量降低。具体地，当在90℃下进行热处理时，瓜尔豆粉显示5.0×10²cfu/g的细菌计数和1.5mg/g的ti含量，而当在95℃下进行热处理时，瓜尔豆粉显示7.0×10¹cfu/g的细菌计数和0.9mg/g的ti含量。

未热处理的瓜尔豆粉显示4.0×10⁴cfu/g的细菌计数和2.7mg/g的ti含量。当在70℃下进行热处理时，瓜尔豆粉显示3.5×10³cfu/g的细菌计数和2.1mg/g的ti含量，达到79％的相对比率。在相对低的温度条件下，细菌计数和ti含量高，表明作为饲料的可用性低。

相反，随着瓜尔豆粉的热处理温度升高，细菌计数和ti含量降低。具体地，当瓜尔豆粉的热处理温度为80℃至95℃时，观察到优异的效果，并且当瓜尔豆粉的热处理温度为90℃至95℃时，观察到更优异的效果。根据以上热处理条件下的结果，预期在发酵瓜尔豆粉的大规模生产中获得非常有效且经济的效果。

实施例1-2：根据瓜尔豆粉的发酵温度和含水量的瓜尔豆粉的营养成分的变化

测量根据瓜尔豆粉的含水量和发酵温度的发酵瓜尔豆粉中的营养成分。

详细地，制备100g瓜尔豆粉，并添加水使得瓜尔豆粉的含水量分别为40％(w/w)、45％(w/w)和50％(w/w)。随后，分别将瓜尔豆粉在90℃下热处理30分钟，然后冷却至40℃。

将解淀粉芽孢杆菌k2g的培养物以按瓜尔豆粉重量计10重量％的量接种到具有不同含水量的每种瓜尔豆粉中，并充分混合使得含水量分别为40％(w/w)、45％(w/w)和50％(w/w)。然后，在维持恒定温度和湿度的条件下，将瓜尔豆粉在35℃、40℃、45℃和50℃下发酵16小时。将未经历根据本公开的含水量控制步骤、热处理步骤和发酵步骤的瓜尔豆粉原料组用作对照组。

测量根据含水量和发酵温度的瓜尔豆粉中的蛋白质含量，并计算蛋白质含量相对于瓜尔豆粉原料组的增加率和相对比率，并显示于下表2中。

[表2]

根据发酵温度和含水量的营养成分的变化(解淀粉芽孢杆菌k2g，发酵时间为16小时)

参考表2，在发酵温度为40℃和含水量为50％的条件下，观察到最高蛋白质含量为63.5％和最高增加率为110％。换言之，确认当瓜尔豆粉在35℃至50℃或40℃至45℃下发酵时，其具有高蛋白质含量。还确认当瓜尔豆粉在被处理以具有40％至50％或45％至50％的含水量后发酵时，其具有高蛋白质含量。

实施例1-3：根据菌株的发酵瓜尔豆粉的营养成分的变化

制备100g瓜尔豆粉，并添加水使得瓜尔豆粉的含水量为40％(w/w)至45％(w/w)。随后，将瓜尔豆粉在80℃至95℃下热处理30分钟，然后冷却至40℃。以按瓜尔豆粉重量计10重量％的量将一种枯草芽孢杆菌(枯草芽孢杆菌atcc21770)和四种解淀粉芽孢杆菌(解淀粉芽孢杆菌k2g、atcc23842、atcc23843和atcc23845)的各培养物接种在冷却的瓜尔豆粉中，并充分混合使得最终发酵含水量为45％(w/w)至50％(w/w)。然后，在维持恒定温度和湿度的条件下，将瓜尔豆粉在37℃至45℃下发酵14小时至16小时。将未经历根据本公开的含水量控制步骤、热处理步骤和发酵步骤的瓜尔豆粉原料组用作对照组。

测量发酵瓜尔豆粉的蛋白质含量、活细菌计数和ph，并计算蛋白质含量相对于瓜尔豆粉原料组的增加率和相对比率，并显示于下表3中。

[表3]

根据菌株处理的营养成分的变化(基于16小时的发酵时间)

参考表3，发现通过接种芽孢杆菌属菌株发酵的瓜尔豆粉包含62％或更多的粗蛋白质，其比其中未接种芽孢杆菌属菌株的对照组的瓜尔豆粉高5％或更高。因此，当将发酵瓜尔豆粉添加到饲料中时，可降低饲料掺合比。进一步，发酵瓜尔豆粉中的活细菌计数达到10⁷cfu/g至10⁸cfu/g。因此，当将发酵瓜尔豆粉添加到饲料中时，可预期益生菌效果。

实施例2：瓜尔豆粉中瓜尔豆胶的降解及其粘度变化

在瓜尔豆粉中存在1％至3％的瓜尔豆胶，并且已知瓜尔豆胶的粘度会减缓消化器官中的消化，从而抑制消化率。因此，可将能够降低瓜尔豆粉中瓜尔豆胶粘度的酶添加到本公开的发酵瓜尔豆粉中。

检测根据酶的种类和浓度的瓜尔豆胶(半乳甘露聚糖)的降解或其粘度的降低。详细地，将瓜尔豆胶溶解于无菌水中以制备1％的瓜尔豆胶稀释液。半乳甘露聚糖酶(下文称为gm)、纤维素酶(下文称为ce)和戊聚糖复合酶(下文称为vi)中的各酶以不同浓度添加到瓜尔豆胶稀释液中，并检测瓜尔豆胶溶液粘度根据瓜尔豆胶的降解的变化(图3)。

结果，确认所有gm、ce和vi都降低了瓜尔豆胶的粘度，且具体地，gm和vi显示降低瓜尔豆胶的粘度的优异效果。因此，当在包含通过本公开的制备方法制备的发酵瓜尔豆粉的饲料组合物中进一步包含酶时，可提供能够改善饲料的消化率和吸收率的饲料组合物。

实施例3：根据芽孢杆菌发酵的瓜尔豆粉中糖含量的变化

瓜尔豆粉包含4％至6％的低聚糖。在这些低聚糖中，作为难消化低聚糖(即，低聚半乳糖)(下文称为gos)的棉子糖和水苏糖占2％至3％。难消化低聚糖可用作有害肠道微生物的营养来源或可引起腹泻。因此，必须降低其在瓜尔豆粉中的含量。

制备100g瓜尔豆粉，并添加水使得瓜尔豆粉的含水量为40％(w/w)至45％(w/w)。随后，将瓜尔豆粉在80℃至95℃下热处理30分钟，然后冷却至40℃。以按瓜尔豆粉的重量计10％的量分别接种一种枯草芽孢杆菌(枯草芽孢杆菌atcc21770)和四种解淀粉芽孢杆菌(解淀粉芽孢杆菌k2g、atcc23842、atcc23843和atcc23845)、酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)和嗜酸乳杆菌(lactobacillusacidophilus)的各培养物以及酵母菌(saccharomyces)和嗜酸乳杆菌的混合培养物。然后，充分混合接种各菌株的瓜尔豆粉，然后在维持恒定温度和湿度的条件下，在37℃至45℃下发酵14小时至16小时。然而，将接种酿酒酵母的培养物、嗜酸乳杆菌的培养物或酵母菌和嗜酸乳杆菌的混合培养物的瓜尔豆粉在厌氧条件下发酵。

对发酵相同时间段的各发酵瓜尔豆粉进行水提取，并通过0.22μm过滤器过滤。利用carbopa-1(柱温为30℃)测量难消化低聚糖的含量。将未经历根据本公开的含水量控制步骤、热处理步骤和发酵步骤的瓜尔豆粉原料组用作对照组。测量发酵瓜尔豆粉中难消化低聚糖的含量，并计算其相对于瓜尔豆粉原料组的相对比率并显示于下表4中。

[表4]

根据菌株处理的残留难消化低聚糖的含量

¹⁾nd：未检测

参考表4，与对照组相比，接种芽孢杆菌属菌株的发酵瓜尔豆粉中难消化低聚糖的含量显示平均降低80％或更多。具体地，用解淀粉芽孢杆菌k2g发酵的瓜尔豆粉显示最低含量的难消化低聚糖。相反，从用酿酒酵母的培养物、嗜酸乳杆菌的培养物或其混合培养物在厌氧条件下发酵的瓜尔豆粉，gos平均被去除至20％至30％。因此，由于本公开的发酵瓜尔豆粉具有低含量的难消化低聚糖，因此其可用作饲料以提高牲畜的消化率。

实施例4：根据芽孢杆菌发酵的ti含量和体外消化率的变化

测量根据本公开制备的发酵瓜尔豆粉中的胰蛋白酶抑制剂(下文称为ti)的含量和体外消化率。

详细地，制备100g瓜尔豆粉，并添加水使得瓜尔豆粉的含水量为40％(w/w)至45％(w/w)。随后，将瓜尔豆粉在90℃下热处理30分钟，然后冷却至40℃。将一种枯草芽孢杆菌(枯草芽孢杆菌atcc21770)、四种解淀粉芽孢杆菌(解淀粉芽孢杆菌k2g、atcc23842、atcc23843和atcc23845)、酿酒酵母和嗜酸乳杆菌的各培养物以及酵母菌和嗜酸乳杆菌的混合培养物以按瓜尔豆粉重量计10重量％的量接种于瓜尔豆粉中。分别充分混合接种各菌株的瓜尔豆粉，并在维持恒定温度和湿度的条件下在37℃至45℃下发酵16小时。然而，接种酿酒酵母的培养物、嗜酸乳杆菌的培养物或酵母菌和嗜酸乳杆菌的混合培养物的瓜尔豆粉在厌氧条件下发酵。将未经历根据本公开的含水量控制步骤、热处理步骤和发酵步骤的瓜尔豆粉原料组用作对照组。

根据aoacba12-75(americanoilchemists’society)测量通过该方法发酵的瓜尔豆粉和对照组中的ti含量，并根据biosenetal(1997)的步骤2测量体外消化率。测量的ti含量(mg/g)显示于下表5中，并且体外消化率显示于下表6中。

[表5]

根据菌株处理的抗营养因子ti的含量

参考表5，与瓜尔豆粉原料相比，用根据本公开的芽孢杆菌属菌株发酵的瓜尔豆粉的平均ti含量为1.0mg/g，表明平均降低60％。相反，与用芽孢杆菌属菌株的培养物发酵的瓜尔豆粉相比，在用酿酒酵母的培养物、嗜酸乳杆菌的培养物及其混合培养物在厌氧条件下发酵的瓜尔豆粉中，通过发酵降低ti含量的效果不显著。因此，本公开的制备发酵瓜尔豆粉的方法(该方法包括用芽孢杆菌属菌株的培养物发酵瓜尔豆粉的步骤)可降低瓜尔豆粉中的ti含量。因此，当本公开的发酵瓜尔豆粉可用作饲料时，可改善牲畜的蛋白质消化率。

[表6]

根据菌株处理的体外消化率(％)的变化

参考表6，与用嗜酸乳杆菌的培养物发酵的瓜尔豆粉、用酵母菌和嗜酸乳杆菌的混合培养物发酵的瓜尔豆粉和对照瓜尔豆粉相比，用芽孢杆菌属菌株的培养物发酵的瓜尔豆粉显示高体外消化率，这可归因于在用芽孢杆菌属菌株的培养物发酵瓜尔豆粉的步骤中瓜尔豆粉蛋白质的低分子化。然而，与芽孢杆菌属菌株不同，酿酒酵母和嗜酸乳杆菌似乎不能引起瓜尔豆粉蛋白质的低分子化。因此，当通过本公开的制备发酵瓜尔豆粉的方法制备的发酵瓜尔豆粉被用作饲料时，可改善牲畜的蛋白质消化率。

实施例5：根据芽孢杆菌发酵的瓜尔豆粉蛋白质的水解的变化

瓜尔豆粉的蛋白质含量与大豆粉相似或比其更高。然而，由于瓜尔豆粉包含大量的抗营养因子和具有低消化率的高分子量蛋白质，因此其缺点是其由于低消化率而难以用于幼畜。通过将蛋白质转化为水解肽或将蛋白质降解为易于消化的低分子量蛋白质可改善具有低消化率的蛋白质。

因此，为检测根据本公开的方法制备的发酵瓜尔豆粉的消化率的改善，测量发酵瓜尔豆粉的蛋白质的水解程度或分子量。

详细地，制备100g瓜尔豆粉，并添加水使得瓜尔豆粉的含水量为40％(w/w)至45％(w/w)。随后，将瓜尔豆粉在90℃下热处理30分钟，然后冷却至40℃。将解淀粉芽孢杆菌k2g、酿酒酵母和嗜酸乳杆菌的各培养物或酵母菌和嗜酸乳杆菌的混合培养物以按瓜尔豆粉重量计10重量％的量接种于瓜尔豆粉中。分别充分混合接种各菌株的瓜尔豆粉，并在维持恒定温度和湿度的条件下在37℃至45℃下发酵16小时。然而，将接种酿酒酵母的培养物、嗜酸乳杆菌的培养物或酵母菌和嗜酸乳杆菌的混合培养物的瓜尔豆粉在厌氧条件下发酵。

将5.0ml的8m尿素溶液添加到0.1g各获得的发酵瓜尔豆粉的干燥样品中并与之混合，并在25℃下以13000rpm离心5分钟以分离各上清液。将各分离的上清液染色并用染色缓冲液变性，并将其10μl进行sds-page以根据分子量检测蛋白质迁移率。

图4是显示瓜尔豆粉蛋白质根据菌株种类的水解程度的图。从左开始，带1表示未经历根据本公开的含水量控制步骤、热处理步骤和发酵步骤的瓜尔豆粉原料组的提取上清液，带2表示用酿酒酵母发酵的瓜尔豆粉的提取上清液，带3表示用嗜酸乳杆菌发酵的瓜尔豆粉的提取上清液，以及带4表示用解淀粉芽孢杆菌k2g发酵的瓜尔豆粉的提取上清液。

结果，与瓜尔豆粉原料组或使用其它菌株制备的发酵瓜尔豆粉相比，使用解淀粉芽孢杆菌k2g制备的发酵瓜尔豆粉显示分子量显著降低。芽孢杆菌属菌株将瓜尔豆粉的高分子量蛋白质水解成具有小尺寸的肽，因此，本公开的发酵瓜尔豆粉可用作幼畜的蛋白质来源。

实施例6：根据芽孢杆菌属发酵的瓜尔豆粉和大豆粉的混合物的营养成分的变化

将瓜尔豆粉(gm)和大豆粉(sbm)以1:9、5:5和9:1的比率掺合以制备混合物，并添加水使得各混合物的含水量为40％(w/w)至45％(w/w)。随后，充分混合各混合物，然后在90℃至95℃下热处理25分钟至30分钟。热处理后，冷却每种混合物。将两种解淀粉芽孢杆菌(解淀粉芽孢杆菌k2g和atcc23843)的各培养物以5重量％至20重量％的量接种于冷却的瓜尔豆粉/大豆粉混合物中，然后分别充分混合并在维持恒定温度和湿度的条件下在37℃至45℃下发酵14小时至16小时。发酵瓜尔豆粉/大豆粉混合物的营养成分显示于下表7中。

[表7]

根据瓜尔豆粉和大豆粉的掺合比率的发酵后营养成分的变化

*棉子糖和水苏糖的含量

结果是，与原料瓜尔豆粉相比，用解淀粉芽孢杆菌(k2g或atcc23843)发酵的两种瓜尔豆粉显示粗蛋白质含量增加5.4％至6.5％，并且两种芽孢杆菌属菌株能够以10log的活细菌计数生长。进一步，与原料相比，抗营养因子ti和gos的含量降低。所有这些都显示ph增加，其归因于根据芽孢杆菌的蛋白酶活性在代谢过程期间产生的氨。

因此，根据本公开的发酵瓜尔豆粉/大豆粉混合物可非常适合于芽孢杆菌属发酵，并且通过发酵，粗蛋白质的含量增加并且抗营养因子ti和gos的含量降低，从而大大改善消化率。

实施例7：通过肉鸡饲养试验(broilerbreedingtest)评价发酵瓜尔豆粉

为评价发酵瓜尔豆粉的效果，进行肉鸡饲养试验。为进行饲养试验，使肉鸡适应4天，并用大豆粉或其中3％、5％或7％的大豆粉被发酵瓜尔豆粉代替的饲料饲喂共21天(3周)，并检测肉鸡的体重和采食量(feedintake)。使用共80只肉鸡以4次处理×4次重复×5只鸟设计该试验。

详细地，制备100g瓜尔豆粉，并添加水使得瓜尔豆粉的含水量为40％(w/w)至45％(w/w)。随后，将瓜尔豆粉在90℃下热处理30分钟，然后冷却至40℃。将解淀粉芽孢杆菌k2g的培养物以按瓜尔豆粉重量计10重量％的量接种于瓜尔豆粉中。充分混合接种菌株的瓜尔豆粉，并在维持恒定温度和湿度的条件下在37℃至45℃下发酵14小时至16小时，然后干燥。用通过根据代替水平将大豆粉与发酵瓜尔豆粉掺合制备的各试验样品饲喂肉鸡。根据发酵瓜尔豆粉饲喂的肉鸡饲养试验的结果显示于下表8中。

[表8]

发酵瓜尔豆粉的肉鸡饲养试验的结果

结果是，当使用解淀粉芽孢杆菌k2g制备的发酵瓜尔豆粉被5％代替时，与仅用大豆粉饲喂的肉鸡相比，肉鸡的体重和采食量增加。即，这些结果表明发酵瓜尔豆粉在嗜好性上没有问题，并且降低了强烈的草味(其是生瓜尔豆粉自身的气味)，并且其饲料转化率(fcr)也与大豆粉的相似。因此，根据本公开制备的发酵瓜尔豆粉可在未来广泛用作代替大豆粉的蛋白质来源。

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