通过施用微生物或其纯化菌株的合成生物集合体来提高禽类产量的制作方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年10月18日提交的美国临时申请号62/574,031的优先权权益；所述临时申请以引用的方式整体并入本文。

本公开涉及尤其可应用于禽类或家禽养殖的分离的且生物纯的微生物。所公开的微生物可以其分离的且生物纯的状态使用，以及被配制成组合物。此外，本公开提供了生物集合体(bioensembles)，所述生物集合体含有所公开的微生物的至少两种成员；以及利用所述生物集合体的方法。此外，本公开提供了调节禽类或家禽微生物组以调节免疫系统的方法。

关于序列表的声明

与本申请相关的序列表以文本格式代替纸质副本提供，并且特此以引用的方式并入本说明书中。包含序列表的文本文件的名称是asbi_012_01wo_st25.txt。所述文本文件是165kb，于2018年10月17日创建，并通过efs-web以电子方式提交。

背景技术：

到2050年，预计全球人口将增加至超过90亿人，同时人均可用的土地、水和其他自然资源的量减少。预测表明，国内平均收入也将增加，中国和印度的gdp预计增长。对富含动物源蛋白质的饮食的需求随着收入增加而上升，因此全球畜牧业将充满使用更少资源生产更多动物产品的挑战。联合国粮食和农业组织(foodandagricultureorganizationoftheunitednations)预测，将必须生产多70％的粮食，但可供使用的可耕土地面积将减少。显然，为了支持人口增长，每单位资源投入的粮食产量将必须大幅增加。

近几十年来，养殖业见证了肉类行业的快速增长，这得益于对禽肉的需求不断增长，禽肉以过去五十年中每年的人口增长率的约三倍不断增长。

禽肉、蛋及其组分主要用于制备许多不同形式的食品。通过营养调节、激素治疗、动物管理的变化和选择性育种，一直存在许多用于改善家禽和蛋生产的策略；然而，需要更有效地生产每只动物的可食用家禽食品。

鉴定用于可持续增加家禽和蛋生产的组合物和方法、同时平衡动物健康和福祉已成为满足不断增长的人口中日常人类需求的必要条件。通过扩大农场家禽总数来增加全球家禽产量不仅在世界许多地方在经济上不可行，而且将进一步导致负面的环境后果，因为家禽业的增长以及集约化和集中化趋势已经引起了许多环境问题，主要是由于产生的废物远远多于土地处置能够管理的废物。

大型农场中家禽的种群密度通常伴随着微生物病原体的发病率增加，这使得家禽产量处于风险之中，并且进一步使家禽的最终消费者处于人畜共患病原体(如梭菌属(clostridium)和沙门氏菌属(salmonella)的那些)的风险。考虑到许多人畜共患病原体的广泛存在，家禽不可能完全免受暴露。研究的重点是增加对暴露于这些病原体的家禽的定殖抗性的研究方法。此外，大型家禽养殖场生产出大型禽群，所述大型禽群表现出大小、健康、肉含量的高度变异性，这至少部分是由于生殖和肠道微生物组的多样性方面表现出的高度变异性。

因此，通过简单地扩大目前在大多数发达国家使用的高投入农业系统来满足全球家禽产量预期是根本不可行的。

因此，本领域迫切需要增加家禽和蛋生产的改进的方法，同时还减轻微生物病原体的定殖和传播。

技术实现要素：

在一些实施方案中，本公开总体上涉及一种用于改善禽类的一种或多种合乎需要的性状的方法，所述方法包括：(a)向禽类施用有效量的微生物组合物，所述微生物组合物包含：(i)纯化的微生物群体，所述纯化的微生物群体包含具有16s核酸序列的一种或多种细菌，所述16s核酸序列与选自seqidno:1-50和59-387的核酸序列共享至少97％序列同一性；和/或具有its核酸序列的一种或多种真菌，所述its核酸序列与选自seqidno:51-58的核酸序列共享至少97％序列同一性，和(ii)适合用于禽类施用的载体；其中与尚未施用所述微生物组合物的禽类相比，所述纯化的微生物群体以有效改善一种或多种合乎需要的性状的量存在于所述微生物组合物中；并且其中所述一种或多种合乎需要的性状的改善是先天性免疫应答的改善、正常胃肠形态的改善、生长速率的改善、总体重的改善、饲料转化率的改善、病原体排除的改善、针对病原体的竞争性排除的改善、死亡率降低、禽群变异性降低、抗微生物剂的产生改善、刺激b细胞的产生改善、刺激淋巴细胞的产生改善、绒毛长度的改善以及炎性细胞因子表达的改善。

在一些实施方案中，所述禽类是肉鸡。在一些实施方案中，所述一种或多种细菌和/或所述一种或多种真菌具有至少约0.1的mic评分。

在一些实施方案中，所述纯化的微生物群体包含具有16s核酸序列的细菌，所述16s核酸序列与seqidno:386共享至少97％同一性。在一些实施方案中，所述纯化的微生物群体包含具有16s核酸序列的细菌，所述16s核酸序列与seqidno:387共享至少97％同一性。在一些实施方案中，所述纯化的微生物群体还包含具有16s核酸序列的一种或多种细菌，所述16s核酸序列与选自由以下组成的组的核酸序列共享至少97％序列同一性：seqidno:13、seqidno:1、seqidno:3、seqidno:31、seqidno:369、seqidno:374和seqidno:348。在一些方面，所述纯化的微生物群体包含具有16s核酸序列的一种或多种细菌，所述16s核酸序列与seqidno:386和seqidno:387共享至少97％序列同一性。在一些方面，所述纯化的微生物群体包含具有16s核酸序列的一种或多种细菌，所述16s核酸序列包含seqidno:386和seqidno:387。在一些方面，所述纯化的微生物群体包含具有16s核酸序列的一种或多种细菌，所述16s核酸序列选自由以下组成的组：seqidno:13、seqidno:1、seqidno:3、seqidno:31、seqidno:369、seqidno:374和seqidno:348。在一些实施方案中，所述纯化的微生物群体还包含具有16s核酸序列的一种或多种细菌，所述16s核酸序列与选自由以下组成的组的核酸序列共享至少97％序列同一性：seqidno:1和seqidno:3。在一些实施方案中，所述纯化的微生物群体包含具有16s核酸序列的一种或多种细菌，所述16s核酸序列与seqidno:386和seqidno:387共享至少97％序列同一性。在一些实施方案中，所述纯化的微生物群体包含具有16s核酸序列的一种或多种细菌，所述16s核酸序列包含seqidno:386和seqidno:387。在一些实施方案中，所述纯化的微生物群体包含具有16s核酸序列的一种或多种细菌，所述16s核酸序列选自由以下组成的组：seqidno:1和seqidno:3。

在一些实施方案中，所述微生物组合物被配制为包囊、片剂、胶囊、丸剂、饲料添加剂、食物成分、食物制剂、食物补充剂、水添加剂、水混合的添加剂、热稳定的添加剂、水分稳定的添加剂、制粒前的饲料添加剂、制粒的饲料添加剂、制粒后施加的饲料添加剂、消耗性溶液、消耗性喷雾添加剂、消耗性固体、消耗性凝胶、注射剂、栓剂、浸液、大丸剂或它们的组合。

在一些实施方案中，所述一种或多种合乎需要的性状的改善是抗微生物剂的产生改善。在一些实施方案中，所述抗微生物剂产生的改善是胃肠道中抗微生物剂产生的改善。在一些实施方案中，纯化的微生物群体的施用包括施用第一微生物组合物和第二微生物组合物。

在一些实施方案中，所述微生物组合物引发胃肠道中独特物种数目的变异性降低。在一些实施方案中，独特物种数目的变异性降低是微生物的独特物种的总数减少至约50与400物种之间。

在一些实施方案中，本公开总体上涉及一种微生物组合物，所述微生物组合物包含(i)纯化的微生物群体，所述纯化的微生物群体包含具有16s核酸序列的一种或多种细菌，所述16s核酸序列与选自seqidno:1-50和59-387的核酸序列共享至少97％序列同一性；和/或具有its核酸序列的一种或多种真菌，所述its核酸序列与选自seqidno:51-58的核酸序列共享至少97％序列同一性，和(ii)适合用于禽类施用的载体；其中与尚未施用所述微生物组合物的禽类相比，所述纯化的微生物群体以有效改善一种或多种合乎需要的性状的量存在于所述微生物组合物中；并且其中所述一种或多种合乎需要的性状的改善是先天性免疫应答的改善、正常胃肠形态的改善、生长速率的改善、总体重的改善、饲料转化率的改善、病原体排除的改善、针对病原体的竞争性排除的改善、死亡率降低、禽群变异性降低、抗微生物剂的产生改善、刺激b细胞的产生改善、刺激淋巴细胞的产生改善、绒毛长度的改善以及炎性细胞因子表达的改善；并且其中所述一种或多种细菌中的至少一种和/或所述一种或多种真菌中的至少一种被干燥。

在一些方面，所述禽类是肉鸡。在一些方面，所述一种或多种细菌和/或所述一种或多种真菌具有至少约0.1的mic评分。

在一些实施方案中，所述纯化的微生物群体包含具有16s核酸序列的细菌，所述16s核酸序列与seqidno:386共享至少97％同一性。在一些实施方案中，所述纯化的微生物群体包含具有16s核酸序列的细菌，所述16s核酸序列与seqidno:387共享至少97％同一性。在一些实施方案中，所述纯化的微生物群体还包含具有16s核酸序列的一种或多种细菌，所述16s核酸序列与选自由以下组成的组的核酸序列共享至少97％序列同一性：seqidno:13、seqidno:1、seqidno:3、seqidno:31、seqidno:369、seqidno:374和seqidno:348。在一些方面，所述纯化的微生物群体包含具有16s核酸序列的一种或多种细菌，所述16s核酸序列与seqidno:386和seqidno:387共享至少97％序列同一性。在一些方面，所述纯化的微生物群体包含具有16s核酸序列的一种或多种细菌，所述16s核酸序列包含seqidno:386和seqidno:387。在一些方面，所述纯化的微生物群体包含具有16s核酸序列的一种或多种细菌，所述16s核酸序列选自由以下组成的组：seqidno:13、seqidno:1、seqidno:3、seqidno:31、seqidno:369、seqidno:374和seqidno:348。在一些实施方案中，所述纯化的微生物群体还包含具有16s核酸序列的一种或多种细菌，所述16s核酸序列与选自由以下组成的组的核酸序列共享至少97％序列同一性：seqidno:1和seqidno:3。在一些实施方案中，所述纯化的微生物群体包含具有16s核酸序列的一种或多种细菌，所述16s核酸序列与seqidno:386和seqidno:387共享至少97％序列同一性。在一些实施方案中，所述纯化的微生物群体包含具有16s核酸序列的一种或多种细菌，所述16s核酸序列包含seqidno:386和seqidno:387。在一些实施方案中，所述纯化的微生物群体包含具有16s核酸序列的一种或多种细菌，所述16s核酸序列选自由以下组成的组：seqidno:1和seqidno:3。

在一些实施方案中，所述微生物组合物被配制为包囊、片剂、胶囊、丸剂、饲料添加剂、食物成分、食物制剂、食物补充剂、水添加剂、水混合的添加剂、热稳定的添加剂、水分稳定的添加剂、制粒前的饲料添加剂、制粒的饲料添加剂、制粒后施加的饲料添加剂、消耗性溶液、消耗性喷雾添加剂、消耗性固体、消耗性凝胶、注射剂、栓剂、浸液、大丸剂或它们的组合。

在一些实施方案中，所述一种或多种合乎需要的性状的改善是抗微生物剂的产生改善。在一些实施方案中，所述抗微生物剂产生的改善是胃肠道中抗微生物剂产生的改善。

在一些实施方案中，所述微生物组合物引发胃肠道中独特物种数目的变异性降低。在一些实施方案中，独特物种数目的变异性降低是微生物的独特物种的总数减少至约50与400物种之间。

关于出于专利程序目的的微生物保藏的国际认可的布达佩斯条约

本申请中描述的一些微生物保藏在位于1815n.universityst.,peoria,il61604,usa的美国农业部(usda)农业研究机构(ars)培养物保藏中心本申请中描述的一些微生物保藏在位于60bigelowdrive,eastboothbay,maine04544,usa的provasoli-guillard国家海洋藻类和微生物保藏中心。本申请中描述的一些微生物保藏在位于10801universityboulevard,manassas,virginia20108,usa的美国典型培养物保藏中心(atcc)。

所述保藏是根据布达佩斯条约关于出于专利程序目的的微生物保藏的国际认可的条款而作出的。上述布达佩斯条约保藏的atcc和provasoli-guillard国家海洋藻类和微生物保藏中心登录号提供于表2中。本申请中描述的微生物的登录号和相应的保藏日期单独提供于表15中。

至少自从2016年3月1日已经在ascusbiosciences,inc.的实验室中保藏了以下表中指定的菌株。自2017年10月之前分离并储存了包含seqidno:386和387的菌株。

在表1中，第2和5列中列出了微生物分类的最接近的预测命中。第2列是通过blast预测的最高分类学命中，并且第5列是通过blast预测的属+种的最高分类学命中。至少自从2016年3月1日已经在ascusbiosciences,inc.的实验室中保藏了以下表中指定的菌株。

表1列举了本公开的细菌和真菌的菌株名称。如果括号中的字母遵循任何菌株名称，则表明那些菌株中的每种都具有与参考菌株(具有括号内的(a))共有至少97％序列同一性的变体。ascusbbr_5796(a)具有两种变体，分别与ascusbbr_5796(a)共有97.8％和98.2％序列同一性的ascusbbr_5796(b)和ascusbbr_5796(c)。ascusbbr_14690(a)具有两种变体，分别与ascusbbr_14690(a)共有97.8％和98.2％序列同一性的ascusbbr_14690(b)和ascusbbr_14690(c)。ascusbbr_38717(a)与ascusbbr_38717(b)共有98.6％序列同一性。ascusbbr_33(a)与ascusbbr_33(b)共有98.2％序列同一性。ascusbbr_409(b)、ascusbbr_409(c)、ascusbbr_409(d)分别与ascusbbr_409(b)共有98.2％、97.3％和97.8％序列同一性。ascus_331885(b)和ascus_331885(c)分别与ascus_331885(a)共有97.8％和97.3％序列同一性。ascusbbr_247(a)与ascusbbr_247(b)共有97.8％序列同一性。ascusbbr_10593(a)与ascusbbr_10593(b)共有99.6％序列同一性。ascusbbr_32731(a)与ascusbbr_32731(b)共有97.3％序列同一性。ascusbbr_1436(a)与ascusbbr_1436(b)共有97.8％序列同一性。ascusbbr_265(a)与ascusbbr_265(b)共有99.6％序列同一性。

附图说明

图1示出用于确定一种或多种活性微生物菌株的绝对丰度的方法的一个实施方案的一般工作流程。

图2示出用于确定具有一个或多个元数据(环境)参数的样品中一种或多种或两种或更多种活性微生物菌株的共现、然后在确定关系的网络上利用聚类分析和群落检测方法的方法的一个实施方案的一般工作流程。

图3是示例性鸡的解剖结构的草图描绘。

图4是鸡的从喙至泄殖腔的切除胃肠道的图像。

图5描绘在胃肠道中发生的复杂微生物相互作用。良好平衡的共生微生物负载涉及维持多种稳态系统。

图6描绘用分离的微生物菌株和甘露糖结合凝集素(mbl)进行的凝集素结合测定的可能结果。

图7描绘用分离的微生物菌株进行的明胶/胶原结合测定的可能结果。cp＝产气荚膜梭菌，菌株1＝无毒cnaa阳性，菌株2＝无毒cnaa阴性。所有报告的结果均通过它们各自的对照进行了校正。

图8描绘整个实验组中微生物会聚速率的直方图。

图9描绘所述实验的最终死亡率百分比的直方图。

具体实施方式

定义

虽然据信以下术语由本领域普通技术人员良好理解，但是阐述了以下定义以便于解释本发明公开的主题。

术语“一个/种(a/an)”可指所述实体中的一个/种或多个/种，即可指复数指示物。因此，术语“一个/种(a/an)”、“一个/种或多个/种”和“至少一个/种”在本文中可互换使用。另外，通过不定冠词“一个/种(a/an)”提及“要素”时不排除多于一种要素存在的可能性，除非上下文清楚地要求存在一种并仅有一种要素。

在本说明书全文中对“一个实施方案”、“实施方案”、“一个方面”或“方面”的提及意味着结合所述实施方案描述的特定特征、结构或特性可包括在本公开的至少一个实施方案中。因此，贯穿本说明书在各个地方出现短语“在一个实施方案中(inoneembodiment)”或“在一个实施方案中(inanembodiment)”不必要全部是指相同的实施方案。此外，具体特征、结构或特性可以任何合适的方式组合在一个或多个实施方案中。

如本文所用，在特定实施方案中，当在数值之前时，术语“约”或“大约”表示所述值加上或减去10％的范围。

如本文所用，术语“微生物(microorganism)”或“微生物(microbe)”应在广义上采用。这些术语可互换使用，并且包括但不限于两个原核结构域、细菌和古细菌、真核真菌和原生生物以及病毒。在一些实施方案中，本公开涉及表1和/或表3的“微生物”，或通过引用并入的“微生物”。这种表征不仅可参考所述表的预测的分类微生物标识符，而且参考所述表中列出的鉴定的微生物菌株。

术语“生物集合体”、“微生物集合体”或“合成集合体”是指包含通过本公开的方法、系统和/或设备鉴定并且不天然地存在于天然存在的环境中和/或处于自然界中不存在的比例或数量的一种或多种活性微生物的组合物。生物集合体是单独微生物物种或物种的菌株的微生物群落的子集，其可被描述为执行共同功能，或可被描述为参与或导致或与可识别的参数相关，如感目标表型性状(例如，家禽中提高的饲料效率)。所述生物集合体可包含微生物的两种或更多种物种，或物种的菌株。在一些情况下，所述微生物在群落内共生地共存。

在本公开的某些方面，生物集合体是或是基于作为分离的和生物学纯的培养物存在的一种或多种分离的微生物。本领域的普通技术人员将理解，特定微生物的分离的和生物学纯的培养物表示所述培养物基本上不含(在科学原因中)其他生物体，并且仅含有所讨论的单个微生物。所述培养物可含有不同浓度的所述微生物。本公开指出，分离的和生物学纯的微生物通常“必然不同于较不纯的或不纯的材料”。参见，例如inrebergstrom,427f.2d1394,(ccpa1970)(讨论纯化的前列腺素)，还参见inrebergy,596f.2d952(ccpa1979)(讨论纯化的微生物)，还参见parke-davis&co.v.h.mulford&co.,189f.95(s.d.n.y.1911)(j.hand讨论纯化的肾上腺素，在某种程度上，部分修改，196f.496(2dcir.1912)，其各自以引用的方式并入本文。此外，在一些方面，本公开的实施方式可能需要对于将分离的且生物学上纯的微生物培养物用于所公开的微生物集合体中必须实现的浓度或纯度限制的某些定量测量。在某些实施方案中，这些纯度值的存在是将通过目前公开的方法鉴定的微生物与以天然状态存在的那些微生物区分开的另一属性。参见，例如,merck&co.v.olinmathiesonchemicalcorp.,253f.2d156(4^thcir.1958)(讨论由微生物产生的维生素b12的纯度限制)，以引用的方式并入本文。

生物集合体可施加或施用至靶标，如靶环境、群体、个体、动物和/或类似物。

术语“微生物群落”是指包含两种或更多种物种或菌株的一组微生物。与生物集合体不同，微生物群落不必执行共同功能，或者不必参与、导致或与可识别参数相关联，如目标表型性状(例如家禽中提高的饲料效率)。

如本文所用，“分离物”、“分离的”“分离的微生物”和类似术语意图表示所述一种或多种微生物已经与在特定环境中与其相关的至少一种材料(例如土壤、水、动物组织)分离。

本公开的微生物可包括孢子和/或营养细胞。在一些实施方案中，本公开的微生物包括处于存活但非可培养(vbnc)状态或静止状态的微生物。参见liao和zhao(美国公布us2015267163a1)。在一些实施方案中，本公开的微生物包括生物膜中的微生物。参见merritt等人(美国专利7,427,408)。

因此，“分离的微生物”在其天然存在的环境中不存在；相反，在本文通过各种技术描述，所述微生物已从其自然环境中除去并置于非天然存在的存在状态中。因此，分离的菌株或分离的微生物可作为例如生物学纯的培养物存在，或作为与可接受的载体缔合的孢子(或其他形式的菌株)存在。

如本文所用，“孢子(spore)”或“孢子(spores)”是指由细菌和真菌产生的适于存活和分散的结构。孢子通常被表征为休眠结构；然而，孢子能够通过萌发过程进行分化。萌发是孢子分化成能够代谢活动、生长和繁殖的营养细胞。单个孢子的萌发产生单个真菌或细菌营养细胞。真菌孢子是无性繁殖的单位，并且在一些情况下是真菌生命周期中的必需结构。细菌孢子是存活条件的结构，所述结构通常对营养细胞的存活或生长是不导电的。

如本文所用，“微生物组合物”是指包含本公开的一种或多种微生物的组合物，其中在一些实施方案中，将微生物组合物施用至本公开的动物。

如本文所用，“载体”、“可接受的载体”或“药物载体”是指与化合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。此类药物载体可以是无菌液体如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些；如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。水或水溶液盐水溶液和水性右旋糖溶液和甘油溶液优选用作载体，在一些实施方案中用作可注射溶液。在一些实施方案中，胶凝剂用作载体。或者，所述载体可以是固体剂型载体，包括但不限于粘合剂(用于压制丸剂)、助流剂、囊封剂、调味剂和着色剂中的一种或多种。载体的选择可关于预期施用途径和标准药学实践来选择。参见hardee和baggo(1998.developmentandformulationofveterinarydosageforms.第2版crcpress.504pg.)；e.w.martin(1970.remington’spharmaceuticalsciences.第17版mackpub.co.)；以及blaser等人(美国公布us20110280840a1)。

在一些方面，载体可以是粒状结构，如沙或沙颗粒。在其他方面，所述载体可以是干燥的，与潮湿或湿润载体相反。在一些方面，载体可以是选自低聚果糖、菊糖、异麦芽寡糖、乳糖醇、低聚乳果糖、乳果糖、焦糊精、大豆寡糖、反式半乳寡糖、木寡糖、微量矿物质和维生素的营养物质和/或益生元物质。在一些方面，载体可呈固体或液体形式。在一些方面，载体可以是沸石、碳酸钙、碳酸镁、二氧化硅、玉米粉、海藻糖、壳聚糖、虫胶、白蛋白、淀粉、脱脂奶粉、甜乳清粉、麦芽糖糊精、乳糖以及菊糖。在一些方面，载体是水或生理盐水。

在本公开的某些方面，分离的微生物作为分离的和生物学纯的培养物存在。本领域技术人员将理解，特定微生物的分离的和生物学纯的培养物表示所述培养物基本上不含(在科学原因中)其他生物体，并且仅含有所讨论的单个微生物。所述培养物可含有不同浓度的所述微生物。本公开指出，分离的和生物学纯的微生物通常“必然不同于较不纯的或不纯的材料”。参见，例如inrebergstrom,427f.2d1394,(ccpa1970)(讨论纯化的前列腺素)，还参见inrebergy,596f.2d952(ccpa1979)(讨论纯化的微生物)，还参见parke-davis&co.v.h.k.mulford&co.,189f.95(s.d.n.y.1911)(learnedhand讨论纯化的肾上腺素，在某种程度上，部分修改，196f.496(2dcir.1912)，其各自以引用的方式并入本文。此外，在一些方面，本公开提供了必须在分离的和生物学纯的微生物培养物中发现的浓度或纯度限制的某些定量测量。在某些实施方案中，这些纯度值的存在是将目前公开的微生物与存在于天然状态的那些微生物区分开的另一属性。参见，例如,merck&co.v.olinmathiesonchemicalcorp.,253f.2d156(4thcir.1958)(讨论由微生物产生的维生素b12的纯度限制)，以引用的方式并入本文。

如本文所用，“单个分离物”应理解为在与一种或多种其他微生物分离后，主要包含微生物的单一属、种或菌株的组合物或培养物。所述短语不应指示微生物被分离或纯化的程度。然而，“单个分离物”可基本上仅包含一种微生物属、种或菌株。

如本文所用，“微生物组”是指栖息在动物的生殖道、皮肤系统、消化道或胃肠道以及微生物的物理环境中的微生物的集合(即，微生物组具有生物和物理组分)。微生物组是流体并且可通过许多天然存在和人工条件进行调节(例如，饮食改变、疾病、抗微生物剂、另外微生物的流入等)。可通过施用本公开的组合物实现的胃肠道微生物组的调节可呈现以下形式：(a)增加或减少微生物的特定科、属、种或功能分组(即，改变胃肠道微生物组的生物成分)和/或(b)提高或降低胃肠道ph、增加或减少胃肠道中的挥发性脂肪酸、增加或减少对胃肠健康重要的任何其他物理参数(即，改变肠道微生物组的非生物组分)。

如本文所用，“益生菌”是指基本上纯的微生物(即，单一分离物)或所需微生物的混合物，并且还可包括可施用至家禽以恢复微生物群的任何另外组分。本发明的益生菌或微生物接种组合物可与药剂一起施用以允许微生物在胃肠道环境中存活，即，抵抗低ph并在胃肠环境中生长。在一些实施方案中，本发明的组合物(例如，微生物组合物)在一些方面中是益生菌。

如本文所用，“益生元”是指增加一种或多种所需微生物的数量和/或活性的药剂。可用于本公开的方法中的益生元的非限制性实例包括果寡糖(例如，低聚果糖、菊糖、菊糖型果聚糖)、半乳寡糖、氨基酸、醇、异麦芽寡糖、乳糖醇、低聚乳果糖、乳果糖、焦糊精、大豆寡糖、反式半乳寡糖、木寡糖、维生素以及其混合物。参见ramirez-farias等人(2008.br.j.nutr.4:1-10)以及pool-zobel和sauer(2007.j.nutr.137:2580-2584和补充)。

如本文所用，术语“生长培养基”是适合于支持微生物生长的任何培养基。举例来说，所述培养基可以是天然的或人工的，包括胃泌素补充琼脂、lb培养基、血清和组织培养凝胶。应理解，培养基可单独使用或与一种或多种其他培养基组合使用。它也可在添加或不添加外源营养素的情况下使用。

培养基可用另外的化合物或组分进行修改或富集，例如，可帮助特定微生物群的相互作用和/或选择的组分。例如，可存在抗生素(如青霉素)或消毒剂(例如，季铵盐和氧化剂)和/或可修改物理条件(如盐度、营养素(例如有机和无机矿物质(如含磷、含氮盐、氨、钾和微量营养素如钴和镁)、ph和/或温度)。

如本文所用，术语“禽类(fowl)”和“家禽”可互换使用来包括属于鸡形目和雁形目的驯养和非驯养禽类(birds)。禽类包括鸡(肉鸡/炸鸡/烤鸡/阉鸡/公鸡/炖鸡)、火鸡、松鸡、新大陆鹌鹑、旧大陆鹌鹑、鹧鸪、雷鸟、原鸡、孔雀、鸭、鹅、天鹅、鸸鹋和鸵鸟。

如本文所用，与对照组相比，或与同所讨论特征相关的已知平均量相比，“改善”应在广义上视为涵盖改善目标特征。例如，通过比较通过本文教导的微生物处理的家禽的饲料效率与未处理的家禽的饲料效率，可证明与本公开的有益微生物或生物集合体的施加相关的“改善的”饲料效率。在本公开中，“改善的”不一定要求数据具有统计显著性(即p<0.05)；相反，表明一个值(例如平均治疗值)与另一个(例如平均控制值)不同的任何可量化的差异可上升至“改善”的水平。

如本文所用，“抑制和遏制”和类似术语不应被解释为需要完全抑制或遏制，但是在一些实施方案中这可能是期望的。

如本文所用的术语“标记”或“独特标记”是独特微生物类型、微生物菌株或微生物菌株活性的指示。标记可在生物样品中测量，并且包括但不限于基于核酸的标记，如核糖体rna基因、基于肽或蛋白质的标记和/或代谢物或其他小分子标记。

如本文所用的术语“代谢物”是代谢的中间体或产物。在一个实施方案中，代谢物是小分子。代谢物具有各种功能，包括燃料、结构、信号传导、对酶的刺激和抑制作用、作为酶的辅因子、防御以及与其他有机物(例如色素、气味剂和信息素)相互作用。初级代谢物直接涉及于正常生长、发育和繁殖中。次生代谢物不直接涉及于这些过程中，但通常具有重要生态学功能。代谢物的实例包括但不限于抗生素和色素，如树脂和萜烯等。一些抗生素使用初级代谢物作为前体，所述抗生素如从初级代谢物色氨酸产生的放线菌素。如本文所用，代谢物包括小的亲水性碳水化合物；大的疏水性脂质和复杂的天然化合物。

如本文所用，术语“基因型”是指单独细胞、细胞培养物、组织、生物体或生物体组的遗传组成。

如本文所用，术语“等位基因”是指基因的一种或多种替代形式中的任一种，所述等位基因涉及至少一种性状或特征。在二倍体细胞中，给定基因的两种等位基因占据一对同源染色体上的相应基因座。因为本公开在实施方案中涉及qtl，即可包含一个或多个基因或调控序列的基因组区域，所以在一些情况下更准确地是指“单倍型”(即染色体区段的等位基因)而不是“等位基因”，然而，在那些情况下，术语“等位基因”应理解为包括术语“单倍型”。当它们表达相似的表型时，等位基因被认为是相同的。序列差异是可能的，但不重要，只要它们不影响表型即可。

如本文所用，术语“基因座(locus)”(基因座(loci)的复数)是指染色体上的一个或多个特定位置或位点，其中例如发现基因或遗传标记。

如本文所用，术语“遗传连锁”是指在育种期间以高速率共遗传以使得它们难以通过杂交分离的两种或更多种性状。

如本文所用，“重组”或“重组事件”是指染色体交换或独立分配。术语“重组”是指具有由于重组事件而产生的新基因组成的生物体。

如本文所用，术语“分子标记”或“遗传标记”是指用于可视化核酸序列的特征差异的方法中的指示物。此类指示物的实例是限制性片段长度多态性(rflp)标记、扩增片段长度多态性(aflp)标记、单核苷酸多态性(snp)、插入突变、微卫星标记(ssr)、序列表征的扩增区域(scar)、裂解扩增的多态性序列(caps)标记或同工酶标记或本文所述标记的组合，其定义特定遗传和染色体位置。标记进一步包括编码16s或18srrna的多核苷酸序列，以及内部转录间隔区(its)序列，所述序列是在小亚基与大亚基rrna基因之间发现的序列，所述rrna基因已被证明在彼此进行比较时阐明之间的关系或区别中特别有用。等位基因附近的分子标记的定位是可由分子生物学技术的普通技术人员进行的程序。

主要rrna亚基16s的一级结构包含保守区、可变区和高变区的特定组合，所述保守区、可变区和高变区以不同的速率进化并且能够解析非常古老的谱系(如结构域)和更现代的谱系(如属)。16s亚基的二级结构包括大约50个螺旋，所述螺旋产生约67％残基的碱基配对。这些高度保守的二级结构特征具有重要的功能重要性，并且可用于确保多序列比对和系统发生分析中的位置同源性。在过去几十年中，16srrna基因已成为测序最多的分类标记，并且是细菌和古细菌的当前系统分类的基石(yarza等人2014.naturerev.micro.12:635-45)。

两个16srrna基因的序列同一性为94.5％或更低是不同属的有力证据，86.5％或更低是不同科的有力证据，82％或更低是不同目的有力证据，78.5％是不同类的有力证据，并且75％或更低是不同门的有力证据。对16srrna基因序列的比较分析使得能够建立分类学阈值，所述分类学阈值不仅可用于培养的微生物的分类，而且可用于许多环境序列的分类。yarza等人2014.naturerev.micro.12:635-45)。

如本文所用，术语“性状”是指特征或表型。例如，在本公开的一些实施方案的背景下；产蛋量、饲料利用效率、产生的粪便量、对肠道病原体的易感性以及死亡率的降低等。理想性状也可包括其他特征，包括但不限于：重量增加；产蛋量增加；肌肉组织增加；蛋中的维生素增加；胃肠道中脂肪酸浓度增加；和蛋体积增加；饲料利用率和消化率提高；多糖和木质素降解增加；脂肪、淀粉和蛋白质消化增加；维生素可用性增加；矿物质可用性增加；氨基酸可用性增加；胃肠道发育改善；绒毛长度和表面积增加；胃肠道中ph平衡；胃肠道中ph增加；胃肠道中ph降低；甲烷和/或一氧化二氮排放减少；粪肥生产减少；氮素利用效率提高；磷利用效率提高；对定殖鸡的病原微生物的定殖的抗性增加；肉类性质改善；死亡率降低；抗微生物剂的生产增加；病原微生物的清除增加；对感染鸡的病原微生物的定殖的抗性增加；对感染人的病原微生物的定殖的抗性增加；肠道健康改善等；其中所述增加、减少或降低是针对尚未施用本公开的组合物的动物进行比较而确定。

性状可以显性或隐性方式遗传，或以部分或不完全显性方式遗传。性状可以是单基因的(即由单个基因座决定)或多基因的(即由多于一个基因座决定)或者也可由一种或多种基因与环境的相互作用产生。

在本公开的背景下，性状还可由一种或多种禽类基因与一种或多种微生物基因的相互作用产生。

如本文所用，术语“纯合的”是指当两个相同的等位基因位于特定基因座、但是它们分别位于二倍体生物体细胞中相应的同源染色体对上时存在的遗传条件。相反，如本文所用，术语“杂合的”是指当两个不同的等位基因位于特定基因座、但是它们分别位于二倍体生物体细胞中相应的同源染色体对上时存在的遗传条件。

如本文所用，术语“表型”是指单独细胞、细胞培养物、生物体(例如，禽类)或一组生物体的可观察特征，所述特征由所述个体的基因组成(即，基因型)与环境之间的相互作用产生。

如本文所用，术语“嵌合”或“重组”在描述核酸序列或蛋白质序列时是指将至少两个异源多核苷酸或两个异源多肽连接成单个大分子或使至少一个天然核酸或蛋白质序列的一种或多种元件重排的核酸或蛋白质序列。例如，术语“重组”可指两个以另外分开的序列区段的人工组合，例如，通过化学合成或通过遗传工程化技术操纵分离的核酸片段。

如本文所用，“合成核苷酸序列”或“合成多核苷酸序列”是未已知在自然界中存在或不是天然存在的核苷酸序列。通常，当与任何其他天然存在的核苷酸序列相比时，这种合成核苷酸序列将包含至少一个核苷酸差异。

如本文使用，术语“核酸”是指聚合物形式的任何长度的核苷酸，核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或其类似物。此术语是指分子的一级结构，并且因此包括双链和单链dna以及双链和单链rna。它还包括修饰的核酸，如甲基化和/或加帽的核酸、含有修饰的碱基的核酸、主链修饰等。术语“核酸”和“核苷酸序列”可互换使用。

如本文所用，术语“基因”是指与生物学功能相关的任何dna区段。因此，基因包括但不限于编码序列和/或其表达所需的调控序列。基因还可包括例如形成其他蛋白质的识别序列的非表达的dna区段。基因可从多种来源获得，包括从目标来源克隆或从已知或预测的序列信息合成，并且可包括被设计成具有所需参数的序列。

如本文所用，术语“同源的”或“同源物”或“直向同源物”是本领域中已知的，并且是指共享共同祖先或家族成员并且基于序列同一性程度确定的相关序列。术语“同源性”、“同源的”、“基本相似的”和“基本上相应的”在本文中可互换使用。它们是指核酸片段，其中一个或多个核苷酸碱基的变化不会影响核酸片段介导基因表达或产生某种表型的能力。这些术语还指本公开的核酸片段的修饰，如一个或多个核苷酸的缺失或插入，所述缺失或插入相对于初始未修饰的片段基本上不会改变所得核酸片段的功能特性。因此了解，如本领域技术人员将理解的，本公开涵盖的不仅仅是具体的示例性序列。这些术语描述了在一种物种、亚种、品种、栽培品种或品系中发现的基因与另一物种、亚种、品种、栽培品种或品系中的相应或等效基因之间的关系。出于本公开的目的，比较了同源序列。“同源序列”或“同源物”或“直向同源物”被认为、据信或已知在功能上是相关的。功能关系可以多种方式中的任何一种来指示，包括但不限于：(a)序列同一性程度和/或(b)相同或相似的生物学功能。优选地，指示(a)和(b)两者。可使用本领域中容易获得的软件程序确定同源性，如currentprotocolsinmolecularbiology(f.m.ausubel等人,编辑,1987)增刊30,章节7.718,表7.71中论述的那些。一些比对程序是macvector(oxfordmolecularltd,oxford,u.k.)、alignplus(scientificandeducationalsoftware,pennsylvania)和alignx(vectornti,invitrogen,carlsbad,ca)。另一种比对程序是sequencher(genecodes,annarbor,michigan)，使用默认参数。

如本文所用，术语“核苷酸变化”是指例如，核苷酸取代、缺失和/或插入，如本领域中所熟知的。例如，突变包含产生沉默取代、添加或缺失的改变，但不改变所编码蛋白质的性质或活性或如何制备蛋白质。

如本文所用，术语“蛋白质修饰”是指例如，氨基酸取代、氨基酸修饰、缺失和/或插入，如本领域所熟知的。

如本文所用，术语核酸或多肽的“至少一部分”或“片段”是指具有此类序列的最小尺寸特征的部分，或全长分子的任何更大的片段，直至并包括完整长度分子。本公开的多核苷酸的片段可编码遗传调控元件的生物活性部分。遗传调控元件的生物活性部分可通过分离包含遗传调控元件的本公开的多核苷酸中的一种的一部分并评估如本文所述的活性来制备。类似地，多肽的一部分可以是4个氨基酸、5个氨基酸、6个氨基酸、7个氨基酸等，直至全长多肽。待使用的部分的长度将取决于具体的应用。可用作杂交探针的核酸的一部分可短至12个核苷酸；在一些实施方案中，它是20个核苷酸。可用作表位的多肽的一部分可短至4个氨基酸。执行全长多肽的功能的多肽的一部分通常将长于4个氨基酸。

变体多核苷酸还涵盖衍生自诱变和重组程序(如dna改组)的序列。这种dna改组的策略在本领域中是已知的。参见，例如stemmer(1994)pnas91:10747-10751；stemmer(1994)nature370:389-391；crameri等人(1997)naturebiotech.15:436-438；moore等人(1997)j.mol.biol.272:336-347；zhang等人(1997)pnas94:4504-4509；crameri等人(1998)nature391:288-291；以及美国专利号5,605,793和5,837,458。对于本文公开的多核苷酸的pcr扩增，可设计寡核苷酸引物用于pcr反应，以从从任何目标生物体中提取的cdna或基因组dna扩增相应的dna序列。用于设计pcr引物和pcr克隆的方法通常是本领域中已知的，并公开于sambrook等人(1989)molecularcloning:alaboratorymanual(第2版,coldspringharborlaboratorypress,plainview,newyork)。还参见innis等人,编辑(1990)pcrprotocols:aguidetomethodsandapplications(academicpress,newyork)；innis和gelfand,编辑(1995)pcrstrategies(academicpress,newyork)；以及innis和gelfand,编辑(1999)pcrmethodsmanual(academicpress,newyork)。已知的pcr方法包括但不限于使用配对引物、巢式引物、单一特异性引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配引物等的方法。

如本文所用的术语“引物”是指以下寡核苷酸，所述寡核苷酸能够与扩增靶标退火，从而允许dna聚合酶附着、从而当置于诱导引物延伸产物的合成的条件下(即在核苷酸和聚合剂如dna聚合酶存在下和在合适的温度和ph下)时充当dna合成的起始点。(扩增)引物优选是单链的，以获得最大扩增效率。优选地，引物是寡脱氧核糖核苷酸。引物必须足够长以在聚合剂存在下引发延伸产物的合成。引物的确切长度将取决于许多因素，包括引物的温度和组成(a/t对g/c含量)。一对双向引物由一种正向引物和一种反向引物组成，如dna扩增(如pcr扩增)领域中通常使用的。

术语“严格性”或“严格杂交条件”是指影响杂合体的稳定性的杂交条件，例如，温度、盐浓度、ph、甲酰胺浓度等。根据经验优化这些条件以使特异性结合最大化并使引物或探针与其靶核酸序列的非特异性结合最小化。如所使用的术语包括指探针或引物将与其靶序列杂交的程度将比它与其他序列杂交的程度可检测地更高(例如，至少2倍于背景)的条件。严格条件是序列依赖性的并且在不同情况下有所不同。较长的序列在较高温度下特异性杂交。通常，对于在限定离子强度和ph下的特定序列，严格条件被选择为低于热熔点(tm)约5。tm是50％的互补靶序列与完美匹配的探针或引物杂交时的温度(在限定的离子强度和ph下)。通常，严格条件将是那些：其中盐浓度小于约1.0mna+离子，通常约0.01至1.0mna+离子浓度(或其他盐)，ph为7.0至8.3，并且对于短探针或引物(例如，10至50个核苷酸)温度为至少30，并且对于长探针或引物(例如，大于50个核苷酸)温度为至少约60。严格条件还可通过添加去稳定剂如甲酰胺来实现。示例性低严格条件或“严格性降低的条件”包括在37下用30％甲酰胺、1mnacl、1％sds的缓冲溶液杂交并在40下在2×ssc中洗涤。示例性高严格条件包括在37下在50％甲酰胺、1mnacl、1％sds中杂交，并且在60下在0.1×ssc中洗涤。杂交程序在本领域中是熟知的并且由例如ausubel等人,1998和sambrook等人,2001描述。在一些实施方案中，严格条件是在45下在含有1mmna2edta、0.5％-20％(如0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％)十二烷基硫酸钠的0.25mna2hpo4缓冲液(ph7.2)中杂交，然后在55至65下在含有0.1％(w/v)十二烷基硫酸钠的5×ssc中洗涤。

如本文所用，“启动子”是指能够控制编码序列或功能rna的表达的dna序列。所述启动子序列由近端和更远端的上游元件组成，后者元件通常被称为增强子。因此，“增强子”是能够刺激启动子活性并且可以是启动子的固有元件或被插入以增强启动子的水平或组织特异性的异源元件的dna序列。启动子可整体来源于天然基因，或者可由来源于自然界中可见的不同启动子的不同元件组成，或甚至包含合成的dna片段。本领域技术人员应理解不同启动子可在不同组织或细胞类型中、或在不同发育阶段、或响应于不同环境条件来引导基因的表达。进一步认识到由于在大部分情况下调控序列的精确边界未完全限定，具有一些变化的dna片段可具有相同的启动子活性。

如本文所用，“组成型启动子”是在大多数条件下和/或在大多数发育阶段期间具有活性的启动子。在生物技术中使用的表达载体中使用组成型启动子存在若干优点，如：用于选择转基因细胞或生物体的蛋白质的高水平产生；报告蛋白或可评分标记的高水平表达，从而易于检测和定量；为调控转录系统的一部分的转录因子的高水平产生；在生物体中需要遍在活性的化合物的产生；以及在所有发育阶段所需的化合物的产生。非限制性示例性组成型启动子包括camv35s启动子、冠瘿碱启动子、遍在蛋白启动子、醇脱氢酶启动子等。

如本文所用，“非组成型启动子”是在某些条件下、在某些类型的细胞中和/或在某些发育阶段期间具有活性的启动子。例如，组织特异性、组织优选的、细胞类型特异性、细胞类型优选的诱导型启动子和在发育控制下的启动子是非组成型启动子。在发育控制下的启动子的实例包括优先在某些组织中起始转录的启动子。

如本文所用，“诱导型”或“阻抑型”启动子是在化学或环境因素控制下的启动子。可通过诱导型启动子影响转录的环境条件的实例包括厌氧条件，某些化学品，光、酸性或碱性条件的存在等。

如本文所用，“组织特异性”启动子是仅在某些组织中起始转录的启动子。与基因的组成型表达不同，组织特异性表达是基因调控的若干相互作用水平的结果。因此，在本领域中，有时优选使用来自同源或密切相关物种的启动子以在特定组织中实现转基因的有效和可靠表达。这是从在科学和专利文献两者中发现的特定组织分离的大量组织特异性启动子的主要原因之一。

如本文所用，术语“可操作地连接”是指核酸序列在单一核酸片段上的缔合以使得一者的功能受另一者调控。例如，当启动子能够调控编码序列的表达时(即，所述编码序列处于启动子的转录控制下)，所述启动子与所述编码序列可操作地连接。编码序列可以有义或反义取向可操作地连接至调控序列。在另一个实例中，本公开的互补rna区域可直接或间接地5'可操作地连接至靶mrna或3'可操作地连接至靶mrna，或可操作地连接在靶mrna内，或者第一互补区域是靶mrna的5'并且其补体是靶mrna的3'。

如本文所用，短语“重组构建体”、“表达构建体”、“嵌合构建体”、“构建体”和“重组dna构建体”在本文中可互换使用。重组构建体包含核酸片段，例如不在自然界中一起存在的调控序列和编码序列的人工组合。例如，嵌合构建体可包含源于不同来源的调控序列和编码序列或者源于相同来源但以不同于自然界中所发现的方式排列的调控序列和编码序列。这种构建体可单独使用或者可与载体结合使用。如果使用载体，则载体的选择取决于将用于转化宿主细胞的方法，这是本领域技术人员熟知的。例如，可使用质粒载体。本领域技术人员完全知道必须存在于载体上以便成功转化、选择以及繁殖包含本公开的任何分离的核酸片段的宿主细胞的遗传元件。本领域技术人员还将认识到，不同的独立转化事件将导致不同的表达水平和模式(jones等人,(1985)emboj.4:2411-2418；dealmeida等人,(1989)mol.gen.genetics218:78-86)，并且因此必须筛选多个事件以便获得展示所需表达水平和模式的细胞系。这种筛选可通过dna的dna印迹分析、mrna表达的rna印迹分析、蛋白质表达的免疫印迹分析或表型分析等来完成。载体可以是可自主复制或能够整合到宿主细胞的染色体中的质粒、病毒、噬菌体、原病毒、噬菌粒、转座子、人工染色体等。载体也可以是并非自主复制的裸rna多核苷酸、裸dna多核苷酸、由同一链内的dna和rna两者组成的多核苷酸、聚赖氨酸缀合的dna或rna、肽缀合的dna或rna、脂质体缀合的dna等。如本文所用，术语“表达”是指功能性最终产物，例如mrna或蛋白质(前体或成熟)的产生。

在一些实施方案中，所述细胞或生物体具有至少一种异源性状。如本文所用，术语“异源性状”是指通过外源dna区段、异源多核苷酸或异源核酸赋予转化的宿主细胞或转基因生物体的表型。表型的各种变化是本公开所感兴趣的，包括但不限于增加禽类的经济上重要性状的产率(例如，蛋、蛋体积、家禽重量等)等。这些结果可通过使用本公开的方法和组合物提供生物体中异源产物的表达或内源性产物的增加的表达来实现。在一些实施方案中，本公开的分离的微生物菌株进一步涵盖其突变体。在一些实施方案中，本公开进一步涵盖具有本发明公开的微生物菌株的所有鉴定特征的微生物菌株。

如本文所用，术语“mic”是指最大信息系数。mic是一种类型的非参数分析，其鉴定本公开的活性微生物菌株与至少一种测量的元数据(例如，重量的增加)之间的评分(mic评分)。此外，2016年7月22日提交的美国申请号15/217,575(在2017年1月10日作为美国专利号9,540,676发布)特此以引用的方式整体并入。

然后计算菌株与元数据之间以及菌株之间的最大信息系数(mic)，如图2，2009中所示。合并结果以创建所有关系及其相应mic评分的列表。如果关系评分低于给定阈值，则所述关系被视为/鉴定为不相关。如果所述关系高于给定阈值，则所述关系被视为/鉴定为相关，并且进一步进行网络分析。根据一个实施方案，以下代码片段示出用于这种分析的示例性方法：

读取关系文件的总列表作为链接

在一些实施方案中，本公开的组合物包含一种或多种细菌和/或一种或多种真菌，所述细菌和/或真菌具有至少约0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9或0.95的mic评分。

关于mic评分，基于此评分的截断值可用于定义关于特定性状的改善的有用和无用微生物。曲线上的数据点从对数标度过渡至线性标度(关于斜率)的点是拐点。具有低于拐点的mic评分的生物体通常是无用的，而具有在拐点以上发现的mic评分的生物体通常是有用的，因为它涉及针对mic评分评价的特定特征。

基于网络分析的输出，选择活性菌株用于制备含有所选菌株的产物(例如，集合、聚集体和/或其他合成分组)。网络分析的输出也可用于通知用于进一步产物组成测试的菌株的选择，如在图2，2010中所观察到。

上文论述了阈值的使用以用于分析和确定。阈值可取决于实现和应用：(1)根据经验确定(例如，基于分布水平，将截断值设置为删除指定或重要部分的低水平读数的数字)；(2)任何非零值；(3)基于百分比/百分位数；(4)只有标准化的第二标记(即活性)读数大于标准化的第一标记(细胞计数)读数的菌株；(5)活性和数量或细胞计数之间的log2倍数变化；(6)标准化的第二标记(活性)读数大于整个样品(和/或样品集)的平均第二标记(活性)读数；和/或除了统计阈值(即，显著性测试)之外的任何上述幅度阈值。根据一个实施方案，以下实施例提供关于基于dna的第一标记测量的基于rna的第二标记测量的分布的阈值细节。

如本文所用，“储存稳定”是指由根据本公开配制的微生物获得的功能属性和新用途，其使所述微生物能够在胃肠道中的其天然环境之外以有用/活跃状态存在(即显著不同的特征)。因此，储存稳定是通过本公开的制剂/组合物产生并且表示配制成储存稳定的组合物的微生物可存在于胃肠道外和环境条件下持续可根据使用的具体制剂确定的一段时间的功能属性，但通常是指微生物可被配制成在环境条件下稳定至少几天且通常至少一周的组合物中存在的微生物。因此，“储存稳定的家禽补充剂”是包含本公开的一种或多种微生物的组合物，所述微生物在组合物中配制，以使得所述组合物在环境条件下稳定至少一周，从而意味着当施用时包含在所述组合物中的微生物(例如，全细胞、孢子或裂解细胞)能够赋予家禽一种或多种有益的表型特性(例如增加的体重增加、增加的蛋壳密度、改善的胃肠健康和/或胃肠道微生物组的调节)。

在各方面，前述微生物物种—即，包含具有16s核酸序列的细菌和/或具有its核酸序列的真菌的纯化的微生物群体，所述核酸序列与选自由以下组成的组的核酸序列至少约97％相同：seqidno:1-387—是markush组的成员，因为本公开说明，所述成员属于一类特征在于各种物理和功能属性的微生物，其可包括以下中的任一种：a)将碳源转化成诸如乙酸酯、丁酸酯、丙酸酯或其组合物的挥发性脂肪酸的能力；b)使可溶性或不溶性碳源降解的能力；c)向施用所述微生物的家禽赋予重量增加增加的能力；d)调节施用所述微生物的家禽的胃肠道的微生物组的能力；e)被配制成储存稳定的组合物的能力；f)在已经施用所述微生物的家禽中表现出饲料转化率降低的能力；g)赋予胃肠道中病原体相关的病变形成减少的能力；h)赋予胃肠道中病原微生物减少的能力；和/或i)在细菌的情况下具有至少约0.2的mic评分，并且在真菌的情况下具有至少约0.2的mic评分。因此，markush组的成员具有至少一种共同的性质，所述性质可负责其在所要求的关系中的功能。

在一些实施方案中，本公开的分离的微生物菌株还包括其突变体。在一些实施方案中，本公开进一步涵盖具有本发明公开的微生物菌株的所有鉴定特征的微生物菌株。

分离的微生物

在一些方面，本公开提供了分离的微生物，包括在表1和表3中呈现的新的微生物菌株。

在其他方面，本公开提供了在表1和表3中鉴定的微生物的分离的完整微生物培养物。这些培养物可包含各种浓度的微生物。

在一些方面，本公开提供了利用选自表1和表3的一种或多种微生物来增加家禽中的目标表型性状。

在一些实施方案中，本公开提供属于以下分类科的分离的微生物物种：乳杆菌科、毛螺菌科、瘤胃菌科、消化链球菌科、链孢囊菌科、明串珠菌科、微杆菌科、小单孢菌科、梭菌科、假单胞菌科、链球菌科、芽胞杆菌科、拟杆菌科、丛赤壳科、棒状杆菌科、红杆菌科以及肉座菌科。

在其他实施方案中，分离的微生物物种可选自乳杆菌科的属，包括乳酸菌属、片球菌属、副乳杆菌属以及夏普氏菌属。

在其他实施方案中，分离的微生物物种可选自毛螺菌科的属，包括丁酸弧菌属、罗氏菌属、毛螺菌属、醋肠菌属、粪球菌属、约翰森氏菌属、卡托菌属、假丁酸弧菌属、互营球菌属、sporobacterium、副生孢杆菌属、毛形杆菌属、shuttleworthia、dorea、厌氧菌属、赫斯佩尔氏菌属、marvinbryantia、oribacterium、毛利氏菌属、布劳特菌属、robinsoniella、解纤维梭菌属、毛绒厌氧杆菌属、口腔杆菌属、fusicatenibacter、产醋菌属以及eisenbergiella。

在其他实施方案中，分离的微生物物种可选自瘤胃菌科的属，包括瘤胃球菌属、醋弧菌属、孢杆菌属、anaerofilium、乳头杆菌属、颤螺菌属、吉米菌属、栖粪杆菌、fastidiosipila、厌氧棍状菌属、产乙醇杆菌属、厌氧醋菌属、罕见小球菌属、产氢厌氧杆菌属以及candidadussoleaferrea。

在其他实施方案中，分离的微生物物种可选自消化链球菌科的属，包括anaerosphaera、产线菌属、消化链球菌属、生孢产醋杆状菌以及温暖杆菌属。

在其他实施方案中，分离的微生物物种可选自链孢囊菌科的属，包括顶果孢菌属、草孢菌属、小双孢菌属、小四孢菌属、野野村菌属、游动双孢菌属、游动单孢菌属、游动四孢菌属、球孢囊菌属、链孢子囊菌属、thermoactinospora、thermocatellispora以及热多孢菌属。

在其他实施方案中，分离的微生物物种可选自明串珠菌科的属，包括嗜果糖乳酸细菌属、明串珠菌属、酒球菌属以及魏斯氏菌属。

在其他实施方案中，分离的微生物物种可选自微杆菌科的属，包括阿格雷氏菌属、土壤球菌属、壤霉菌属、alpinomonas、amnibacterium、金杆菌属、chryseoglobus、棒形杆菌属、compostimonas、喜冷杆菌属、短小杆菌属、二氨基丁酸弧菌属、寒冷杆菌属、叶居菌属、glacibacter、gryllotalpicola、喜珍品杆菌属、草药菌属、homoserinimonas、潮湿杆菌属、克鲁格氏菌属、拉贝达氏菌属、利夫森氏菌属、白色杆菌属、lysinimonas、marisediminicola、微杆菌属、微胞菌属、小土居菌属、栖霉菌属、奥卡河杆菌属、海藻菌属、植物杆菌属、pontimonas、假棒形杆菌属、拉塞氏杆菌属、赤球菌属、盐地杆菌属、schumanella、栖地下菌属、朴勇河氏菌属以及齐默曼氏菌属。

在其他实施方案中，分离的微生物物种可选自小单孢菌科的属，包括放线金孢菌属、放线短链孢菌属、游动放线菌属、异短链球孢菌属、无定形孢囊菌属、瓶孢囊菌属、阿萨诺氏菌属、短链球孢囊菌、短链游动菌属、库奇游动菌属、指孢囊菌属、哈马达菌属、继生菌属、克拉西里尼克科氏菌属、长孢菌属、卢德曼氏菌属、小单孢菌属、植物栖居菌属、phytomonospora、发仙菌属、游动多孢菌属、游动孢囊菌属、植物生孢放线菌属、多形态孢菌属、假孢囊菌属、皱纹单孢菌属、盐孢菌属、游动螺旋菌属、疣孢菌属、杆状孢囊菌属以及xiangella。

在其他实施方案中，分离的微生物物种可选自梭菌科的属，包括厌氧醋菌属、醋弧菌属、氨基酸杆菌属、嗜碱菌属、厌氧杆菌属、厌氧菌属、厌氧棍状菌属、无氧碱菌属、布莱恩特氏菌属、丁酸菌属、caldanaerocella、喜热菌属、喜热厌氧菌属、caminicella、分节丝状菌、梭菌属、粪芽孢菌属、产乙醇杆菌、栖粪杆菌、garciella、科古根海姆艾拉菌属、赫斯佩尔氏菌属、linmingia、natronincola、产醋杆菌属、副生孢杆菌属、八叠球菌属、soehngenia、孢杆菌属、罕见小球菌属、温暖杆菌属、tepidimicrobium、栖热分枝菌属、热嗜盐杆菌数以及丁达尔氏菌属。

在其他实施方案中，分离的微生物物种可选自假单胞菌科的属，包括气单胞菌属、固氮丝菌属、嗜氮根瘤菌属、固氮菌属、金色单胞菌属、黄单胞菌属、中嗜杆菌属、二叠纪杆菌属、假单胞菌属、根瘤杆菌属、皱纹单胞菌属、蛇形菌属和硫假单胞菌属。

在其他实施方案中，分离的微生物物种可选自丛赤壳科的属，包括白壳菌属、allonectella、赤壳菌属、calostilbe、calostilbella、campylocarpon、corallomycetella、赤壳属、柱孢属、小帚梗柱孢属、柱枝双孢霉属、镰孢菌属、色粘座菌属、赤霉菌属、glionectria、血赤壳属、弯毛壳属、苍白壳属、丛赤壳属、necticladiella、新赤壳属、新丛赤壳属、蛇孢赤壳属、砖隔孢赤霉属、假赤壳属、rubrinectria、stalagmites、瘤座霉属、viridispora、xenocalonectria、xenonectriella和zythiostroma。

在一些实施方案中，本公开提供了属于以下的属的分离的微生物物种：肉座菌科，包括aphysiostroma、葡枝霉属、粘帚霉属、肉座菌属、类肉座菌属、菌寄生属、疣孢霉属、丛赤壳属、肉棒菌属、原肉座菌属、rogersonia、sarawakus、黄瘤孢属、泥炭藓属、sporophagomyces、冠抱属和木霉属。

在一些实施方案中，来自本文公开的分类群的一种或多种微生物用于赋予家禽生产一种或多种有益特性或改善的性状。

此外，本公开涉及具有与在表1和/或表3中鉴定的微生物的特征基本上相似的特征的微生物。

在本公开中鉴定的分离的微生物物种和所述物种的新型菌株能够赋予家禽生产有益的特性或性状。

例如，在表1和表3中描述的分离的微生物或所述微生物的生物集合体能够提高饲料效率。所述提高可例如通过测量所述微生物施加对饲料效率的调节的影响而定量地测量。在一些实施方案中，饲料效率由饲料转化率表示，其通过测量每磅消耗的饲料所产生的所需动物产量来计算。关于家禽，所希望的产量通常是每磅消耗的饲料所产生的肉磅数。

在一些实施方案中，分离的微生物菌株是已经遗传修饰的本公开的微生物。在一些实施方案中，遗传修饰的或重组的微生物包含在所述微生物中不天然存在的多核苷酸序列。在一些实施方案中，所述微生物可包含异源多核苷酸。在其他实施方案中，所述异源多核苷酸可与所述微生物原生的一种或多种多核苷酸可操作地连接。在一些实施方案中，本公开的分离的微生物菌株还包括其突变体。在一些实施方案中，本公开进一步涵盖具有本发明公开的微生物菌株的所有鉴定特征的微生物菌株。

在一些实施方案中，所述异源多核苷酸可以是报告基因或选择标记。在一些实施方案中，报告基因可选自荧光蛋白家族中的任一种(例如，gfp、rfp、yfp等)、β-半乳糖苷酶、荧光素酶。在一些实施方案中，选择标记可选自新霉素磷酸转移酶、潮霉素磷酸转移酶、氨基糖苷腺苷酰转移酶、二氢叶酸还原酶、乙酰乳酸合酶、溴苯腈腈水解酶、β-葡萄糖醛酸苷酶、二氢叶酸还原酶以及氯霉素乙酰转移酶。在一些实施方案中，所述异源多核苷酸可与一个或多个启动子可操作地连接。

在一些实施方案中，所述分离的微生物菌株表达选自纤维素酶(内纤维素酶、外纤维素酶、葡糖苷酶)、果胶酶、淀粉酶、支链淀粉酶、木质素酶和植酸酶的转基因或天然酶。

在一些实施方案中，提供于表4中的分类群的物种未知已经用于组合物中用于施用至动物。

表4：未知已用于动物农业中的本公开的分类群(主要是属)。

微生物生物集合体

在一些方面，本公开提供了微生物生物集合体，所述微生物生物集合体包含选自在表1和表3中鉴定的微生物之中的至少任何两种微生物的组合。

在某些实施方案中，本公开的生物集合体包含两种微生物、或三种微生物、或四种微生物、或五种微生物、或六种微生物、或七种微生物、或八种微生物、或九种微生物、或十种或更多种微生物。生物集合体的所述微生物是不同的微生物物种，或微生物物种的不同菌株。

在一些实施方案中，本公开提供了生物集合体，所述生物集合体包含：属于以下属的至少一种或至少两种分离的微生物物种：乳杆菌属、梭菌属、栖粪杆菌、产氢厌氧杆菌属、顶果孢菌属、芽孢杆菌属、罕见小球菌属、明串珠菌属、毛螺菌科、厌氧细杆菌属、微杆菌属、疣孢菌属、厌氧细杆菌属、布劳特菌属、假单胞菌属、孢杆菌属、棒状杆菌属、链球菌属、副球菌属、解纤维梭菌属、瘤胃球菌属、罗斯氏菌属、拟杆菌属、线黑粉菌属、赤霉菌属、alatospora、毕赤酵母属以及念珠菌属。可在表1和表3中找到这些上述属的物种的特定新型菌株。

在一些实施方案中，本公开提供了生物集合体，所述生物集合体包含：属于以下科的至少一种或至少两种分离的微生物物种：乳杆菌科、毛螺菌科、瘤胃菌科、消化链球菌科、链孢囊菌科、明串珠菌科、微杆菌科、小单孢菌科、梭菌科、假单胞菌目、丛赤壳科以及肉座菌科；其中毛螺菌科可进一步对梭菌属xiva簇和xivb簇具有特异性；并且其中消化链球菌科可进一步对梭菌属xi簇具有特异性。可在表1和表3中找到这些上述属的物种的特定新型菌株。

在特定方面，本公开提供了微生物生物集合体，所述微生物生物集合体包含如在表5-11中分组的物种。关于表5-11，字母a至i表示本公开的微生物的非限制性选择，其被定义为：

a＝在表1中鉴定的菌株名称ascusbbr_578；

b＝在表1中鉴定的菌株名称ascusbbr_1436；

c＝在表1中鉴定的菌株名称ascusbbr_33b；

d＝在表1中鉴定的菌株名称ascusbbr_409；

e＝在表1中鉴定的菌株名称ascusbbr_185064；

f＝在表1中鉴定的菌株名称ascusbbr_5796；

g＝在表1中鉴定的菌株名称ascusbbr_105932；

h＝在表1中鉴定的菌株名称ascusbbr_4729；和

i＝在表1中鉴定的菌株名称ascusbbr_2676。

表5：八和九菌株生物集合体

表6：七菌株生物集合体

表7：六菌株生物集合体

表8：五菌株生物集合体

表9：四菌株生物集合体

表10：三菌株生物集合体

表11：两菌株生物集合体

在一些实施方案中，所述微生物生物集合体可选自来自表5-11的任何成员组。

分离的微生物-源材料

除了其他地方之外，本公开的微生物在美国的各种场所从家禽的胃肠道获得。

分离的微生物-微生物培养技术

表1和表3的微生物通过利用16srrna序列的核糖体数据库项目(rdp)的分类工具和itsrrna序列的用户友好的nordicits外生菌根(unite)数据库来与它们最近的分类群进行匹配。将微生物与它们最近的分类群匹配的实例可见于lan等人(2012.plosone.7(3):e32491)；schloss和westcott(2011.appl.environ.microbiol.77(10):3219-3226)；以及koljalg等人(2005.newphytologist.166(3):1063-1068)。

可使用标准微生物技术实现本公开的微生物的分离、鉴定和培养。此类技术的实例可在gerhardt,p.(编辑)methodsforgeneralandmolecularmicrobiology.美国微生物学会,washington,d.c.(1994)和lennette,e.h.(编辑)manualofclinicalmicrobiology,第三版美国微生物学会,washington,d.c.(1980)，其各自以引用的方式并入。

分离可通过在固体培养基(例如，营养琼脂平板)上对标本进行划线以获得单个菌落(其通过上文描述的表型性状(例如，革兰氏阳性/阴性，能够在有氧/厌氧条件下形成孢子，细胞形态，碳源代谢，酸/碱产生，酶分泌，代谢分泌等))并降低与已经变得污染的培养物一起使用的可能性来实现。

例如，对于本公开的微生物，可通过生物样品的重复继代培养来获得生物学上纯的分离物，每次继代培养、随后划线到固体培养基上以获得单独菌落或菌落形成单位。制备、解冻和生长冻干细菌的方法是公知的，例如，gherna,r.l.和c.a.reddy.2007.culturepreservation,第1019-1033页.于c.a.reddy,t.j.beveridge,j.a.breznak,g.a.marzluf,t.m.schmidt,和l.r.snyder,编辑.美国微生物学会,washington,d.c.,第1033页；以引用的并入本文。因此，在-70下长期储存在含有甘油的溶液中的冷冻干燥的液体制剂和培养物预期用于提供本公开的制剂。

本公开的微生物可在有氧条件下或者可替代地厌氧条件下在液体培养基中繁殖。用于生长本公开的细菌菌株的培养基包括碳源、氮源和无机盐，以及特别需要的物质如维生素、氨基酸、核酸等。可用于生长微生物的合适碳源的实例包括但不限于淀粉、蛋白胨、酵母提取物、氨基酸、糖类如葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡糖胺、麦芽糖等；有机酸如乙酸、富马酸、己二酸、丙酸、柠檬酸、葡萄糖酸、苹果酸、丙酮酸、丙二酸等的盐；醇类如乙醇和甘油等；油或脂肪如豆油、米糠油、橄榄油、玉米油、芝麻油。添加的碳源的量根据碳源的种类而变化，并且通常在每升培养基1至100克之间。优选地，葡萄糖、淀粉和/或蛋白胨包含于培养基中作为主要碳源，浓度为0.1％-5％(w/v)。可用于生长本公开的细菌菌株的合适氮源的实例包括但不限于氨基酸、酵母提取物、胰蛋白胨、牛肉提取物、蛋白胨、硝酸钾、硝酸铵、氯化铵、硫酸铵、磷酸铵、氨或其组合。氮源的量根据氮源的类型而变化，通常在每升培养基0.1至30克之间。无机盐磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、硫酸镁、氯化镁、硫酸铁、硫酸亚铁、氯化铁、氯化亚铁、硫酸锰、氯化锰、硫酸锌、氯化锌、硫酸铜、氯化钙、氯化钠、碳酸钙、碳酸钠可单独使用或组合使用。无机酸的量根据无机盐的种类而变化，通常在每升培养基0.001至10克之间。特别需要的物质的实例包括但不限于维生素、核酸、酵母提取物、蛋白胨、肉提取物、麦芽提取物、干酵母以及其组合。培养可在允许微生物菌株生长的温度下进行基本上在20与46之间。在一些方面中，温度范围是30-39。为了最佳生长，在一些实施方案中，可将培养基调节至ph6.0-7.4。应理解，可商购的培养基也可用于培养微生物菌株，如来自difco,detroit,mi的营养肉汤或营养琼脂。应理解，培养时间可根据所使用的培养基的类型和作为主要碳源的糖的浓度而不同。

在一些方面中，培养持续24-96小时之间。由此获得的微生物细胞使用本领域中熟知的方法来分离。实例包括但不限于膜过滤和离心分离。可使用氢氧化钠等调节ph，并且可使用冷冻干燥器来干燥培养物，直到水含量等于4％或更低。可通过繁殖如上文所述的每种菌株来获得微生物共培养物。在一些方面中，可通过繁殖上文描述的两种或更多种菌株来获得微生物多菌株培养物。应理解，当可采用相容的培养条件时，所述微生物菌株可一起培养。

分离的微生物-微生物菌株

可将微生物区分为基于多相分类的属，其将所有可用的表型和基因型数据合并到共有分类中(vandamme等人1996.polyphasictaxonomy,aconsensusapproachtobacterialsystematics.microbiolrev1996,60:407-438)。一种可接受的用于定义物种的基因型方法是基于总体基因组相关性，以使得在标准条件下在5或更低δtm(同源杂合体与异源杂合体之间的解链温度的差异)情况下使用dna-dna杂交共享大约70％或更高相关性的菌株被认为是同一物种的成员。因此，共享大于上述70％阈值的群体可被认为是相同物种的变体。用于定义物种的另一种可接受的基因型方法是分离本公开的标记基因，对这些基因进行测序，并比对来自多种分离物或变体的这些测序的基因。如果一种或多种测序的基因共享至少97％的序列同一性，则所述微生物被解释为属于同一物种。

16s或18srrna序列或its序列通常用于区分物种和菌株，因为如果上述序列之一与参考序列共享少于指定％序列同一性，则自其获得所述序列的两种生物体据称属于物种或菌株。

因此，如果微生物在16s或18srrna序列或its1或its2序列内共享至少94.5％、95％、97％、98％或99％序列同一性，则可认为所述微生物属于同一物种。

此外，可定义物种的微生物菌株，如在16s或18srrna序列或its1或its2序列内共享至少94.5％、95％、97％、98％或99％序列同一性的那些。

本公开的序列标识符由seqidno:1-387组成。seqidno:1-50和59-387是编码16srrna的细菌多核苷酸序列。seqidno:51-58是编码its序列的真菌多核苷酸序列。

在一个实施方案中，本公开的微生物菌株包括包含与seqidno:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、39、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386以及387中的任一个共享至少70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多核苷酸序列的那些。在另一实施方案中，本公开的微生物菌株包括包含与seqidno:1-387中的任一个共享至少70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多核苷酸序列的那些。

还可针对参考序列与23srrna序列进行比较。

在不存在表型确定的情况下，不可培养的微生物通常不能被分配至确定的物种，所述微生物可被给予属内的暂定种名称，条件是它们的16s或18srrna序列或its序列符合已知物种的同一性原则。

一种方法是观察序列空间中大量密切相关物种的菌株的分布，并鉴定从其他簇中良好解析的菌株的簇。这种方法已经通过使用多个核心(管家)基因的级联序列来评估聚类模式而开发，并已被称为多基因座序列分析(mlsa)或多基因座序列系统发生分析。mlsa已经成功地用于通过当前分类学方法探索分配给非常密切相关的物种的大量菌株中的聚类模式，以查看属内、或更广泛的分类群内的少数菌株之间的关系，并解决具体的分类学问题。更一般地说，所述方法可用于询问是否存在细菌物种-即观察大的相似菌株群体是否总是落入良好解析的簇中，或者在一些情况下是否存在未观察到明确分离成簇的遗传连续体。

为了更准确地确定属，确定表型性状如形态学、生物化学和生理学特征以与参考属原型进行比较。菌落形态可包括颜色、形状、色素沉着、粘液的产生等。细胞的特征关于形状、大小、革兰氏反应、细胞外物质、内生孢子的存在、鞭毛存在和位置、运动性和包涵体进行描述。生物化学和生理学特征描述了生物体在不同温度、ph、盐度和大气条件范围内的生长，在不同的唯一碳源和氮源存在下的生长。关于定义本公开的属的表型性状，本领域普通技术人员将合理地了解。

在一个实施方案中，利用16srrna基因序列和its序列来鉴定本文教导的微生物。本领域中已知16srrna含有高变区，所述高变区可提供可用于细菌鉴定的物种/菌株特异性特征序列，并且its序列也可提供可用于真菌鉴定的物种/菌株特异性特征序列。

使用rrna基因和/或its序列的系统发生分析用于定义属于共同属的“基本上相似”的物种，并且也用于定义给定分类学物种的“基本上相似”的菌株。此外，可利用分离物的生理学和/或生物化学性质来突出菌株之间的可产生家禽中的有利行为的微小和显著差异。

本公开的组合物可包括真菌孢子和细菌孢子、真菌孢子和细菌营养细胞、真菌营养细胞和细菌孢子、真菌营养细胞和细菌营养细胞、真菌营养细胞和真菌孢子以及细菌营养细胞和细菌孢子的组合。在一些实施方案中，本公开的组合物仅包含呈孢子形式的细菌。在一些实施方案中，本公开的组合物仅包含呈营养细胞形式的细菌。在一些实施方案中，本公开的组合物仅包含呈孢子形式的真菌。在一些实施方案中，本公开的组合物仅包含呈营养细胞形式的真菌。在一些实施方案中，本公开的组合物包含真菌不存在下的细菌。在一些实施方案中，本公开的组合物包含细菌不存在下的真菌。在一些实施方案中，本公开的组合物包含vbnc细菌和/或真菌。在一些实施方案中，本公开的组合物包括休眠细菌和/或真菌。

细菌孢子可包括内生孢子和厚壁孢子。真菌孢子可包括稳孢子、掷孢子、似亲孢子、不动孢子、游动孢子、有丝分裂孢子、大孢子、小孢子、减数孢子、厚垣孢子、夏孢子、冬孢子、卵孢子、果孢子、四分孢子、孢囊孢子、接合孢子、担子孢子、子囊孢子以及子囊孢子(asciospore)。

在一些实施方案中，所述组合物的孢子在施用至本公开的动物时萌发。在一些实施方案中，所述组合物的孢子仅在施用至本公开的动物时萌发。

微生物组合物

在一些实施方案中，将本公开的微生物组合成微生物组合物。

在一些实施方案中，所述微生物组合物包含家禽饲料，如谷物(大麦、玉米、燕麦等)；淀粉(木薯等)；油籽饼；以及蔬菜废物。在一些实施方案中，所述微生物组合物包含维生素、矿物质、微量元素、乳化剂、芳香产品、粘合剂、着色剂、增味剂、增稠剂等。在一些实施方案中，所述微生物组合物包含以下中的一种或多种：离子载体；疫苗；抗生素；驱虫药；杀病毒剂；杀线虫剂；氨基酸，如甲硫氨酸、甘氨酸和精氨酸；鱼油；牛至；益生元；以及生物活性分子，如酶。

在一些实施方案中，本公开的微生物组合物是固体。在使用固体组合物的情况下，可能需要包含一种或多种载体材料，包括但不限于：矿物土，如二氧化硅、滑石、高岭土、石灰石、白垩、粘土、白云石、硅藻土；硫酸钙；硫酸镁；氧化镁；沸石；碳酸钙；碳酸镁；海藻糖；壳聚糖；虫胶；白蛋白；淀粉；脱脂奶粉；甜乳清粉；麦芽糊精；乳糖；菊糖；葡萄糖；植物来源的产品，如谷粉、树皮粉、木粉和坚果壳粉；包含典型家禽食品，如玉米粉、大麦、燕麦等的产品。

在一些实施方案中，本公开的微生物组合物是液体。在其他实施方案中，液体包含可包括水或醇或盐水或碳水化合物溶液的溶剂，以及其他动物安全的溶剂。在一些实施方案中，本公开的微生物组合物包括粘合剂，如动物安全的聚合物、羧甲基纤维素、淀粉、聚乙烯醇等。

在一些实施方案中，本公开的微生物组合物包含增稠剂或胶凝剂，如二氧化硅、粘土、种子或海草的天然提取物、纤维素的合成衍生物、瓜尔胶、刺槐豆胶、藻酸盐和甲基纤维素。在一些实施方案中，所述微生物组合物包含防沉剂，如改性淀粉、聚乙烯醇、黄原胶等。

在一些实施方案中，本公开的微生物组合物包含着色剂，包括被分类为以下的有机发色团：亚硝基；硝基；偶氮，包括单偶氮、双偶氮和多偶氮；吖啶、蒽醌、吖嗪、二苯基甲烷、吲达胺、靛酚、次甲基、噁嗪、酞菁、噻嗪、噻唑、三芳基甲烷、呫吨。在一些实施方案中，本公开的微生物组合物包含微量营养素，如铁、锰、硼、铜、钴、钼和锌的盐。在一些实施方案中，所述微生物组合物包含天然和人造染料。在一些实施方案中，染料是绿色的。在一些实施方案中，染料是红色的。

在一些实施方案中，本公开的微生物组合物包含动物安全的杀病毒剂、杀菌剂或杀线虫剂。

在一些实施方案中，本公开的微生物组合物包含糖类(例如，单糖、二糖、三糖、多糖、寡糖等)、聚合糖、脂质、聚合脂质、脂多糖、蛋白质、聚合蛋白质、脂蛋白、核酸、核酸聚合物、二氧化硅、无机盐以及其组合。在另一实施方案中，微生物组合物包含琼脂、琼脂糖、gelrite和结冷胶等的聚合物。在一些实施方案中，微生物组合物包含塑料胶囊、乳液(例如，水和油)、膜和人造膜。在一些实施方案中，乳液或连接的聚合物溶液可包含本公开的微生物组合物。参见harel和bennett(美国专利号8,460,726b2)。在一个实施方案中，所述微生物组合物包含葡萄糖。在一个实施方案中，所述微生物组合物的制剂包含葡萄糖。

在一些实施方案中，本公开的微生物组合物包含一种或多种氧清除剂、脱氯剂、硝化剂、重金属螯合剂和/或脱氯剂；以及其组合。在一个实施方案中，一旦所述微生物组合物与食物和/或水混合以施用至家禽，所述一种或多种氧清除剂、脱氯剂、硝化剂、重金属螯合剂和/或脱氯剂就不具有化学活性。在一个实施方案中，当施用至家禽时，所述一种或多种氧清除剂、脱氯剂、硝化剂、重金属螯合剂和/或脱氯剂不具有化学活性。

在一些实施方案中，本公开的微生物组合物以固体形式(例如，分散的冻干孢子)或液体形式(散布在储存介质中的微生物)出现。在一些实施方案中，本公开的微生物组合物以干燥形式添加至液体以在施用前立即形成悬浮液。

在一些实施方案中，本公开的微生物组合物包含一种或多种防腐剂。防腐剂可呈液体或气体制剂。防腐剂可选自以下中的一种或多种：单糖、二糖、三糖、多糖、乙酸、抗坏血酸、抗坏血酸钙、异抗坏血酸(erythorbicacid)、异抗坏血酸(iso-ascorbicacid)、赤藻糖酸、硝酸钾、抗坏血酸钠、异抗坏血酸钠、异抗坏血酸钠、硝酸钠、亚硝酸钠、氮、苯甲酸、山梨酸钙、月桂酰基精氨酸乙酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸甲酯、乙酸钾、苯甲酸钾、亚硫酸氢钾、二乙酸钾、乳酸钾、焦亚硫酸钾、山梨酸钾、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丙酯、乙酸钠、苯甲酸钠、亚硫酸氢钠、亚硝酸钠、二乙酸钠、乳酸钠、焦亚硫酸钠、甲基-对羟基苯甲酸的钠盐、丙基-对羟基苯甲酸的钠盐、硫酸钠、亚硫酸钠、连二亚硫酸钠、亚硫酸、丙酸钙、二碳酸二甲酯、游霉素、山梨酸钾、亚硫酸氢钾、焦亚硫酸钾、丙酸、二乙酸钠、丙酸钠、山梨酸钠、山梨酸、抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、抗坏血酸硬脂酸酯、丁基化羟基苯甲醚、丁基化羟基甲苯(bht)、丁基羟基茴香醚(bha)、柠檬酸、甘油单酯和/或甘油二酯的柠檬酸酯、l-半胱氨酸、l-半胱氨酸盐酸盐、愈创木脂、愈创木脂、卵磷脂、柠檬酸卵磷脂、柠檬酸单甘油酯、柠檬酸单异丙酯、没食子酸丙酯、焦亚硫酸钠、酒石酸、叔丁基氢醌、氯化亚锡、硫代二丙酸、硫代二丙酸酯二月桂基、硫代二丙酸二硬脂基酯、乙氧基喹啉、二氧化硫、甲酸或生育酚。

在一些实施方案中，本公开的微生物组合物包含呈孢子形式、营养细胞形式、休眠细胞形式和/或裂解形式的细菌和/或真菌细胞。在一个实施方案中，裂解细胞形式充当霉菌毒素粘合剂，例如霉菌毒素与死细胞结合。

在一些实施方案中，所述微生物组合物在冰箱(35℉-40℉)中储存稳定持续至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60天的时间段。在一些实施方案中，所述微生物组合物在冰箱(35℉-40℉)中储存稳定持续至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60周的时间段。

在一些实施方案中，所述微生物组合物在室温(68℉-72℉)下或50℉-77℉之间储存稳定持续至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60天的时间段。在一些实施方案中，所述微生物组合物在室温(68℉-72℉)下或50℉-77℉之间储存稳定持续至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60周的时间段。

在一些实施方案中，所述微生物组合物在-23℉-35℉下储存稳定持续至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60天的时间段。在一些实施方案中，所述微生物组合物在-23℉-35℉下储存稳定持续至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60周的时间段。

在一些实施方案中，所述微生物组合物在77℉-100℉下储存稳定持续至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60天的时间段。在一些实施方案中，所述微生物组合物在77℉-100℉下储存稳定持续至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60周的时间段。

在一些实施方案中，所述微生物组合物在101℉-213℉下储存稳定持续至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60天的时间段。在一些实施方案中，所述微生物组合物在101℉-213℉下储存稳定持续至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60周的时间段。

在一些实施方案中，本公开的微生物组合物在冷藏温度(35℉-40℉)、在室温(68℉-72℉)、在50℉-77℉之间、在-23℉-35℉之间、在70℉-100℉之间或在101℉-213℉之间储存稳定持续约1至100、约1至95、约1至90、约1至85、约1至80、约1至75、约1至70、约1至65、约1至60、约1至55、约1至50、约1至45、约1至40、约1至35、约1至30、约1至25、约1至20、约1至15、约1至10、约1至5、约5至100、约5至95、约5至90、约5至85、约5至80、约5至75、约5至70、约5至65、约5至60、约5至55、约5至50、约5至45、约5至40、约5至35、约5至30、约5至25、约5至20、约5至15、约5至10、约10至100、约10至95、约10至90、约10至85、约10至80、约10至75、约10至70、约10至65、约10至60、约10至55、约10至50、约10至45、约10至40、约10至35、约10至30、约10至25、约10至20、约10至15、约15至100、约15至95、约15至90、约15至85、约15至80、约15至75、约15至70、约15至65、约15至60、约15至55、约15至50、约15至45、约15至40、约15至35、约15至30、约15至25、约15至20、约20至100、约20至95、约20至90、约20至85、约20至80、约20至75、约20至70、约20至65、约20至60、约20至55、约20至50、约20至45、约20至40、约20至35、约20至30、约20至25、约25至100、约25至95、约25至90、约25至85、约25至80、约25至75、约25至70、约25至65、约25至60、约25至55、约25至50、约25至45、约25至40、约25至35、约25至30、约30至100、约30至95、约30至90、约30至85、约30至80、约30至75、约30至70、约30至65、约30至60、约30至55、约30至50、约30至45、约30至40、约30至35、约35至100、约35至95、约35至90、约35至85、约35至80、约35至75、约35至70、约35至65、约35至60、约35至55、约35至50、约35至45、约35至40、约40至100、约40至95、约40至90、约40至85、约40至80、约40至75、约40至70、约40至65、约40至60、约40至55、约40至50、约40至45、约45至100、约45至95、约45至90、约45至85、约45至80、约45至75、约45至70、约45至65、约45至60、约45至55、约45至50、约50至100、约50至95、约50至90、约50至85、约50至80、约50至75、约50至70、约50至65、约50至60、约50至55、约55至100、约55至95、约55至90、约55至85、约55至80、约55至75、约55至70、约55至65、约55至60、约60至100、约60至95、约60至90、约60至85、约60至80、约60至75、约60至70、约60至65、约65至100、约65至95、约65至90、约65至85、约65至80、约65至75、约65至70、约70至100、约70至95、约70至90、约70至85、约70至80、约70至75、约75至100、约75至95、约75至90、约75至85、约75至80、约80至100、约80至95、约80至90、约80至85、约85至100、约85至95、约85至90、约90至100、约90至95或95至100周的时间段。

在一些实施方案中，本公开的微生物组合物在冷藏温度(35℉-40℉)、在室温(68℉-72℉)、在50℉-77℉之间、在-23℉-35℉之间、在70℉-100℉之间或在101℉-213℉之间储存稳定持续1至100、1至95、1至90、1至85、1至80、1至75、1至70、1至65、1至60、1至55、1至50、1至45、1至40、1至35、1至30、1至25、1至20、1至15、1至10、1至5、5至100、5至95、5至90、5至85、5至80、5至75、5至70、5至65、5至60、5至55、5至50、5至45、5至40、5至35、5至30、5至25、5至20、5至15、5至10、10至100、10至95、10至90、10至85、10至80、10至75、10至70、10至65、10至60、10至55、10至50、10至45、10至40、10至35、10至30、10至25、10至20、10至15、15至100、15至95、15至90、15至85、15至80、15至75、15至70、15至65、15至60、15至55、15至50、15至45、15至40、15至35、15至30、15至25、15至20、20至100、20至95、20至90、20至85、20至80、20至75、20至70、20至65、20至60、20至55、20至50、20至45、20至40、20至35、20至30、20至25、25至100、25至95、25至90、25至85、25至80、25至75、25至70、25至65、25至60、25至55、25至50、25至45、25至40、25至35、25至30、30至100、30至95、30至90、30至85、30至80、30至75、30至70、30至65、30至60、30至55、30至50、30至45、30至40、30至35、35至100、35至95、35至90、35至85、35至80、35至75、35至70、35至65、35至60、35至55、35至50、35至45、35至40、40至100、40至95、40至90、40至85、40至80、40至75、40至70、40至65、40至60、40至55、40至50、40至45、45至100、45至95、45至90、45至85、45至80、45至75、45至70、45至65、45至60、45至55、45至50、50至100、50至95、50至90、50至85、50至80、50至75、50至70、50至65、50至60、50至55、55至100、55至95、55至90、55至85、55至80、55至75、55至70、55至65、55至60、60至100、60至95、60至90、60至85、60至80、60至75、60至70、60至65、65至100、65至95、65至90、65至85、65至80、65至75、65至70、70至100、70至95、70至90、70至85、70至80、70至75、75至100、75至95、75至90、75至85、75至80、80至100、80至95、80至90、80至85、85至100、85至95、85至90、90至100、90至95或95至100周的时间段。

在一些实施方案中，本公开的微生物组合物在冷藏温度(35℉-40℉)、在室温(68℉-72℉)、在50℉-77℉之间、在-23℉-35℉之间、在70℉-100℉之间或在101℉-213℉之间储存稳定持续约1至36、约1至34、约1至32、约1至30、约1至28、约1至26、约1至24、约1至22、约1至20、约1至18、约1至16、约1至14、约1至12、约1至10、约1至8、约1至6、约1至4、约1至2、约4至36、约4至34、约4至32、约4至30、约4至28、约4至26、约4至24、约4至22、约4至20、约4至18、约4至16、约4至14、约4至12、约4至10、约4至8、约4至6、约6至36、约6至34、约6至32、约6至30、约6至28、约6至26、约6至24、约6至22、约6至20、约6至18、约6至16、约6至14、约6至12、约6至10、约6至8、约8至36、约8至34、约8至32、约8至30、约8至28、约8至26、约8至24、约8至22、约8至20、约8至18、约8至16、约8至14、约8至12、约8至10、约10至36、约10至34、约10至32、约10至30、约10至28、约10至26、约10至24、约10至22、约10至20、约10至18、约10至16、约10至14、约10至12、约12至36、约12至34、约12至32、约12至30、约12至28、约12至26、约12至24、约12至22、约12至20、约12至18、约12至16、约12至14、约14至36、约14至34、约14至32、约14至30、约14至28、约14至26、约14至24、约14至22、约14至20、约14至18、约14至16、约16至36、约16至34、约16至32、约16至30、约16至28、约16至26、约16至24、约16至22、约16至20、约16至18、约18至36、约18至34、约18至32、约18至30、约18至28、约18至26、约18至24、约18至22、约18至20、约20至36、约20至34、约20至32、约20至30、约20至28、约20至26、约20至24、约20至22、约22至36、约22至34、约22至32、约22至30、约22至28、约22至26、约22至24、约24至36、约24至34、约24至32、约24至30、约24至28、约24至26、约26至36、约26至34、约26至32、约26至30、约26至28、约28至36、约28至34、约28至32、约28至30、约30至36、约30至34、约30至32、约32至36、约32至34或约34至36个月的时间段。

在一些实施方案中，本公开的微生物组合物在冷藏温度(35℉-40℉)、在室温(68℉-72℉)、在50℉-77℉之间、在-23℉-35℉之间、在70℉-100℉之间或在101℉-213℉之间储存稳定持续1至36、1至34、1至32、1至30、1至28、1至26、1至24、1至22、1至20、1至18、1至16、1至14、1至12、1至10、1至8、1至6、1至4、1至2、4至36、4至34、4至32、4至30、4至28、4至26、4至24、4至22、4至20、4至18、4至16、4至14、4至12、4至10、4至8、4至6、6至36、6至34、6至32、6至30、6至28、6至26、6至24、6至22、6至20、6至18、6至16、6至14、6至12、6至10、6至8、8至36、8至34、8至32、8至30、8至28、8至26、8至24、8至22、8至20、8至18、8至16、8至14、8至12、8至10、10至36、10至34、10至32、10至30、10至28、10至26、10至24、10至22、10至20、10至18、10至16、10至14、10至12、12至36、12至34、12至32、12至30、12至28、12至26、12至24、12至22、12至20、12至18、12至16、12至14、14至36、14至34、14至32、14至30、14至28、14至26、14至24、14至22、14至20、14至18、14至16、16至36、16至34、16至32、16至30、16至28、16至26、16至24、16至22、16至20、16至18、18至36、18至34、18至32、18至30、18至28、18至26、18至24、18至22、18至20、20至36、20至34、20至32、20至30、20至28、20至26、20至24、20至22、22至36、22至34、22至32、22至30、22至28、22至26、22至24、24至36、24至34、24至32、24至30、24至28、24至26、26至36、26至34、26至32、26至30、26至28、28至36、28至34、28至32、28至30、30至36、30至34、30至32、32至36、32至34或约34至36的时间段。

在一些实施方案中，本公开的微生物组合物在至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％的相对湿度下在任何所公开的温度和/或温度范围和时间跨度是储存稳定的。

水分含量是组合物中水的总量的量度，通常表示为总重量的百分比。水分含量是用于确定组合物的干重的有用量度，并且可用于确认组合物的干燥(desiccation)/干燥(drying)过程是否完成。水分含量是通过将(组合物的湿重减去干燥/干燥后的重量)除以组合物的湿重并乘以100来计算。

水分含量定义组合物中水的量，但是水活度解释组合物中水将如何与微生物反应。水活度越大，微生物生长越快。通过找到组合物中的蒸气压力与纯水的蒸气压力之比来计算水活度。更具体地，水活度是组合物中水的蒸汽分压除以纯水的标准状态蒸气分压。纯蒸馏水的水活度为1。组合物的水活度的确定不是组合物中水的量，而是可供微生物使用的过量水的量。对于生长，微生物具有最小和最佳的水活度。

在一些实施方案中，本公开的微生物组合物是干燥的。如果微生物组合物的水分含量介于0％与20％之间，则将所述组合物干燥。

在一些实施方案中，本公开的微生物组合物具有约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、约30％、约31％、约32％、约33％、约34％、约35％、约36％、约37％、约38％、约39％、约40％、约41％、约42％、约43％、约44％、约45％、约46％、约47％、约48％、约49％、约50％、约51％、约52％、约53％、约54％、约55％、约56％、约57％、约58％、约59％、约60％、约61％、约62％、约63％、约64％、约65％、约66％、约67％、约68％、约69％、约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％的水分含量。

在一些实施方案中，本公开的微生物组合物具有小于0.5％、小于0.6％、小于0.7％、小于0.8％、小于0.9％、小于1％、小于2％、小于3％、小于4％、小于5％、小于6％、小于7％、小于8％、小于9％、小于10％、小于11％、小于12％、小于13％、小于14％、小于15％、小于16％、小于17％、小于18％、小于19％、小于20％、小于21％、小于22％、小于23％、小于24％、小于25％、小于26％、小于27％、小于28％、小于29％、小于30％、小于31％、小于32％、小于33％、小于34％、小于35％、小于36％、小于37％、小于38％、小于39％、小于40％、小于41％、小于42％、小于43％、小于44％、小于45％、小于46％、小于47％、小于48％、小于49％、小于50％、小于51％、小于52％、小于53％、小于54％、小于55％、小于56％、小于57％、小于58％、小于59％、小于60％、小于61％、小于62％、小于63％、小于64％、小于65％、小于66％、小于67％、小于68％、小于69％、小于70％、小于71％、小于72％、小于73％、小于74％、小于75％、小于76％、小于77％、小于78％、小于79％、小于80％、小于81％、小于82％、小于83％、小于84％、小于85％、小于86％、小于87％、小于88％、小于89％、小于90％、小于91％、小于92％、小于93％、小于94％、小于95％、小于96％、小于97％、小于98％、小于99％或小于100％的水分含量。

在一些实施方案中，本公开的微生物组合物具有小于约0.5％、小于约0.6％、小于约0.7％、小于约0.8％、小于约0.9％、小于约1％、小于约2％、小于约3％、小于约4％、小于约5％、小于约6％、小于约7％、小于约8％、小于约9％、小于约10％、小于约11％、小于约12％、小于约13％、小于约14％、小于约15％、小于约16％、小于约17％、小于约18％、小于约19％、小于约20％、小于约21％、小于约22％、小于约23％、小于约24％、小于约25％、小于约26％、小于约27％、小于约28％、小于约29％、小于约30％、小于约31％、小于约32％、小于约33％、小于约34％、小于约35％、小于约36％、小于约37％、小于约38％、小于约39％、小于约40％、小于约41％、小于约42％、小于约43％、小于约44％、小于约45％、小于约46％、小于约47％、小于约48％、小于约49％、小于约50％、小于约51％、小于约52％、小于约53％、小于约54％、小于约55％、小于约56％、小于约57％、小于约58％、小于约59％、小于约60％、小于约61％、小于约62％、小于约63％、小于约64％、小于约65％、小于约66％、小于约67％、小于约68％、小于约69％、小于约70％、小于约71％、小于约72％、小于约73％、小于约74％、小于约75％、小于约76％、小于约77％、小于约78％、小于约79％、小于约80％、小于约81％、小于约82％、小于约83％、小于约84％、小于约85％、小于约86％、小于约87％、小于约88％、小于约89％、小于约90％、小于约91％、小于约92％、小于约93％、小于约94％、小于约95％、小于约96％、小于约97％、小于约98％、小于约99％或小于约100％的水分含量。

在一些实施方案中，本公开的微生物组合物具有1％至100％、1％至95％、1％至90％、1％至85％、1％至80％、1％至75％、1％至70％、1％至65％、1％至60％、1％至55％、1％至50％、1％至45％、1％至40％、1％至35％、1％至30％、1％至25％、1％至20％、1％至15％、1％至10％、1％至5％、5％至100％、5％至95％、5％至90％、5％至85％、5％至80％、5％至75％、5％至70％、5％至65％、5％至60％、5％至55％、5％至50％、5％至45％、5％至40％、5％至35％、5％至30％、5％至25％、5％至20％、5％至15％、5％至10％、10％至100％、10％至95％、10％至90％、10％至85％、10％至80％、10％至75％、10％至70％、10％至65％、10％至60％、10％至55％、10％至50％、10％至45％、10％至40％、10％至35％、10％至30％、10％至25％、10％至20％、10％至15％、15％至100％、15％至95％、15％至90％、15％至85％、15％至80％、15％至75％、15％至70％、15％至65％、15％至60％、15％至55％、15％至50％、15％至45％、15％至40％、15％至35％、15％至30％、15％至25％、15％至20％、20％至100％、20％至95％、20％至90％、20％至85％、20％至80％、20％至75％、20％至70％、20％至65％、20％至60％、20％至55％、20％至50％、20％至45％、20％至40％、20％至35％、20％至30％、20％至25％、25％至100％、25％至95％、25％至90％、25％至85％、25％至80％、25％至75％、25％至70％、25％至65％、25％至60％、25％至55％、25％至50％、25％至45％、25％至40％、25％至35％、25％至30％、30％至100％、30％至95％、30％至90％、30％至85％、30％至80％、30％至75％、30％至70％、30％至65％、30％至60％、30％至55％、30％至50％、30％至45％、30％至40％、30％至35％、35％至100％、35％至95％、35％至90％、35％至85％、35％至80％、35％至75％、35％至70％、35％至65％、35％至60％、35％至55％、35％至50％、35％至45％、35％至40％、40％至100％、40％至95％、40％至90％、40％至85％、40％至80％、40％至75％、40％至70％、40％至65％、40％至60％、40％至55％、40％至50％、40％至45％、45％至100％、45％至95％、45％至90％、45％至85％、45％至80％、45％至75％、45％至70％、45％至65％、45％至60％、45％至55％、45％至50％、50％至100％、50％至95％、50％至90％、50％至85％、50％至80％、50％至75％、50％至70％、50％至65％、50％至60％、50％至55％、55％至100％、55％至95％、55％至90％、55％至85％、55％至80％、55％至75％、55％至70％、55％至65％、55％至60％、60％至100％、60％至95％、60％至90％、60％至85％、60％至80％、60％至75％、60％至70％、60％至65％、65％至100％、65％至95％、65％至90％、65％至85％、65％至80％、65％至75％、65％至70％、70％至100％、70％至95％、70％至90％、70％至85％、70％至80％、70％至75％、75％至100％、75％至95％、75％至90％、75％至85％、75％至80％、80％至100％、80％至95％、80％至90％、80％至85％、85％至100％、85％至95％、85％至90％、90％至100％、90％至95％或95％至100％的水分含量。

适合用于本申请中的微生物组合物公开于embree等人(pct/us2017/028015)中。

在一些实施方案中，本公开的微生物组合物具有至少0.05、至少0.075、至少0.1、至少0.1.25、至少0.15、至少0.175、至少0.2、至少0.225、至少0.25、至少0.275、至少0.3、至少0.325、至少0.35、至少0.375、至少0.4、至少0.425、至少0.45、至少0.475、至少0.5、至少0.525、至少0.55、至少0.575或至少0.6的水活度。

在一些实施方案中，本公开的微生物组合物具有小于0.05、小于0.075、小于0.1、小于0.1.25、小于0.15、小于0.175、小于0.2、小于0.225、小于0.25、小于0.275、小于0.3、小于0.325、小于0.35、小于0.375、小于0.4、小于0.425、小于0.45、小于0.475、小于0.5、小于0.525、小于0.55、小于0.575或小于0.6的水活度。

家禽

家禽包括鸡(肉鸡/炸鸡/烤鸡/阉鸡/公鸡/炖鸡)、火鸡、松鸡、新大陆鹌鹑、旧大陆鹌鹑、鹧鸪、雷鸟、原鸡、孔雀、鸭、鹅、天鹅、鸸鹋和鸵鸟。

本公开的肉鸡包括：cobb500、cobb700、cobbavian48、cobbsasso、ross308、ross708、rosspm3、jerseygiant、cornishcross、delaware、dorking、buckeye、campine、chantecler、crevecoeur、holland、moderngame、nankin、redcap、russian、orloff、spanish、sultan、sumatra、yokohama、andalusian、buttercup、cubalaya、faverolles、java、lakenvelder、langshan、malay、phoenix、ancona、aseel、brahma、catalana、cochin、cornish、dominique、hamburg、houdan、lafleche、minorca、newhampshire、oldenglishgame、polish、rhodeislandwhite、sebright、shamo、australorp、leghorn、orpington、plymouthrock、rhodeislandred、sussex、wyandotte、araucana、iowablue、lamona、manxrumpy、nakedneck、asil、kadacknathbursa、hubbard、hubbard、cobb、hubbard、lohman、anak2000、avian-34、starbra、samrat、bowans、hyline、bv-300、h&nnick、dekalblohman、ili-80、golden-92、priya、sonali、devendra、b-77、caribro-91、varna、caribronakednecked、caribromulticolored、aviagen、ross、arboracres、indianriver、peterson、cobb-vantress、aviansasso、hybro、groupegrimaud、grimaudfrere、ameraucana、silkie、marans、rosecomb、welsummer、barnevelder、bantam、asil、chantecler、croad、houdan、pekin、frizzle、serama、orloff、ac、aseel、baheij、bandara以及其杂交种。

本公开的产蛋鸡包括：ameraucana、ancona、andalusian、appenzeller、araucana、australorp、barnevelder、brahma、buckeye、buttercup、campine、catalana、chantecler、cochin、cornish、crevecoeur、cubalaya、deleware、dominique、dorking、faverolles、fayoumi、hamburg、holland、houdan、jaerhon、java、jerseygiant、lafleche、lakenvelder、lamona、langsham、leghorn、marans、minorca、nackedneck、newhampshire、orloff、orpington、penedesenca、phoenix、plymouthrock、polish、redcap、rhodeisland、spanish、sultan、sussex、welsumer、wyandotte、yokohama以及其杂交种。

虽然在肉鸡与产蛋鸡之间进行了区分，但本公开的实施方案使用肉鸡、产蛋鸡和/或多用途鸡。

在胃肠道的微生物组成方面，已经发现在商业环境中的鸡表现出高度的禽类与禽类和位置与位置之间的变异性。尽管认为现代商业孵化场的卫生状况改善可消除禽类损失，但卫生状况改善可能导致母体来源的细菌无法对小鸡/禽类进行定殖。在这些设施中，禽类的胃肠道微生物组成的变异性增加可导致禽类与禽类以及位置与位置之间的变异性增加，进而导致禽类群高度变异，但健康状况、体重和其他影响禽群的商业存活力的属性存在明显差异。单个禽群的成员之间的高度变异性、甚至位置之间的差异都影响对病原体的敏感性、体重增加以及对抗生素治疗的反应。参见stanley等人(2013.plosone.8(12):1-7；e84290)。

在一些实施方案中，在禽类的生命早期施用本公开的一种或多种微生物和/或生物集合体降低禽类之间肠道微生物组的变异性，并且进一步建立稳定的肠道微生物组。

在一些实施方案中，将肠道微生物组的变异性测量为在一个或多个位置存在于肠道中的物种的总数。在一些实施方案中，肠道微生物组的变异性被测量为在一个或多个位置肠道中存在的特定分类群的存在或不存在。在一些实施方案中，肠道微生物组的变异性被测量为在一个或多个位置肠道中存在的特定分类群的丰度差异。

在一些实施方案中，本发明的一种或多种微生物和/或生物集合体的施用减少肠道微生物组达到稳定状态所需的时间量。在一些实施方案中，本发明的一种或多种微生物和/或生物集合体的施用减少肠道微生物组达到成熟状态所需的时间量。

在一些实施方案中，本公开的一种或多种微生物和/或生物集合体的施用使得本公开的家禽达到肠道微生物组的稳定状态；肠道微生物组的变异性降低。

在一些实施方案中，当家禽的肠道微生物组含有约10、约20、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90、约100、约120、约130、约140、约150、约160、约170、约180、约190、约200、约250、约300、约400、约500、约600、约700、约800、约900、约1,000、约1,500、约2,000、约2,500、约3,000、约3,500、约4,000、约4,500、约5,000、约5,500、约6,000、约6,500、约7,000、约7,500、约8,000、约8,500、约9,000、约9,500或约10,000种不同的物种时达到肠道微生物组的稳定状态。

在一些实施方案中，当家禽的肠道微生物组含有介于约10至约50、约10至约100、约50至约100、约50至约200、约100至约150、约100至约200、约100至约400、约200至约500、约200至约700、约400至约800、约500至约1,000、约500至约2,000、约1,000至约2,000、约1,000至约5,000、约5,000至约7,000、约5,000至约10,000或约8,000至约10,000之间种不同的物种时达到肠道微生物组的稳定状态。

在一些实施方案中，围栏/禽群/孵化场中的至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的家禽在施用本公开的一种或多种微生物和/或生物集合体之后达到稳定状态。

i.竞争性排除和免疫调节

已知禽肠道病原体粘附于禽肠道的糖萼/细胞外基质中显示的多种分子的能力促成这些特定生物体/菌株的致病性。参见martin和smyth(2010.anaerobe.16:533-539)以及wade等人(2016.vet.microbiol.197:53-61)。从成年家禽传递至新孵化出的小动物的微生物有助于在脆弱阶段保护新孵化出的小动物，因为从蛋清中获得的母体抗体和抗微生物化合物(溶菌酶等)已经耗尽，并且新孵化出的小动物的免疫系统尚未完全发育。

在一些实施方案中，本公开的微生物和/或生物集合体正在产生抗微生物化合物。在一些实施方案中，所述微生物和/或生物集合体正在刺激家禽中的其他微生物以产生抗微生物化合物。在一些实施方案中，本公开的微生物和/或生物集合体正在刺激家禽的免疫系统，从而使得抗微生物化合物的产生增加。在一些实施方案中，所述抗微生物化合物在禽类的胃肠道中产生，并保持定位至胃肠道。在一些实施方案中，抗微生物化合物从胃肠道向远侧产生并定位于胃肠道。在一些实施方案中，抗微生物化合物在家禽中系统地循环。在一些方面，所述抗微生物化合物包括对一种或多种微生物具有抑制、杀孢子、杀病毒、抑菌或杀细菌作用的化学物质和化合物。在其他实施方案中，所述抗微生物化合物包括对一种或多种病原性微生物具有抑制、杀孢子、杀病毒、抑菌或杀细菌作用的化学物质和化合物。在一些实施方案中，所述抗微生物化合物如通篇所描述，并且进一步包括过氧化氢、二乙酰基、二氧化碳和细菌素(例如，尼生素、片球菌素a、片球菌素ach、leucocin、瑞士菌素j和canobacteriocin)。本文提出的抗微生物剂作为示例性抗微生物剂提出，并且不意图限制所考虑的抗微生物剂。

在一些实施方案中，施用本公开的微生物和/或生物集合体以使肠道/粘膜免疫系统与尚未施用微生物和/或生物集合体的家禽的肠道/粘膜免疫系统相比更快地成熟。就适应性免疫和先天性免疫而言，成熟的肠道/粘膜免疫系统与初始肠道/粘膜免疫系统形成对比。

在一些实施方案中，施用本公开的微生物和生物集合体以竞争性地排除微生物病原体引起家禽的疾病状态。

在一些实施方案中，本公开的微生物和生物集合体竞争性地结合肠细胞壁的糖萼/细胞外基质的分子，以阻止或竞争性地抑制病原体粘附于凝集素和其他分子，如胶原蛋白(特别是iii型、iv型和v型)、明胶、纤维蛋白原、层粘连蛋白和玻连蛋白。据信病原体粘附于这些分子促成病原体的毒力。

在一些实施方案中，本公开的微生物组合物的施用导致病原微生物与家禽胃肠道细胞的糖萼/细胞外基质的结合减少。

在一些实施方案中，本公开的微生物组合物导致所施用的微生物与糖萼/细胞外基质的结合，从而防止病原体微生物粘附至糖萼/细胞外基质并预防病原性疾病。

在一些实施方案中，本公开的微生物组合物导致通过所施用的微生物组合物对糖萼/细胞外基质的分子进行化学修饰，从而防止病原体微生物粘附至糖萼/细胞外基质并预防病原性疾病。

在一些实施方案中，由所施用的微生物结合或化学修饰的分子选自凝集素、胶原蛋白、明胶、纤维蛋白原、层粘连蛋白和玻连蛋白。

在一些实施方案中，在施用本公开的一种或多种微生物和/或生物集合体后，家禽的胃肠道表现出降低的ph。降低ph可在嗉囊、前胃、砂囊(gizzard)/胃(ventriculus)、十二指肠、小肠、盲肠、大肠或泄殖腔中发生。

在一些实施方案中，在施用本公开的微一种或多种生物和/或生物集合体后，家禽的胃肠道表现出ph降低至少0.2、至少0.4、至少0.6、至少0.8、至少1、至少1.2、至少1.4、至少1.6、至少1.8、至少2、至少2.2、至少2.4、至少2.6、至少2.8、至少3、至少3.2、至少3.4、至少3.6、至少3.8、至少4、至少4.2、至少4.4、至少4.6、至少4.8、至少5、至少5.2、至少5.4、至少5.6、至少5.8、至少6、至少6.2、至少6.4、至少6.6、至少6.8或至少7。

在一些实施方案中，家禽胃肠道中ph降低防止病原性微生物胜过家禽胃肠道中的非病原性微生物。

在一些实施方案中，将本公开的微生物组合物施用至家禽刺激b细胞的产生。在一些实施方案中，b细胞选自调控性b细胞、b-1细胞、b-2细胞、边缘区b细胞、滤泡性b细胞、记忆b细胞、浆细胞和浆母细胞。

在一些实施方案中，将本公开的微生物组合物施用至家禽使得一种或多种类型的b细胞增加至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。

在一些实施方案中，将本公开的微生物组合物施用至家禽刺激t细胞的产生。在一些实施方案中，t细胞选自γδ(γδ)t细胞、αβ(αβ)t细胞、自然杀伤t细胞、调控性t细胞、记忆t细胞、细胞毒性t细胞、辅助t细胞和效应t细胞。

在一些实施方案中，将本公开的微生物组合物施用至家禽使得一种或多种类型的t细胞增加至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。

在一些实施方案中，将本公开的微生物组合物施用至家禽使得分离的淋巴滤泡(ilf)的数量增加。

在一些实施方案中，将本公开的微生物组合物施用至家禽使得分离的淋巴滤泡增加至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。

在一些实施方案中，施用本公开的微生物组合物的产生粘蛋白、紧密连接多肽和细胞因子的基因表达的调节。在一些实施方案中，对粘蛋白、紧密连接多肽和细胞因子的基因表达的调节使得所述分子的基因表达增加。在一些实施方案中，对粘蛋白、紧密连接多肽和细胞因子的基因表达的调节使得所述分子的基因表达减少。

在一些实施方案中，所述细胞因子选自粒细胞-巨噬细胞刺激因子(gm-csf)、il-1、il-12、il-18、肿瘤坏死因子(tnf)和干扰素γ(ifn-γ)。在一些实施方案中，所述细胞因子选自il-4、il-6、il-10、il-11、il-13和il-1受体激动剂。

在一些实施方案中，如通过炎症标志物的血清水平所测量，施用本公开的微生物组合物使得家禽的肠道炎症减轻。在一些实施方案中，炎症标志物选自α1-酸性糖蛋白(agp)、il-8、il-1β、转化生长因子(tgf-β4)和脂肪酸结合蛋白(fabp2)。

在一些实施方案中，向产蛋家禽施用微生物组合物使得产蛋肉鸡的所得蛋中的先天性免疫应答增加。在一些方面，向产蛋家禽的蛋施用微生物组合物使得产蛋家禽的所得蛋中的先天性免疫应答增加。在一些方面，向家禽施用微生物组合物使得产蛋家禽的蛋中的先天性免疫应答改善。针对未施用微生物组合物的蛋/家禽测量改善或增加。在一些实施方案中，蛋中的先天性免疫应答的改善或增加使得孵化成功率提高、正常雏鸡形态发生率提高、胚胎存活率提高、雏鸡的生长速率和总体重增加。

在一些实施方案中，向产蛋家禽或产蛋家禽的蛋施用微生物组合物使得所述蛋中的蛋清蛋白减少或增加。

在一些实施方案中，先天性免疫应答包括产蛋家禽的蛋的先天性免疫应答的改善，所述改善是所述蛋中抗微生物剂如溶菌酶、类固醇、蛋清抗生物素蛋白、脱辅基蛋白、卵类粘蛋白、卵粘蛋白、卵黄素蛋白、卵抑制剂和伴清蛋白(卵转铁蛋白)增加或减少。在一些实施方案中，先天性免疫应答包括抗微生物剂如溶菌酶、类固醇、蛋清抗生物素蛋白、脱辅基蛋白、卵类粘蛋白、卵粘蛋白、卵黄素蛋白、卵抑制剂和伴清蛋白(卵转铁蛋白)增加。在一些实施方案中，向产蛋家禽或产蛋家禽的蛋施用微生物组合物使得蛋清蛋白减少或增加，所述蛋清蛋白包括溶菌酶、类固醇、蛋清抗生物素蛋白、脱辅基蛋白、卵类粘蛋白、卵粘蛋白、卵黄素蛋白、卵抑制剂和伴清蛋白(卵转铁蛋白)。

在一些实施方案中，将本公开的微生物组合物施用至家禽或家禽蛋使得(1)孵化成功率提高、(2)正常雏鸡形态发生率提高、(3)胚胎存活发生率提高、(4)雏鸡生长速率和总体重提高，其中所述提高中的任一者是相对于尚未施用本公开的微生物组合物的家禽或家禽蛋提高至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。

在一些实施方案中，相对于尚未施用本公开的微生物组合物的家禽或家禽蛋，将本公开的微生物组合物施用至家禽或家禽蛋使得孵化成功率提高至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。

在一些实施方案中，相对于尚未施用本公开的微生物组合物的家禽或家禽蛋，将本公开的微生物组合物施用至家禽或家禽蛋使得正常雏鸡形态发生率提高至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。

在一些实施方案中，相对于尚未施用本公开的微生物组合物的家禽或家禽蛋，将本公开的微生物组合物施用至家禽或家禽蛋使得胚胎存活发生率提高至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。

在一些实施方案中，相对于尚未施用本公开的微生物组合物的家禽或家禽蛋，将本公开的微生物组合物施用至家禽或家禽蛋使得雏鸡生长速率提高至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。

在一些实施方案中，相对于尚未施用本公开的微生物组合物的家禽或家禽蛋，将本公开的微生物组合物施用至家禽或家禽蛋使得雏鸡总体重增加至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。

在一些实施方案中，相对于尚未施用本公开的微生物组合物的家禽或家禽蛋，将本公开的微生物组合物施用至家禽或家禽蛋使得所述蛋中存在的溶菌酶的浓度增加或减少至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。

在一些实施方案中，相对于尚未施用本公开的微生物组合物的家禽或家禽蛋，将本公开的微生物组合物施用至家禽或家禽蛋使得所述蛋中存在的类固醇的浓度增加或减少至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。

在一些实施方案中，相对于尚未施用本公开的微生物组合物的家禽或家禽蛋，将本公开的微生物组合物施用至家禽或家禽蛋使得所述蛋中存在的抗生物素蛋白的浓度增加或减少至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。

在一些实施方案中，相对于尚未施用本公开的微生物组合物的家禽或家禽蛋，将本公开的微生物组合物施用至家禽或家禽蛋使得所述蛋中存在的脱辅基蛋白的浓度增加或减少至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。

在一些实施方案中，相对于尚未施用本公开的微生物组合物的家禽或家禽蛋，将本公开的微生物组合物施用至家禽或家禽蛋使得所述蛋中存在的卵类粘蛋白的浓度增加或减少至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。

在一些实施方案中，相对于尚未施用本公开的微生物组合物的家禽或家禽蛋，将本公开的微生物组合物施用至家禽或家禽蛋使得所述蛋中存在的卵粘蛋白的浓度增加或减少至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。

在一些实施方案中，相对于尚未施用本公开的微生物组合物的家禽或家禽蛋，将本公开的微生物组合物施用至家禽或家禽蛋使得所述蛋中存在的卵黄素蛋白的浓度增加或减少至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。

在一些实施方案中，相对于尚未施用本公开的微生物组合物的家禽或家禽蛋，将本公开的微生物组合物施用至家禽或家禽蛋使得所述蛋中存在的卵抑制剂的浓度增加或减少至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。

在一些实施方案中，相对于尚未施用本公开的微生物组合物的家禽或家禽蛋，将本公开的微生物组合物施用至家禽或家禽蛋使得所述蛋中存在的伴清蛋白的浓度增加或减少至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。

包封组合物

在一些实施方案中，将本公开的微生物或微生物组合物包封在包封组合物中。包封组合物在进入家禽的胃肠道之前保护微生物免受外部应激物的影响。在一些实施方案中，外部应激物包括与造粒和挤出相关的热应激物、干燥应激物和物理应激物。在一些实施方案中，外部应激物包括存在于组合物中的化学物质，针对所述化学物质包封组合物进一步产生可有益于微生物的环境，如最小化厌氧微生物上的需氧环境的氧化应激，保持其中营养细胞或孢子在造粒/挤压过程期间形成的微生物的存活力等。关于微生物的包封组合物以及包封微生物的方法，参见kalsta等人(us5,104,662a)、ford(us5,733,568a)以及mosbach和nilsson(us4,647,536a)。

在一个实施方案中，本公开的组合物表现出耐热性(thermaltolerance)，其可与耐热性(heattolerance)和耐热性(heatresistance)互换使用。在一个实施方案中，本公开的耐热组合物耐受与饲料制造、本公开的饲料和组合物的混合、在高热环境中储存等相关的高温。在一个实施方案中，本公开的耐热组合物对细胞壁组分和细胞内环境的热杀伤和变性具有抗性。在一个实施方案中，本公开的组合物对干燥/失水具有耐受性或抗性。

在一个实施方案中，包封物是储库型包封。在一个实施方案中，包封是基质型包封。在一个实施方案中，包封是涂覆的基质型包封。burgain等人(2011.j.foodeng.104:467-483)公开了许多包封实施方案和技术，其全部以引用的方式并入。

在一些实施方案中，本公开的组合物包封在以下中的一种或多种中：结冷胶、黄原胶、k-角叉菜胶、乙酸邻苯二甲酸纤维素、壳聚糖、淀粉、乳脂、乳清蛋白、藻酸钙、低聚果糖(raftilose)、raftiline、果胶、糖类、葡萄糖、麦芽糖糊精、阿拉伯树胶、瓜尔胶、种子粉、藻酸盐、糊精、葡聚糖、纤维素酶、明胶、明胶、白蛋白、酪蛋白、麸质、阿拉伯树胶、黄芪胶、蜡、石蜡、硬脂酸、单甘油酯以及甘油二酯。在一些实施方案中，本公开的组合物由聚合物、碳水化合物、糖、塑料、玻璃、多糖、脂质、蜡、油、脂肪酸或甘油酯中的一种或多种包封。在一个实施方案中，所述微生物组合物由葡萄糖包封。在一个实施方案中，所述微生物组合物由含葡萄糖的组合物包封。在一个实施方案中，所述微生物组合物的制剂包含葡萄糖包封剂。在一个实施方案中，所述微生物组合物的制剂包含葡萄糖包封的组合物。

在一些实施方案中，本公开的组合物的包封通过挤出、乳化、包衣、附聚，冻干、真空干燥或喷雾干燥进行。

在一个实施方案中，所述包封组合物包含微胶囊，所述微胶囊具有包封在固体壳材料中的多个液体核心。出于本公开的目的，“多个”核心被定义为两个或更多个。

第一类有用的可熔壳材料是通常为固体脂肪的材料，包括已经具有合适硬度的脂肪和被氢化直到其熔点足够高以达到本发明的目的的动物或植物脂肪和油。根据所需的工艺和储存温度以及所选的特定材料，特定脂肪可以是通常为固体或通常为液体的材料。如本文所用的术语“通常为固体”和“通常为液体”是指在所需温度下用于储存所得微胶囊的材料的状态。由于脂肪和氢化油严格地说不具有熔点，因此本文使用术语“熔点”来描述可熔材料变得充分软化或液体成功乳化并喷雾冷却的最低温度，因此大致对应于壳材料具有足够的完整性以防止胆碱核心释放的最高温度。对于不具有明显熔点的其他材料，“熔点”在本文中类似地定义。

可用于本文的脂肪和油的具体实例(其中一些需要硬化)是如下：动物油和脂肪，如牛脂、山羊脂、羔羊脂、猪油(lard)或猪油(porkfat)、鱼油和鲸油；植物油，如菜籽油、棉籽油、花生油、玉米油、橄榄油、大豆油、向日葵油、红花油、椰子油、棕榈油、亚麻籽油、桐油和蓖麻油；脂肪酸甘油单酯和甘油二酯；游离脂肪酸，如硬脂酸、棕榈酸和油酸；以及其混合物。油和脂的以上列表并不意味着是详尽的，而只是示例性的。

脂肪酸的具体实例包括亚油酸、γ-亚油酸、双高-亚麻酸、花生四烯酸、二十二碳四烯酸、十八碳烯酸、神经酸、二十碳三烯酸、芥酸、巨头鲸鱼酸、反油酸、油酸、棕榈油酸、十八碳四烯酸、二十碳五烯酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一酸、月桂酸、十三酸、肉豆蔻酸、十五酸、棕榈酸、十七酸、硬脂酸、十九酸、花生酸、二十一酸、山嵛酸、二十三酸、木蜡酸、二十五酸、蜡酸、二十七酸、褐煤酸、二十九酸、蜂花酸、三十一酸、三十二酸、三十三酸、格地酸、三十六酸、三十六烷酸酸、三十七烷酸和三十八烷酸。

可用作包封壳材料的另一类可熔材料是蜡。预期在本文使用的代表性蜡是如下：动物蜡，如蜂蜡、羊毛脂、贝壳蜡和中国昆虫蜡；植物蜡，如巴西棕榈、小烛树、杨梅和甘蔗；矿物蜡，如石蜡、微晶石油、石蜡、地蜡和褐煤蜡；合成蜡，如低分子量聚烯烃(例如，carbowax)和多元醇醚-酯(例如，山梨糖醇)；fischer-tropsch加工合成蜡；以及其混合物。如果核心是水性的，则本文不考虑水溶性蜡，如carbowax和山梨糖醇。

可用于本发明的仍然其他可熔化合物是可熔天然树脂，如松香、香脂、虫胶以及其混合物。

根据本公开，考虑将各种辅助材料并入可熔材料中。例如，抗氧化剂、光稳定剂、染料和色淀、调味剂、精油、抗结块剂、填充剂、ph稳定剂、糖(单糖、二糖、三糖和多糖)等可以不会削弱其对于本公开的效用的量并入可熔材料中。

本文考虑的核心材料占微胶囊的约0.1重量％至约50重量％、约1重量％至约35重量％或约5重量％至约30重量％。在一些实施方案中，本文考虑的核心材料占微胶囊的不超过约30重量％。在一些实施方案中，本文考虑的核心材料占微胶囊的约5重量％。在预期的微胶囊储存温度下，核心材料被认为是液体或固体。

核心可包括制药领域中熟知的其他添加剂，包括食用糖，如蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、果糖、乳糖、纤维二糖、单糖、二糖、三糖和多糖及其混合物；人工甜味剂、如阿斯巴甜、糖精、甜蜜盐及其混合物；食用酸，如醋酸(醋)、柠檬酸、抗坏血酸、酒石酸及其混合物；食用淀粉，如玉米淀粉；水解植物蛋白；水溶性维生素，如维生素c；水溶性药物；水溶性营养材料，如硫酸亚铁；调味剂；盐；谷氨酸一钠；抗微生物剂，如山梨酸；抗霉菌剂，如山梨酸钾、山梨酸、苯甲酸钠和苯甲酸；食物级颜料和染料；以及其混合物。其他可能有用的补充核心材料对于本领域普通技术人员来说将是显而易见的。

乳化剂可用于帮助形成稳定的乳液。代表性乳化剂包括单硬脂酸甘油酯、聚山梨醇酯、乙氧基化甘油单酯和甘油二酯以及其混合物。

为了便于加工，并且特别是为了能够成功地形成合理稳定的乳液，核心材料和壳材料的粘度在形成乳液的温度下应该相似。特别地，壳的粘度与核心的粘度的比例(以厘泊或相当的单位表示并在乳液的温度下测量)应为约22:1至约1:1，理想地约8:1至约1:1，并且优选约3:1至约1:1。1:1的比例是理想的，但在所述范围内的粘度比是有用的。

包封组合物不限于如上文公开的微胶囊组合物。在一些实施方案中，包封组合物将微生物组合物包封在粘合剂聚合物中，所述聚合物可以是天然的或合成的而没有毒性效应。在一些实施方案中，包封组合物可以是选自糖基质、明胶基质、聚合物基质、二氧化硅基质、淀粉基质、泡沫基质、玻璃/玻璃状等的基质。参见pirzio等人(美国专利7,488,503)。在一些实施方案中，包封组合物可选自聚乙酸乙烯酯；聚乙酸乙烯共聚物；乙烯醋酸乙烯酯(eva)共聚物；聚乙烯醇；聚乙烯醇共聚物；纤维素，包括乙基纤维素、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素和羧甲基纤维素；聚乙烯吡咯烷酮；多糖，包括淀粉、改性淀粉、糊精、麦芽糊精、藻酸盐和壳聚糖；单糖；脂肪；脂肪酸，包括油；蛋白质，包括明胶和玉米醇溶蛋白；阿拉伯树胶；虫胶；偏氯乙烯和偏氯乙烯共聚物；木质素磺酸钙；丙烯酸共聚物；聚丙烯酸乙烯酯；聚氧乙烯；丙烯酰胺聚合物和共聚物；聚丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酰胺单体；以及聚氯丁烯。

在一些实施方案中，将微生物组合物或其子组分包封在包含一种或多种多糖、一种或多种糖和/或一种或多种糖醇的固体玻璃基质或柔性玻璃基质(橡胶基质)中。在一些实施方案中，所述基质包含单糖或二糖。在一些实施方案中，二糖可选自蔗糖、麦芽糖、乳糖、乳果糖、海藻糖、纤维二糖和壳二糖。在一些实施方案中，将多糖、糖和/或糖醇外源性地添加至微生物组合物或其子组分。在一些实施方案中，所述基质是无定形基质。在一些实施方案中，将微生物组合物或其子组分玻璃化。在一些实施方案中，将微生物组合物或其子组分干燥。在一些实施方案中，将微生物组合物或其子子组分冻干。在一些实施方案中，将微生物组合物或其子组分喷雾干燥。在一些实施方案中，将微生物组合物或其子组分喷雾凝结。在一些实施方案中，通过经由汽化保存来保存/稳定化微生物组合物。参见harel和kohavi-beck(美国专利申请号8,097,245)。参见bronshtein(美国专利号9,469,835)。

在一些实施方案中，所述包封组合物包含至少一层包封。在一些实施方案中，所述包封组合物包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20层包封/包封剂。

在一些实施方案中，所述包封组合物包含至少两层包封。在一些实施方案中，每一层包封赋予组合物不同的特性。在一些实施方案中，没有两个连续的层赋予相同的特性。在一些实施方案中，至少两层包封中的至少一层赋予热稳定性、贮存稳定性、耐紫外线性、耐湿性、耐干燥性、疏水性、亲水性、疏脂性、亲脂性、ph稳定性、耐酸性和耐碱性。

在一些实施方案中，所述包封组合物包含两层包封层；第一层赋予热稳定性和/或贮存稳定性，并且第二层提供耐ph性。

在一些实施方案中，包封层赋予保持在包封层中心的微生物组合物的定时释放。在一些实施方案中，层数越多，在施用后在暴露微生物组合物之前赋予更多的时间。

在一些实施方案中，本公开的包封壳可达10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、110μm、120μm、130μm、140μm、150μm、160μm、170μm、180μm、190μm、200μm、210μm、220μm、230μm、240μm、250μm、260μm、270μm、280μm、290μm、300μm、310μm、320μm、330μm、340μm、350μm、360μm、370μm、380μm、390μm、400μm、410μm、420μm、430μm、440μm、450μm、460μm、470μm、480μm、490μm、500μm、510μm、520μm、530μm、540μm、550μm、560μm、570μm、580μm、590μm、600μm、610μm、620μm、630μm、640μm、650μm、660μm、670μm、680μm、690μm、700μm、710μm、720μm、730μm、740μm、750μm、760μm、770μm、780μm、790μm、800μm、810μm、820μm、830μm、840μm、850μm、860μm、870μm、880μm、890μm、900μm、910μm、920μm、930μm、940μm、950μm、960μm、970μm、980μm、990μm、1000μm、1010μm、1020μm、1030μm、1040μm、1050μm、1060μm、1070μm、1080μm、1090μm、1100μm、1110μm、1120μm、1130μm、1140μm、1150μm、1160μm、1170μm、1180μm、1190μm、1200μm、1210μm、1220μm、1230μm、1240μm、1250μm、1260μm、1270μm、1280μm、1290μm、1300μm、1310μm、1320μm、1330μm、1340μm、1350μm、1360μm、1370μm、1380μm、1390μm、1400μm、1410μm、1420μm、1430μm、1440μm、1450μm、1460μm、1470μm、1480μm、1490μm、1500μm、1510μm、1520μm、1530μm、1540μm、1550μm、1560μm、1570μm、1580μm、1590μm、1600μm、1610μm、1620μm、1630μm、1640μm、1650μm、1660μm、1670μm、1680μm、1690μm、1700μm、1710μm、1720μm、1730μm、1740μm、1750μm、1760μm、1770μm、1780μm、1790μm、1800μm、1810μm、1820μm、1830μm、1840μm、1850μm、1860μm、1870μm、1880μm、1890μm、1900μm、1910μm、1920μm、1930μm、1940μm、1950μm、1960μm、1970μm、1980μm、1990μm、2000μm、2010μm、2020μm、2030μm、2040μm、2050μm、2060μm、2070μm、2080μm、2090μm、2100μm、2110μm、2120μm、2130μm、2140μm、2150μm、2160μm、2170μm、2180μm、2190μm、2200μm、2210μm、2220μm、2230μm、2240μm、2250μm、2260μm、2270μm、2280μm、2290μm、2300μm、2310μm、2320μm、2330μm、2340μm、2350μm、2360μm、2370μm、2380μm、2390μm、2400μm、2410μm、2420μm、2430μm、2440μm、2450μm、2460μm、2470μm、2480μm、2490μm、2500μm、2510μm、2520μm、2530μm、2540μm、2550μm、2560μm、2570μm、2580μm、2590μm、2600μm、2610μm、2620μm、2630μm、2640μm、2650μm、2660μm、2670μm、2680μm、2690μm、2700μm、2710μm、2720μm、2730μm、2740μm、2750μm、2760μm、2770μm、2780μm、2790μm、2800μm、2810μm、2820μm、2830μm、2840μm、2850μm、2860μm、2870μm、2880μm、2890μm、2900μm、2910μm、2920μm、2930μm、2940μm、2950μm、2960μm、2970μm、2980μm、2990μm或3000μm厚。

动物饲料

在一些实施方案中，将本公开的组合物与动物饲料混合。在一些实施方案中，动物饲料可以各种形式存在，如丸剂、胶囊、颗粒状、粉末状、糊状、液体或半液体。

在一些实施方案中，将本公开的组合物在饲料研磨机中单独作为独立的预混物，和/或与其他饲料添加剂如monensin、维生素、抗生素等一起混合到预混物或糊状物中。在一个实施方案中，本公开的组合物在饲料研磨机中混合到饲料中或饲料上。在另一个实施方案中，将本公开的组合物混合到饲料本身中。

在一些实施方案中，本公开的饲料可补充有水、一种或多种预混物、草料、饲料、豆类(例如，整粒、粉碎或磨碎)、谷物(例如，整粒、粉碎或磨碎)、基于豆类或谷物的油、基于豆类或谷物的食物、基于豆类或谷物的半干青贮草或青贮饲料、基于豆类或谷物的糖浆、脂肪酸，糖醇(例如多元醇)、可商购的配方饲料、牡蛎壳和其他双壳类的壳以及其混合物。

在一些实施方案中，草料包括干草、半干青贮草和青贮饲料。在一些实施方案中，干草包括禾本科干草(例如，苏丹草、鸭茅等)、苜蓿干草和三叶草干草。在一些实施方案中，半干青贮草包括禾本科半干青贮草、高粱半干青贮草和苜蓿半干青贮草。在一些实施方案中，青贮饲料包括玉米、燕麦、小麦、苜蓿、三叶草等。

在一些实施方案中，可在饲料中使用一种或多种预混物。预混物可包含微量成分，如维生素、矿物质、氨基酸；化学防腐剂；药物组合物，如抗生素和其他药物；发酵产品和其他成分。在一些实施方案中，将预混物掺混到饲料中。

在一些实施方案中，饲料可包括饲料浓缩物，如大豆皮、大豆油、甜菜浆、糖蜜、高蛋白大豆粉、磨碎的玉米、带壳玉米、小麦籽粒、蒸馏谷物、棉籽壳和油脂。参见anderson等人(美国专利3,484,243)、iritani等人(美国专利6,090,416)、axelrod等人(美国公布us20060127530a1)以及katsumi等人(美国专利5,741,508)关于能够用于本发明组合物和方法中的动物饲料和动物饲料补充剂。

在一些实施方案中，饲料作为化合物出现，其在能够满足基本饮食需要的混合组合物中包括饲料本身、维生素、矿物质、氨基酸和其他必需组分。复合饲料还可包含预混物。

在一些实施方案中，本公开的微生物组合物可与动物饲料、预混物和/或复合饲料混合。在饲喂家禽之前，可将动物饲料的各个组分与微生物组合物混合。本公开的微生物组合物可施加到预混物中或预混物上，施加到饲料中或饲料上，和/或施加到复合饲料中或复合饲料上。

微生物组合物的施用

在一些实施方案中，通过口服途径将本公开的微生物组合物施用于家禽。在一些实施方案中，通过直接注射途径将微生物组合物施用到胃肠道中。在其他实施方案中，直接注射施用将微生物组合物直接递送至嗉囊、砂囊、盲肠、小肠和大肠中的一种或多种。图3和图4提供鸡的胃肠道的详细解剖图。在一些实施方案中，本公开的微生物组合物通过泄殖腔施用于动物。在其他实施方案中，泄殖腔施用是呈插入的栓剂的形式。

在一些实施方案中，通过饮用水、喷洒在动物与之接触的垫料上、与药物或疫苗混合以及管饲来施用微生物组合物。在一些实施方案中，将微生物组合物直接喷洒在动物上，其中动物摄取已经喷洒在动物身上的组合物。在一些实施方案中，将微生物组合物直接喷洒在未孵化的蛋上。在一些实施方案中，将微生物组合物喷洒在饲料上和/或喷雾在饲料中，并将饲料施用至动物。在其他实施方案中，动物通过对已经与喷洒的组合物接触的羽毛进行整理来摄取所述组合物。

在一些实施方案中，在施用前将微生物组合物与饲料混合。在一些实施方案中，在施用前将微生物组合物与饲料一起制粒。在一些实施方案中，在施用前将微生物组合物与饲料一起挤出。在一些方面，当制备饲料时，将微生物组合物混合到饲料组分中。在一些方面，在制备饲料时，将第一组的一种或多种微生物组合物微生物与饲料一起制粒、与饲料一起挤出和/或混合到饲料组分中。在另一方面，将微生物组合物的第二组一种或多种微生物添加至含有第一组的一种或多种微生物的饲料中。

在一些实施方案中，本公开的微生物组合物在孵化后第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天施用至家禽。在一些实施方案中，本公开的微生物组合物在孵化前第22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0天作为液体、半液体或固体施用至卵的外表面。在一些实施方案中，本公开的微生物组合物在孵化后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和/或30周内以多个给药期施用至家禽。在一些实施方案中，在孵化后立即施用所述微生物组合物。在一些实施方案中，所述微生物组合物自身施用于卵(例如，注射)中或与其他产品如疫苗一起施用。在一些实施方案中，本公开的微生物组合物在孵化后第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36小时施用至家禽。

在一些实施方案中，在孵化日与孵化后5天之间、在孵化日与孵化后10天之间、在孵化日与孵化后14天之间、在孵化日与孵化后16天之间以及在孵化日与孵化后24天之间一次或多次施用微生物组合物。在另一实施方案中，在孵化日与孵化后5天之间、在孵化日与孵化后10天之间、在孵化日与孵化后14天之间、在孵化日与孵化后16天之间以及在孵化日与孵化后24天之间一次或多次施用第一微生物组合物。

在一些实施方案中，第一微生物组合物在孵化后第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天施用至家禽。在一些实施方案中，第一微生物组合物在孵化前第22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0天作为液体、半液体或固体施用至卵的外表面。在一些实施方案中，本公开的第一微生物组合物在孵化后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和/或30周内以多个给药期施用至家禽。在一些实施方案中，在孵化后立即施用第一微生物组合物。在一些实施方案中，第一微生物组合物自身施用于卵(例如，注射)中或与其他产品如疫苗一起施用。在一些实施方案中，本公开的第一微生物组合物在孵化后第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或36天施用至家禽。

在一些实施方案中，第二或后续微生物组合物在孵化后第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天施用至家禽。在一些实施方案中，第二或后续微生物组合物在孵化前第22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0天作为液体、半液体或固体施用至卵的外表面。在一些实施方案中，本公开的第二或后续微生物组合物在孵化后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和/或30周内以多个给药期施用至家禽。在一些实施方案中，在孵化后立即施用第二或后续微生物组合物。在一些实施方案中第二或后续微生物组合物自身施用于卵(例如，注射)中或与其他产品如疫苗一起施用。在一些实施方案中，本公开的第二或后续微生物组合物在孵化后第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或36小时施用至家禽。

在一些实施方案中，每天施用第二或后续微生物组合物持续家禽的寿命。在一些实施方案中，每天施用第一微生物组合物持续家禽的寿命。在一些实施方案中，每天施用微生物组合物持续家禽的寿命。在一些实施方案中，在家禽寿命的持续时间内，向家禽施用包含一种或多种相同类型的微生物的微生物组合物。在其他实施方案中，微生物组合物在家禽寿命的持续时间内至少改变一次，但是微生物组合物中的一种或多种类型的微生物没有改变。

在一些实施方案中，后续微生物组合物是第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十微生物组合物，其中所述微生物组合物各自在所述组合物中存在的精确菌株和/或微生物方面彼此不同。

在一些实施方案中，每天施用微生物组合物持续家禽的寿命。在一些实施方案中，在孵化后第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天开始每天施用微生物组合物持续家禽的寿命。

在一些实施方案中，从孵化后第1、2、3、4、5、6或7天开始每天施用微生物组合物持续家禽的寿命。在一些实施方案中，从孵化后第4或5天开始每天施用微生物组合物持续家禽的寿命。

在一些实施方案中，从孵化后第1、2、3、4、5、6或7天开始每天施用微生物组合物，直到发生第一次饲料改变。在一些实施方案中，从第4或5天开始每天施用微生物组合物，直到发生第一次饲料改变。

在一些实施方案中，从孵化后第1、2、3、4、5、6或7天开始每天施用第一微生物组合物，直到发生第一次饲料改变。在一些实施方案中，然后从第一次饲料改变开始并且跨越家禽的寿命每天施用第二微生物组合物。

在一些实施方案中，从孵化后第1、2、3、4、5、6或7天开始每天施用第一微生物组合物，直到发生第一次饲料改变，并且从发生饲料改变之前第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天开始每天施用第二种微生物组合物并持续家禽的寿命。在一些实施方案中，从孵化后第1、2、3、4、5、6或7天开始每天施用第一微生物组合物，直到发生第一次饲料改变，并且从发生饲料改变之后第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天开始每天施用第二种微生物组合物并持续家禽的寿命。

在一些实施方案中，从孵化后第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20周开始每天施用微生物组合物持续家禽的寿命。在一些实施方案中，从宰杀前1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20周开始每天施用微生物组合物持续家禽的寿命。

在一些实施方案中，从宰杀前1、2、3、4或5周开始每天施用不同的微生物组合物持续家禽的寿命，并且其中此微生物组合物不同于在家禽生命中较早施用的第一或第二微生物组合物。

在一些实施方案中，每天施用第一微生物组合物至少一次，直到发生第一次饲料改变。在一些实施方案中，每周施用第一微生物组合物至少一次，直到发生第一次饲料改变。在一些实施方案中，每天施用第一微生物组合物至少两次，直到发生第一次饲料改变。在一些实施方案中，每天施用第一微生物组合物至少一次持续家禽的寿命。在一些实施方案中，每周施用第一微生物组合物至少一次持续家禽的寿命。在一些实施方案中，每天施用第一微生物组合物至少两次持续家禽的寿命。

在一些实施方案中，从第一次饲料改变开始且跨越家禽的寿命每天施用第二微生物组合物至少一次。在一些实施方案中，从第一次饲料改变开始且跨越家禽的寿命每周施用第二微生物组合物至少一次。在一些实施方案中，从第一次饲料改变开始且跨越家禽的寿命每天施用第二微生物组合物至少两次。

在一些实施方案中，所述微生物组合物以包括总计或至少1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、10ml、11ml、12ml、13ml、14ml、15ml、16ml、17ml、18ml、19ml、20ml、21ml、22ml、23ml、24ml、25ml、26ml、27ml、28ml、29ml、30ml、31ml、32ml、33ml、34ml、35ml、36ml、37ml、38ml、39ml、40ml、41m、42ml、43ml、44ml、45ml、46ml、47ml、48ml、49ml、50ml、60ml、70ml、80ml、90ml、100ml、200ml、300ml、400ml、500ml、600ml、700ml、800ml、900ml或1,000ml的剂量施用。

在一些实施方案中，所述微生物组合物以包含总计或至少10¹⁸、10¹⁷、10¹⁶、10¹⁵、10¹⁴、10¹³、10¹²、10¹¹、10¹⁰、10⁹、10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、或10²个微生物细胞的剂量施用。

在一些实施方案中，将所述微生物组合物与饲料混合，并且施用通过与饲料一起摄入所述微生物组合物发生。在一些实施方案中，施用所述微生物组合物的剂量以使得每克或毫升所述组合物存在10²至10¹²、10³至10¹²、10⁴至10¹²、10⁵至10¹²、10⁶至10¹²、10⁷至10¹²、10⁸至10¹²、10⁹至10¹²、10¹⁰至10¹²、10¹¹至10¹²、10²至10¹¹、10³至10¹¹、10⁴至10¹¹、10⁵至10¹¹、10⁶至10¹¹、10⁷至10¹¹、10⁸至10¹¹、10⁹至10¹¹、10¹⁰至10¹¹、10²至10¹⁰、10³至10¹⁰、10⁴至10¹⁰、10⁵至10¹⁰、10⁶至10¹⁰、10⁷至10¹⁰、10⁸至10¹⁰、10⁹至10¹⁰、10²至10⁹、10³至10⁹、10⁴至10⁹、10⁵至10⁹、10⁶至10⁹、10⁷至10⁹、10⁸至10⁹、10²至10⁸、10³至10⁸、10⁴至10⁸、10⁵至10⁸、10⁶至10⁸、10⁷至10⁸、10²至10⁷、10³至10⁷、10⁴至10⁷、10⁵至10⁷、10⁶至10⁷、10²至10⁶、10³至10⁶、10⁴至10⁶、10⁵至10⁶,10²至10⁵、10³至10⁵、10⁴至10⁵、10²至10⁴、10³至10⁴、10²至10³、10¹²、10¹¹、10¹⁰、10⁹、10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³或10²个总微生物细胞。

在一些实施方案中，所述微生物组合物的施用剂量包含10²至10¹⁸、10³至10¹⁸、10⁴至10¹⁸、10⁵至10¹⁸、10⁶至10¹⁸、10⁷至10¹⁸、10⁸至10¹⁸、10⁹至10¹⁸、10¹⁰至10¹⁸、10¹¹至10¹⁸、10¹²至10¹⁸、10¹³至10¹⁸、10¹⁴至10¹⁸、10¹⁵至10¹⁸、10¹⁶至10¹⁸、10¹⁷至10¹⁸、10²至10¹²、10³至10¹²、10⁴至10¹²、10⁵至10¹²、10⁶至10¹²、10⁷至10¹²、10⁸至10¹²、10⁹至10¹²、10¹⁰至10¹²、10¹¹至10¹²、10²至10¹¹、10³至10¹¹、10⁴至10¹¹、10⁵至10¹¹、10⁶至10¹¹、10⁷至10¹¹、10⁸至10¹¹、10⁹至10¹¹、10¹⁰至10¹¹、10²至10¹⁰、10³至10¹⁰、10⁴至10¹⁰、10⁵至10¹⁰、10⁶至10¹⁰、10⁷至10¹⁰、10⁸至10¹⁰、10⁹至10¹⁰、10²至10⁹、10³至10⁹、10⁴至10⁹、10⁵至10⁹、10⁶至10⁹、10⁷至10⁹、10⁸至10⁹、10²至10⁸、10³至10⁸、10⁴至10⁸、10⁵至10⁸、10⁶至10⁸、10⁷至10⁸、10²至10⁷、10³至10⁷、10⁴至10⁷、10⁵至10⁷、10⁶至10⁷、10²至10⁶、10³至10⁶、10⁴至10⁶、10⁵至10⁶、10²至10⁵、10³至10⁵、10⁴至10⁵、10²至10⁴、10³至10⁴、10²至10³、10¹⁸、10¹⁷、10¹⁶、10¹⁵、10¹⁴、10¹³、10¹²、10¹¹、10¹⁰、10⁹、10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³或10²个总微生物细胞。

在一些实施方案中，所述组合物每天施用1次或多次。在一些方面，所述组合物在每次饲喂动物时与食物一起施用。在一些实施方案中，所述组合物每天施用1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3、1至2、2至10、2至9、2至8、2至7、2至6、2至5、2至4、2至3、3至10、3至9、3至8、3至7、3至6、3至5、3至4、4至10、4至9、4至8、4至7、4至6、4至5、5至10、5至9、5至8、5至7、5至6、6至10、6至9、6至8、6至7、7至10、7至9、7至8、8至10、8至9、9至10、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次。

在一些实施方案中，所述微生物组合物每周施用1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3、1至2、2至10、2至9、2至8、2至7、2至6、2至5、2至4、2至3、3至10、3至9、3至8、3至7、3至6、3至5、3至4、4至10、4至9、4至8、4至7、4至6、4至5、5至10、5至9、5至8、5至7、5至6、6至10、6至9、6至8、6至7、7至10、7至9、7至8、8至10、8至9、9至10、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次。

在一些实施方案中，所述微生物组合物每月施用1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3、1至2、2至10、2至9、2至8、2至7、2至6、2至5、2至4、2至3、3至10、3至9、3至8、3至7、3至6、3至5、3至4、4至10、4至9、4至8、4至7、4至6、4至5、5至10、5至9、5至8、5至7、5至6、6至10、6至9、6至8、6至7、7至10、7至9、7至8、8至10、8至9、9至10、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次。

在一些实施方案中，所述微生物组合物每年施用1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3、1至2、2至10、2至9、2至8、2至7、2至6、2至5、2至4、2至3、3至10、3至9、3至8、3至7、3至6、3至5、3至4、4至10、4至9、4至8、4至7、4至6、4至5、5至10、5至9、5至8、5至7、5至6、6至10、6至9、6至8、6至7、7至10、7至9、7至8、8至10、8至9、9至10、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次。

在一些实施方案中，通过使用专门设计并制造以准确、安全且有效地施加涂层的处理施加设备，使用常规混合、喷洒或其组合的方法，可用一层或多层微生物和/或本文公开的微生物组合物均匀地涂布饲料。这种设备使用各种类型的涂布技术，例如旋转涂布机、鼓式涂布机、流化床技术、喷射床、旋转雾或其组合。诸如本公开的那些的液体处理可通过旋转“雾化器”盘或喷嘴施加，所述盘或喷嘴在其移动通过喷雾图案时将微生物组合物均匀地分布在饲料上。在一些方面，然后将饲料混合或翻滚另外一段时间以实现另外的处理分布和干燥。

在一些实施方案中，本公开的饲料包衣可达10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、110μm、120μm、130μm、140μm、150μm、160μm、170μm、180μm、190μm、200μm、210μm、220μm、230μm、240μm、250μm、260μm、270μm、280μm、290μm、300μm、310μm、320μm、330μm、340μm、350μm、360μm、370μm、380μm、390μm、400μm、410μm、420μm、430μm、440μm、450μm、460μm、470μm、480μm、490μm、500μm、510μm、520μm、530μm、540μm、550μm、560μm、570μm、580μm、590μm、600μm、610μm、620μm、630μm、640μm、650μm、660μm、670μm、680μm、690μm、700μm、710μm、720μm、730μm、740μm、750μm、760μm、770μm、780μm、790μm、800μm、810μm、820μm、830μm、840μm、850μm、860μm、870μm、880μm、890μm、900μm、910μm、920μm、930μm、940μm、950μm、960μm、970μm、980μm、990μm、1000μm、1010μm、1020μm、1030μm、1040μm、1050μm、1060μm、1070μm、1080μm、1090μm、1100μm、1110μm、1120μm、1130μm、1140μm、1150μm、1160μm、1170μm、1180μm、1190μm、1200μm、1210μm、1220μm、1230μm、1240μm、1250μm、1260μm、1270μm、1280μm、1290μm、1300μm、1310μm、1320μm、1330μm、1340μm、1350μm、1360μm、1370μm、1380μm、1390μm、1400μm、1410μm、1420μm、1430μm、1440μm、1450μm、1460μm、1470μm、1480μm、1490μm、1500μm、1510μm、1520μm、1530μm、1540μm、1550μm、1560μm、1570μm、1580μm、1590μm、1600μm、1610μm、1620μm、1630μm、1640μm、1650μm、1660μm、1670μm、1680μm、1690μm、1700μm、1710μm、1720μm、1730μm、1740μm、1750μm、1760μm、1770μm、1780μm、1790μm、1800μm、1810μm、1820μm、1830μm、1840μm、1850μm、1860μm、1870μm、1880μm、1890μm、1900μm、1910μm、1920μm、1930μm、1940μm、1950μm、1960μm、1970μm、1980μm、1990μm、2000μm、2010μm、2020μm、2030μm、2040μm、2050μm、2060μm、2070μm、2080μm、2090μm、2100μm、2110μm、2120μm、2130μm、2140μm、2150μm、2160μm、2170μm、2180μm、2190μm、2200μm、2210μm、2220μm、2230μm、2240μm、2250μm、2260μm、2270μm、2280μm、2290μm、2300μm、2310μm、2320μm、2330μm、2340μm、2350μm、2360μm、2370μm、2380μm、2390μm、2400μm、2410μm、2420μm、2430μm、2440μm、2450μm、2460μm、2470μm、2480μm、2490μm、2500μm、2510μm、2520μm、2530μm、2540μm、2550μm、2560μm、2570μm、2580μm、2590μm、2600μm、2610μm、2620μm、2630μm、2640μm、2650μm、2660μm、2670μm、2680μm、2690μm、2700μm、2710μm、2720μm、2730μm、2740μm、2750μm、2760μm、2770μm、2780μm、2790μm、2800μm、2810μm、2820μm、2830μm、2840μm、2850μm、2860μm、2870μm、2880μm、2890μm、2900μm、2910μm、2920μm、2930μm、2940μm、2950μm、2960μm、2970μm、2980μm、2990μm或3000μm厚。

在一些实施方案中，可将微生物细胞自由涂覆到任何数量的组合物上，或者它们可在涂覆到组合物上之前配制成液体或固体组合物。例如，包含微生物的固体组合物可通过将固体载体与营养细胞的悬浮液混合直到所述固体载体被孢子或细胞悬浮液浸渍来制备。然后可干燥此混合物以获得所需颗粒。

在一些其他实施方案中，预期本公开的固体或液体微生物组合物还含有功能剂，例如，活性炭、矿物质、维生素、酶、抗生素和/或其他能够改善产品质量的试剂或其组合。

当通过添加本公开的一个实施方案对其进行修饰时，本领域中已知的涂覆方法和使用所述方法中的组合物可以是特别有用的。此类涂覆方法和用于它们的施加的装置公开于例如：美国专利号8,097,245、7,998,502、9,044,497、8,968,721、9,737,578、9,469,835和5,766,520以及pct专利申请公布号wo2008/076975、wo2010/138522、wo2011/094469、wo2010/111347和wo2010/111565，其各自以引用的方式并入本文

在一些实施方案中，在一种或多种微生物或生物集合体彼此接触的存在下，本公开的微生物或生物集合体对本文所述的一种或多种性状表现出协同效应。通过教导方法获得的协同效应可例如根据colby的公式(即，(e)＝x+y-(x*y/100))进行量化。参见colby,r.s.,“calculatingsynergisticandantagonisticresponsesofherbicidecombinations,”1967.weeds.第15卷,第20-22页，以引用的方式整体并入本文。因此，“协同”旨在反映已增加超过添加量的结果/参数/效果。

在一些实施方案中，本公开的微生物或生物集合体可通过浸液施用。在一个实施方案中，浸液是口服浸液。浸液施用包括利用将包含微生物或微生物生物集合体的液体注入/释放到动物的口腔和/或食道中的浸液药盒/施加器/注射器。

在一些实施方案中，在孵化后第0天与第14天之间，用本公开的微生物组合物喷洒新孵化出的小动物/雏鸡。在一些实施方案中，将本公开的微生物组合物与食物一起施用于家禽。在一些实施方案中，喷雾施用的微生物组合物包含与经由食物施用的微生物组合物不同的一组微生物。在一些实施方案中，喷雾施用的微生物组合物和经由食物施用的微生物组合物包含同一组微生物。

在一些实施方案中，本公开的微生物或微生物生物集合体可以定时释放的方式施用。所述组合物可包覆在化学组合物，或者可包含在机械装置或胶囊中，其在一段时间内而不是一次性释放微生物或微生物生物集合体。在一个实施方案中，将微生物或微生物生物集合体以定时释放胶囊施用于动物。在一个实施方案中，所述组合物可包覆在化学组合物中，或者可包含在机械装置或胶囊中，其在摄取后一段时间内一次性释放所述微生物或微生物生物集合体。在一个实施方案中，所述组合物可包覆在化学组合物中，或者可包含在机械装置或胶囊中，其在胃肠道内的不同位置释放所述微生物或微生物生物集合体。

在一些实施方案中，所述微生物或微生物生物集合体在施用定时释放组合物或装置后1至5、1至10、1至15、1至20、1至24、1至25、1至30、1至35、1至40、1至45、1至50、1至55、1至60、1至65、1至70、1至75、1至80、1至85、1至90、1至95或1至100小时之间以定时释放的方式施用。

在一些实施方案中，所述微生物或微生物生物集合体在施用定时释放组合物或装置后1至2、1至3、1至4、1至5、1至6、1至7、1至8、1至9、1至10、1至11、1至12、1至13、1至14、1至15、1至16、1至17、1至18、1至19、1至20、1至21、1至22、1至23、1至24、1至25、1至26、1至27、1至28、1至29或1至30天之间以定时释放的方式施用。

微生物

如本文所用，术语“微生物”应在广义上采用。它包括但不限于两个原核结构域，细菌和古细菌，以及真核真菌、原生生物和病毒。

举例来说，所述微生物可包括以下属的物种：乳杆菌属、梭菌属、栖粪杆菌、产氢厌氧杆菌属、顶果孢菌属、芽孢杆菌属、罕见小球菌属、明串珠菌属、毛螺菌属、厌氧细杆菌属、微杆菌属、疣孢菌属、布劳特菌属、假单胞菌属、孢杆菌属、棒状杆菌属、链球菌属、副球菌属、解纤维梭菌属、瘤胃球菌属、拟杆菌属、线黑粉菌属、赤霉菌属、alatospora、毕赤酵母属以及念珠菌属。在一些实施方案中，所述微生物可包括本文公开的任何属的物种。

在某些实施方案中，所述微生物是不可培养的。这应该被认为是指不知道微生物是否可培养或难以使用本领域技术人员已知的方法培养。

在一个实施方案中，所述微生物获自动物(例如，哺乳动物、爬行动物、禽类等)、土壤(例如，根际)、空气、水(例如，海洋、淡水、废水污泥)、沉积物、油、植物(例如，根、叶、茎)、农产品和极端环境(例如，酸性矿山排水或热液系统)。在另一个实施方案中，从海洋或淡水环境如海洋、河流或湖泊获得微生物。在另一个实施方案中，微生物可来自水体表面或水体的任何深度(例如，深海样本)。

本发明的微生物可在基本上纯的或混合的培养物中分离。它们可浓缩、稀释或以其在源材料中发现的天然浓度提供。例如，可通过将沉淀物悬浮在淡水中并使沉淀物落到底部来分离来自盐水沉积物的微生物以用于本公开中。含有大部分微生物的水可在合适的沉降时间后通过倾析移除并施用于家禽的胃肠道或者通过过滤或离心浓缩、稀释至适当的浓度并施用于家禽的胃肠道，除去了大部分盐。作为其他实例，可类似地处理来自矿化或毒性来源的微生物以回收微生物用于施加至家禽以最小化对动物的损害的可能性。

在另一个实施方案中，所述微生物以粗形式使用，其中它们不与它们天然存在的源材料分离。例如，所述微生物与它们所在的源材料组合提供；例如，在胃肠道中发现的粪便物质或其他组合物。在此实施方案中，源材料可包括一种或多种微生物物种。

在一些实施方案中，混合的微生物群体用于本公开的方法中。

在本公开的实施方案中，其中所述微生物与源材料(例如，它们所天然存在的材料)中分离，可使用熟练技术人员容易知道的许多标准技术中的任何一种或组合。然而，举例来说，这些通常采用以下方法，通过所述方法可以基本上纯的形式获得单一微生物的固体或液体培养物，通常通过在固体微生物生长培养基的表面上物理分离或通过体积稀释分离到液体微生物生长培养基中。这些方法可包括从干燥材料、液体悬浮液、浆液或匀浆中分离，其中材料在适当固体凝胶生长培养基上以薄层铺展，或将材料的连续稀释液制成无菌培养基并接种到液体或固体培养基中。

虽然不是必需的，但在一个实施方案中，含有微生物的材料可在分离过程之前进行预处理，以便使材料中的所有微生物繁殖。然后可如上所述从富集的材料中分离微生物。

在某些实施方案中，如前所述，所述一种或多种微生物可粗形式使用，并且不需要从动物或培养基中分离。例如，可获得包含被鉴定为有益于提高饲料效率的微生物的粪便或生长培养基，并将其用作下一轮方法的微生物的原始来源或在所述方法结束时用作微生物的原始来源。例如，可获得新鲜粪便并任选地加工。

微生物组改变和微生物的丰度

在一些实施方案中，家禽的微生物组，包括肠道微生物组(嗉囊、砂囊、盲肠、小肠和大肠)包含具有多种代谢能力的多种微生物。所述微生物组受到一系列因素的影响，包括饮食、动物新陈代谢的变化和品种等。大多数家禽饮食是基于植物的并且富含复杂多糖，所述复杂多糖使胃肠微生物群落富集能够分解饮食中的特定聚合物组分(如纤维素、半纤维素、木质素等)的微生物。初级降解的最终产品维持最终产生一系列有机酸以及氢和二氧化碳的一连串微生物。由于微生物组的复杂性和相互关联性，改变用于初级降解的饮食且因此基质可对肠道微生物代谢具有级联效应，伴随所产生的有机酸谱和甲烷水平的变化，从而影响动物生产和/或由动物生产的产品的质量和数量。参见menezes等人(2011.femsmicrobiol.ecol.78(2):256-265)。

在一些方面，本公开涉及施用本文所述的微生物组合物以调节或改变家禽的微生物组。

在一些实施方案中，组通过将一种或多种微生物施用至胃肠道而改变所述微生物。在其他实施方案中，所述一种或多种微生物是选自表1和/或表3的微生物。在一些实施方案中，所述微生物组改变或调节包括在施用本公开的一种或多种微生物之前存在的特定微生物的减少或丧失。在一些实施方案中，所述微生物组改变或调节包括在施用本公开的一种或多种微生物之前存在的特定微生物的增加。在一些实施方案中，所述微生物组改变或调节包括在施用本公开的一种或多种微生物之前不存在的一种或多种微生物的获得。在另一个实施方案中，一种或多种微生物的获得是未具体地包括在施用的微生物集合体中的微生物。

在一些实施方案中，本公开的微生物的施用产生微生物组的持续调节，以使得所施用的微生物在所述微生物组中存在至少1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3、1至2、2至10、2至9、2至8、2至7、2至6、2至5、2至4、2至3、3至10、3至9、3至8、3至7、3至6、3至5、3至4、4至10、4至9、4至8、4至7、4至6、4至5、5至10、5至9、5至8、5至7、5至6、6至10、6至9、6至8、6至7、7至10、7至9、7至8、8至10、8至9、9至10、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天的时间段。

在一些实施方案中，本公开的微生物的施用产生微生物组的持续调节，以使得所施用的微生物在所述微生物组中存在至少1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3、1至2、2至10、2至9、2至8、2至7、2至6、2至5、2至4、2至3、3至10、3至9、3至8、3至7、3至6、3至5、3至4、4至10、4至9、4至8、4至7、4至6、4至5、5至10、5至9、5至8、5至7、5至6、6至10、6至9、6至8、6至7、7至10、7至9、7至8、8至10、8至9、9至10、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10周的时间段。

在一些实施方案中，本公开的微生物的施用产生微生物组的持续调节，以使得所施用的微生物在所述微生物组中存在至少1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3、1至2、2至10、2至9、2至8、2至7、2至6、2至5、2至4、2至3、3至10、3至9、3至8、3至7、3至6、3至5、3至4、4至10、4至9、4至8、4至7、4至6、4至5、5至10、5至9、5至8、5至7、5至6、6至10、6至9、6至8、6至7、7至10、7至9、7至8、8至10、8至9、9至10、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月的时间段。

在一些实施方案中，通过对胃肠道取样并使用引物扩增所施用的微生物的16s或18srdna序列或itsrdna序列来检测所施用的微生物的存在。在一些实施方案中，所施用的微生物是选自表1和/或表3那些微生物中的一种或多种，并且相应的rdna序列是选自seqidno:1-387的那些。

在一些实施方案中，通过扩增从胃肠样品收集的多核苷酸来测量禽类的微生物组，其中所述多核苷酸可以是微生物rdna的16s或18srdna片段或itsrdna片段。在一个实施方案中，通过变性梯度凝胶电泳(dgge)的方法对微生物组进行指纹分析，其中扩增的rdna片段通过它们变性的位置进行分选，并在凝胶中形成独特带型，其可用于比较同一只禽类随着时间推移或的微生物组或多只禽类的微生物组。在另一个实施方案中，通过末端限制性片段长度多态性(t-rflp)的方法对微生物组进行指纹分析，其中使用限制酶消化标记的pcr片段，且然后按大小分选。在另一实施方案中，通过非度数多维评级(nmds)排序评价从t-rflp方法收集的数据，并且permanova统计学鉴定微生物组中的差异，从而允许鉴定和测量微生物组中的改变。还参见shanks等人(2011.appl.environ.microbiol.77(9):2992-3001)；petri等人(2013.plosone.8(12):e83424)；以及menezes等人(2011.femsmicrobiol.ecol.78(2):256-265)。

在一些实施方案中，本公开的微生物的施用产生微生物组的调节或改变，这进一步产生所需的表型或改善的性状。

在一些实施方案中，独特物种数目的变异性降低是小肠中独特微生物物种的总数减少至25与500、25与400、25与350、25与300、25与200、25与100、25与50、50与500、50与400、50与300、50与200、50与100、100与500、100与400、100与300、100与200、200与500、200与400、200与300、300与500、300与400或400至500物种之间。

mic评分

根据本文提供的方法，对样品进行加工以检测所述样品中一种或多种微生物类型的存在(图1，1001；图2，2001)。确定所述样品中一种或多种微生物生物体的绝对数量(图1，1002；图2，2002)。确定一种或多种生物体类型的存在和至少一种生物体类型的绝对数量可并行或连续进行。例如，在包含含有细菌(即，一种微生物类型)和真菌(即，第二微生物类型)的微生物群落的样品的情况下，在一个实施方案中，使用者检测所述样品中一种或两种生物体类型的存在(图1，1001；图2，2001)。在另一实施方案中，使用者确定所述样品中的至少一种生物体类型的绝对数量-在此实例的情况下，所述样品中的细菌、真菌或其组合的数量(图1，1002；图2，2002)。

在一个实施方案中，将所述样品或其一部分进行流式细胞术(fc)分析以检测一种或多种微生物类型的存在和/或数量(图1，1001、1002；图2，2001、2002)。在一个流式细胞仪实施方案中，单独微生物细胞以至少约300*s^-1、或至少约500*s^-1或至少约1000*s^-1的速率通过照明区。然而，本领域普通技术人员将认识到，此速率可根据所采用的仪器类型而变化。电子门控的探测器测量表示散射光的程度的脉冲的幅值。这些脉冲的幅值被电子地分类成“频段”或“信道”，从而允许展示具有某种定量性质(例如，细胞染色性质、直径、细胞膜)的细胞的数量对信道数量的直方图。这种分析允许确定每个“频段”中的细胞数量，在本文所述的实施方案中，所述“频段”是“微生物类型”频段，例如，细菌、真菌、线虫、原生动物、古细菌、藻类、甲藻、病毒、类病毒等。

在一个实施方案中，用一种或多种荧光染料对样品进行染色，其中荧光染料对特定微生物类型具有特异性，以便能够通过流式细胞仪或利用荧光的一些其他检测和定量方法(如荧光显微术)检测。所述方法可提供样品中给定生物体类型的细胞数量和/或细胞体积的定量。在另一个实施方案中，如本文所述，利用流式细胞术来确定生物体类型的独特第一标记和/或独特第二标记的存在和数量，如酶表达、细胞表面蛋白质表达等。还可产生例如光散射对来自细胞膜染色的荧光(相对于来自蛋白质染色或dna染色的荧光)的二或三变量直方图或等值线图，并且因此可获得对作为整体的群体中的细胞之中的多种目标性质的分布的印象。这种多参数流式细胞术数据的许多显示是常用的，并且适合与本文所述的方法一起使用。

在加工样品以检测一种或多种微生物类型的存在和数量的一个实施方案中，采用显微镜测定(图1，1001、1002)。在一个实施方案中，显微术是光学显微术，其中可见光和透镜系统用于放大小样品的图像。数字图像可通过电荷耦合器件(ccd)相机捕获。其他显微技术包括但不限于扫描电子显微镜和透射电子显微镜。根据本文提供的方面可视化并量化微生物类型。

在另一个实施方案中，为了检测一种或多种微生物类型的存在和数量，对样品或其一部分进行荧光显微镜检查。不同的荧光染料可用于直接染色样品中的细胞并使用落射荧光显微镜以及上述流式细胞术来定量总细胞计数。用于定量微生物的有用染料包括但不限于吖啶橙(ao)、4,6-二氨基-2-苯基吲哚(dapi)和氯化5-氰基-2,3-二甲苯基四唑鎓(ctc)。可通过存活力染色方法如含有两种核酸染色的细菌存活力试剂盒(bac-light^tm)来估计活细胞：绿色荧光syto9^tm染料渗透所有膜，并且红色荧光碘化丙啶(pi)染料渗透细胞膜受损的细胞。因此，具有受损细胞膜的细胞将染成红色，而具有未受损细胞膜的细胞将染成绿色。荧光原位杂交(fish)扩展了落射荧光显微镜，从而允许快速检测和计数特定生物体。fish使用荧光标记的寡核苷酸探针(通常15-25个碱基对)，所述探针特异性地结合至样品中的生物体dna，从而允许使用落射荧光或共聚焦激光扫描显微镜(clsm)可视化细胞。催化的报告基因沉积荧光原位杂交(card-fish)通过使用用辣根过氧化物酶(hrp)标记的寡核苷酸探针来扩增从所研究的微生物获得的信号的强度而改进了fish方法。fish可与其他技术组合以表征微生物群落。一种组合技术是高亲和力肽核酸(pna)-fish，其中探针具有增强的穿透细胞外聚合物质(eps)基质的能力。另一个实例是live/dead-fish，其将细胞存活力试剂盒与fish组合并且已用于评估饮用水分配系统中的消毒效率。

在另一个实施方案中，对样品或其一部分进行拉曼显微光谱分析，以确定微生物类型的存在和至少一种微生物类型的绝对数量(图1，1001-1002；图2，2001-2002)。拉曼显微光谱是一种能够检测和测量单细胞拉曼光谱(scrs)的非破坏性和无标记技术。典型的scrs提供单个细胞的内在生化“指纹”。scrs包含其中的生物分子的丰富信息，包括核酸、蛋白质、碳水化合物和脂质，所述信息能够表征不同细胞种类、生理变化和细胞表型。拉曼显微镜通过不同细胞生物标记的化学键检查激光的散射。scrs是一个单细胞中所有生物分子的光谱的总和，从而指示细胞的表型概况。作为基因表达的结果，细胞表型通常反映基因型。因此，在相同生长条件下，不同的微生物类型给出对应于其基因型的差异的不同scrs，并且因此可通过它们的拉曼光谱来鉴定。

在另一个实施方案中，对样品或其一部分进行离心，以确定微生物类型的存在和至少一种微生物类型的数量(图1，1001-1002；图2，2001-2002)。此过程通过使用由离心机产生的离心力来沉降不均匀的混合物。混合物中较致密的组分迁移远离离心轴，而混合物中不太致密的组分向离心轴迁移。离心可允许将样品分级成细胞质、细胞膜和细胞外部分。它还可用于确定目标生物分子的定位信息。另外，离心可用于分级分离总微生物群落dna。不同原核组在其dna的鸟嘌呤加胞嘧啶(g+c)含量方面不同，因此基于g+c含量的密度-梯度离心是用于区分生物类型和与每种类型相关的细胞的数量的方法。所述技术产生整个群落dna的分级分离概况，并指示作为g+c含量的函数的dna丰度。将总群落dna物理分离成高度纯化的部分，每个部分代表可通过另外的分子技术(如变性梯度凝胶电泳(dgge)/扩增核糖体dna限制性分析(ardra)(参见本文的论述))进行分析的不同g+c含量，以评估总微生物群落多样性和一种或多种微生物类型的存在/数量。

在另一个实施方案中，对样品或其一部分进行染色，以确定微生物类型的存在和至少一种微生物类型的数量(图1，1001-1002；图2，2001-2002)。染色和染料可用于可视化细胞内的生物组织、细胞或细胞器。染色可与显微镜、流式细胞术或凝胶电泳结合使用，以可视化或标记不同微生物类型所特有的细胞或生物分子。体内染色是染色活组织的过程，而体外染色涉及染色已从其生物学背景中除去的细胞或结构。与本文描述的方法一起使用的特定染色技术的实例包括但不限于：用于确定细菌克状态的革兰氏染色，用于鉴定内生孢子存在的内生孢子染色，ziehl-neelsen染色，用于检查薄组织切片的苏木精和曙红染色，用于检查来自各种身体分泌物的细胞样品的巴氏(papanicolaou)染色，碳水化合物的高碘酸-希夫染色，采用三色染色方案来区分细胞与周围结缔组织的masson氏三色染色，用于检查血液或骨髓样品的romanowsky染色(或包括wright氏染色、詹纳尔(jenner)染色、迈格林华(may-grunwald染色)、利什曼(leishman)染色和吉姆萨(giemsa染色)的常见变型)，用于揭示蛋白质和dna的银染色，用于脂质的苏丹染色以及用于检测真正内生孢子的conklin染色。常见生物染色剂包括用于细胞周期测定的吖啶橙；用于酸性粘蛋白的俾斯麦棕；用于糖原的胭脂红；用于细胞核的明矾胭脂红；用于蛋白质的考马斯蓝；用于神经元细胞质的酸性组分的甲酚紫；用于细胞壁的结晶紫；用于细胞核的dapi；用于细胞质材料、细胞膜、一些细胞外结构和红细胞的曙红；用于dna的溴化乙锭；用于胶原蛋白、平滑肌或线粒体的酸性品红；用于细胞核的苏木精；用于dna的赫斯特染色剂；用于淀粉的碘；用于吉曼尼兹(gimenez)染色技术中的细菌和用于孢子的孔雀石绿；用于染色质的甲基绿；用于动物细胞的亚甲蓝；用于尼斯尔(nissl)物质的中性红；用于细胞核的尼罗蓝；用于亲脂实体的尼罗红；用于脂质的四氧化锇；罗丹明用于荧光显微术中；用于细胞核的番红精。染色剂也用于透射电子显微术中以增强对比度，并且包括磷钨酸、四氧化锇、四氧化钌、钼酸铵、碘化镉、碳酰肼、氯化铁、六胺、三氯化铟、硝酸镧、醋酸铅、柠檬酸铅、硝酸铅(ii)、高碘酸、磷钼酸、铁氰化钾、亚铁氰化钾、钌红、硝酸银、蛋白质银、氯金酸钠、硝酸铊、氨基硫脲、乙酸铀酰、硝酸铀酰和硫酸氧钒。

在另一个实施方案中，对样品或其一部分进行质谱分析(ms)，以确定微生物类型的存在和至少一种微生物类型的数量(图1，1001-1002；图2，2001-2002)。如下所述，ms也可用于检测样品中一种或多种独特标记的存在和表达(图1，1003-1004；图2，2003-2004)。例如，ms用于检测微生物类型所特有的蛋白质和/或肽标记的存在和数量，且因此提供所述样品中各微生物类型的数量的评估。定量可用稳定同位素标记或无标记。肽的从头测序也可直接从ms/ms谱或序列标记中产生(产生可与针对数据库匹配的短标签)。ms还可揭示蛋白质的翻译后修饰并鉴定代谢物。ms可与色谱和其他分离技术(如气相色谱、液相色谱、毛细管电泳、离子迁移)结合使用，以增强质量分辨率和测定。

在另一个实施方案中，对样品或其一部分进行脂质分析，以确定微生物类型的存在和至少一种微生物类型的数量(图1，1001-1002；图2，2001-2002)。脂肪酸以相对恒定的比例存在于细胞生物质中，并且特征脂肪酸存在于微生物细胞中，其可区分群落内的微生物类型。在一个实施方案中，通过皂化提取脂肪酸，然后衍生化以得到对应脂肪酸甲酯(fame)，其然后通过气相色谱法进行分析。然后将一个实施方案中的fame谱与参考fame数据库进行比较，以通过多变量统计分析鉴定脂肪酸及其相应的微生物特征。

在本文提供的方法的方面中，测量所述样品或其部分中的独特第一标记的数量(例如，样品等分试样)，以及每种独特第一标记的丰度(图1，1003；图2，2003)。独特标记是微生物菌株的标记。本领域普通技术人员应理解，取决于所探测并测量的独特标记，不需要分析整个样品。例如，如果独特标记对细菌菌株是独特的，则不需要分析样品的真菌部分。如上所述，在一些实施方案中，测量样品中一种或多种生物类型的绝对丰度包括通过生物体类型分离(例如，通过流式细胞术)样品。

可在本文中使用生物体菌株独特的任何标记。例如，标记可包括但不限于小亚基核糖体rna基因(16s/18srdna)、大亚基核糖体rna基因(23s/25s/28srdna)、插入5.8s基因、细胞色素c氧化酶、β-微管蛋白、延伸因子、rna聚合酶和内转录间隔区(its)。

核糖体rna基因(rdna)，尤其是小亚基核糖体rna基因(即在真核生物的情况下18srrna基因(18srdna)和在原核生物的情况下的16srrna(16srdna))已成为评估微生物群落中的生物体类型和菌株的主要目标。然而，还已经靶向大亚基核糖体rna基因28srdna。rdna适用于分类学鉴定，因为：(i)它们在所有已知生物体中普遍存在；(ii)它们拥有保守区和可变区；(iii)存在可用于比较的其序列的指数式扩展数据库。在样品的群落分析中，保守区充当相应通用pcr和/或测序引物的退火位点，而可变区可用于系统发生分化。此外，所述细胞中高拷贝数的rdna有助于从环境样品中检测。

还已经靶向位于18srdna与28srdna之间的内部转录间隔区(its)。在核糖体组装之前its被转录但被剪接。its区由两个高度可变的间隔区its1和its2以及插入的5.8s基因组成。这种rdna操纵子在基因组中以多个拷贝出现。因为its区域不编码核糖体组分，所以它是高度可变的。

在一个实施方案中，独特的rna标记可以是mrna标记、sirna标记或核糖体rna标记。

蛋白质编码功能基因在本文中也可用作独特的第一标记。此类标记包括但不限于：重组酶a基因家族(细菌reca、古细菌rada和radb、真核rad51和rad57、噬菌体uvsx)；rna聚合酶β亚基(rpob)基因，其负责转录起始和延伸；分子伴侣。候选标记基因也已针对细菌加古细菌鉴定:核糖体蛋白s2(rpsb)、核糖体蛋白s10(rpsj)、核糖体蛋白l1(rpla)、翻译延伸因子ef-2、翻译起始因子if-2、金属内肽酶、核糖体蛋白l22、ffh信号识别粒子蛋白、核糖体蛋白l4/l1e(rpld)、核糖体蛋白l2(rplb)、核糖体蛋白s9(rpsi)、核糖体蛋白l3(rplc)、苯丙氨酰基-trna合成酶β亚基、核糖体蛋白l14b/l23e(rpln)、核糖体蛋白s5、核糖体蛋白s19(rpss)、核糖体蛋白s7、核糖体蛋白l16/l10e(rplp)、核糖体蛋白s13(rpsm)、苯丙氨酰基-trna合成酶α亚基、核糖体蛋白l15、核糖体蛋白l25/l23、核糖体蛋白l6(rplf)、核糖体蛋白l11(rplk)、核糖体蛋白l5(rple)、核糖体蛋白s12/s23、核糖体蛋白l29、核糖体蛋白s3(rpsc)、核糖体蛋白s11(rpsk)、核糖体蛋白l10、核糖体蛋白s8、trna假尿苷合酶b、核糖体蛋白l18p/l5e、核糖体蛋白s15p/s13e、胆色素原脱氨酶、核糖体蛋白s17、核糖体蛋白l13(rplm)、磷酸核糖基甲酰基甘氨脒环连接酶(rpse)、核糖核酸酶hii和核糖体蛋白l24。细菌的其他候选标记基因包括：转录伸长蛋白nusa(nusa)、rpobdna定向rna聚合酶亚基β(rpob)、gtp结合蛋白enga、rpocdna定向rna聚合酶亚基β'、pria引发体组装蛋白、转录修复偶联因子、ctp合酶(pyrg)、secy前蛋白移位酶亚基secy、gtp结合蛋白obg/cgta、dna聚合酶i、rpsf30s核糖体蛋白s6、poadna定向rna聚合酶亚基α、肽链释放因子1、rpli50s核糖体蛋白l9、聚核糖核苷酸核苷酸基转移酶、tsf延伸因子ts(tsf)、rplq50s核糖体蛋白l17、trna(鸟嘌呤-n(1)-)-甲基转移酶(rpls)、rply可能的50s核糖体蛋白l25、dna修复蛋白rada、葡萄糖抑制的分裂蛋白a、核糖体结合因子a、dna错配修复蛋白mutl、smpbssra-结合蛋白(smpb)、n-乙酰葡糖氨基转移酶、s-腺苷基-甲基转移酶mraw、udp-n-乙酰胞壁酰丙氨酸--d-谷氨酸连接酶、rpls50s核糖体蛋白l19、rplt50s核糖体蛋白l20(rplt)、ruva霍利迪连结体dna解旋酶、ruvb霍利迪连结体dna解旋酶b、sers丝氨酰基-trna合成酶、rplu50s核糖体蛋白l21、rpsr30s核糖体蛋白s18、dna错配修复蛋白muts、rpst30s核糖体蛋白s20、dna修复蛋白recn、frr核糖体再生因子(frr)、重组蛋白recr、未知功能蛋白upf0054、miaatrna异戊烯基转移酶、gtp结合蛋白ychf、染色体复制起始子蛋白dnaa、脱磷-coa激酶、16srrna加工蛋白rimm、atp锥结构域蛋白、1-脱氧-d-木酮糖5-磷酸还原异构酶、2c-甲基-d-赤藓糖醇2,4-环二磷酸合酶、脂肪酸/磷脂合成蛋白plsx、trna(ile)-赖西丁合成酶、dnagdna引发酶(dnag)、ruvc霍利迪连结体解离酶、rpsp30s核糖体蛋白s16、重组酶areca、核黄素生物合成蛋白ribf、甘氨酰基-trna合成酶β亚基、trmutrna(5-甲基氨基甲基-2-硫尿苷酸)-甲基转移酶、rpmi50s核糖体蛋白l35、heme尿卟啉原脱羧酶、棒形测定蛋白、rpma50s核糖体蛋白l27(rpma)、肽基-trna水解酶、翻译起始因子if-3(infc)、udp-n-乙酰基胞壁酰基-三肽合成酶、rpmf50s核糖体蛋白l32、rpil50s核糖体蛋白l7/l12(rpil)、leus亮氨酰基-trna合成酶、liganad-依赖性dna连接酶、细胞分裂蛋白ftsa、gtp结合蛋白typa、atp依赖性clp蛋白酶、atp结合亚基clpx、dna复制和修复蛋白recf和udp-n-乙酰基烯醇丙酮酰基葡萄糖胺还原酶。

根据本文所述的方法，磷脂脂肪酸(plfa)也可用作独特的第一标记。由于plfa在微生物生长过程中快速合成，在细胞死亡过程中未在储存分子中发现并迅速降解，因此它提供了对当前活群落的准确普查。所有细胞都含有脂肪酸(fa)，所述脂肪酸可被提取并酯化以形成脂肪酸甲酯(fame)。当使用气相色谱-质谱法分析fame时，所得到的概况构成样品中微生物的“指纹”。用于结构域细菌和真核生物中的生物体的膜的化学组成包括通过酯型键与甘油连接的脂肪酸(磷脂脂肪酸(plfa))。相反，古细菌的膜脂由长的且支化的烃组成，所述烃通过醚型键(磷脂醚脂质(plel))与甘油连接。这是区分三个结构域的最广泛使用的非遗传标准之一。在这种背景下，源自微生物细胞膜的磷脂(其特征在于不同的酰基链)是优异的特征分子，因为这种脂质结构多样性可与特定微生物分类群相关联。

如本文所提供的，为了确定生物体菌株是否有活性，测量一种或多种独特的第二标记(其可与第一标记相同或不同)的表达水平(图1，1004；图2，2004)。独特的第一独特标记是如上所述。独特的第二标记是微生物活性的标记。例如，在一个实施方案中，上述任何第一标记的mrna或蛋白质表达被认为是用于本发明目的的独特第二标记。

在一个实施方案中，如果第二标记的表达水平高于阈值水平(例如，对照水平)或在阈值水平，所述微生物被认为是有活性的(图1，1005；图2，2005)。如果第二标记的表达水平与阈值水平(其在一些实施方案中是对照水平)相比改变至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％或至少约30％，则在一个实施方案中确定活性。

第二独特标记在一个实施方案中在蛋白质、rna或代谢物水平测量。独特第二标记与第一独特标记相同或不同。

如上所述，可根据本文描述的方法检测许多独特第一标记和独特第二标记。此外，独特第一标记的检测和定量根据本领域普通技术人员已知的方法进行(图1，1003-1004；图2，2003-2004)。

核酸测序(例如，gdna、cdna、rrna、mrna)在一个实施方案中用于确定独特第一标记和/或独特第二标记的绝对丰度。测序平台包括但不限于可从roche/454lifesciences、illumina/solexa、pacificbiosciences、iontorrent以及nanopore获得的sanger测序和高通量测序方法。测序可以是特定dna或rna序列的扩增子测序或全宏基因组/转录组鸟枪测序。

传统sanger测序(sanger等人(1977)dnasequencingwithchain-terminatinginhibitors.procnatl.acad.sci.usa,74,第5463–5467页，其以引用的方式整体并入本文)依赖于在体外dna复制期间通过dna聚合酶选择性并入链终止双脱氧核苷酸，并且适合与本文所述的方法一起使用。

在另一个实施方案中，对样品或其一部分进行核酸提取，用合适的引物扩增目标dna(如rrna基因)和使用测序载体构建克隆文库。然后通过sanger测序对选择的克隆进行测序，并检索目标dna的核苷酸序列，从而允许计算样品中的独特微生物菌株的数量。

来自roche/454lifesciences的454焦磷酸测序产生长读段并且可在本文所述的方法中利用(margulies等人(2005)nature,437,第376-380页；美国专利号6,274,320；6,258,568；6,210,891，其各自出于所有目的整体并入本文)。待测序的核酸(例如，扩增子或雾化的基因组/宏基因组dna)具有通过pcr或通过连接固定在任一端的特异性衔接子。将具有衔接子的dna固定至悬浮在油包水乳液中的微珠粒上(理想地，一个珠粒将具有一个dna片段)。然后执行乳液pcr步骤以产生每个dna片段的多个拷贝，从而产生一组珠粒，其中每个珠粒含有同一dna片段的许多克隆拷贝。然后将每个珠粒置于光纤芯片的孔中，所述光纤芯片还含有边合成边测序反应所必需的酶。碱基(如a、c、g或t)的添加引发焦磷酸释放，所述焦磷酸释放产生闪光，记录所述闪光以推断每个孔中的dna片段的序列。可实现每次运行大约100万个读段，读段长度达1,000个碱基。可进行配对末端测序，其产生成对读段，每对读段开始于给定dna片段的一端。可产生分子条形码并将其置于多重反应中的衔接子序列与目标序列之间，从而允许每个序列生物信息学地分配给样品。

illumina/solexa测序产生约25个碱基对(bp)至约300bp的平均读段长度(bennett等人(2005)pharmacogenomics,6:373-382；lange等人(2014).bmcgenomics15,第63页；fadrosh等人bmcgenomics15,第63页；fadrosh等人(2014)microbiome2,第6页；caporaso等人(2012)ismej,6,第1621-1624页；bentley等人(2008)accuratewholehumangenomesequencingusingreversibleterminatorchemistry.nature,456:53-59)。这种测序技术也是边合成边测序，但使用可逆染料终止子和附接有寡核苷酸场的流动池。待测序的dna片段在任一端上具有特异性衔接子，并且在填充有与所述片段的末端杂交的特定寡核苷酸的流动池上洗涤。然后复制每个片段以产生相同片段的集群。然后在流动池上洗涤可逆的染料-终止子核苷酸，并给予时间附接。洗去过量的核苷酸，对流动池进行成像，并且可除去可逆终止子，以使得所述过程可重复，并且可在随后的循环中继续添加核苷酸。可实现各自长度为300个碱基的配对末端读段。illumina平台可以配对末端方式生成40亿个片段，对于单次运行中的每个读段可生成125个碱基。条形码也可用于样品多路复用，但使用索引引物。

solid(通过寡核苷酸连接和检测测序，lifetechnologies)方法是“连接测序”方法，并且可与本文描述的方法一起用于检测第一标记和/或第二标记的存在和丰度(图1，1003-1004；图2，2003-2004)(peckham等人solid^tmsequencingand2-baseencoding.sandiego,ca:americansocietyofhumangenetics,2007；mitra等人(2013)analysisoftheintestinalmicrobiotausingsolid16srrnagenesequencingandsolidshotgunsequencing.bmcgenomics,14(增刊5):s16；mardis(2008)next-generationdnasequencingmethods.annurevgenomicshumgenet,9:387-402；各自以引用的方式整体并入本文)。从待测序的样品制备dna片段文库，并用于制备克隆珠粒群体，其中在每个磁珠的表面上将仅存在一种物种片段。附着至磁珠的片段将具有通用p1衔接子序列，以使得每个片段的起始序列都是已知的且相同的。引物与文库模板内的p1衔接子序列杂交。一组四个荧光标记的二碱基探针竞争连接至测序引物。通过在每个连接反应中询问每个第一和第二碱基来实现二碱基探针的特异性。进行多个连接、检测和裂解循环，其中循环的数量决定最终阅读长度。solid平台每次运行可产生多达30亿个读段，读段长度为75个碱基。配对末端测序是可用的并且可在本文中使用，但是所述对中的第二读段仅为35个碱基长。样品的多路复用通过类似于illumina所使用的系统的系统是可能的，具有单独的索引运行。

iontorrent系统(如454测序)适合与本文所述的方法一起用于检测第一标记和/或第二标记的存在和丰度(图1，1003-1004；图2，2003-2004)。它使用含有dna片段附接其上的珠粒的微孔的板。然而，它在检测碱基掺入的方式上不同于所有其他系统。当碱基添加至生长dna链时，质子释放，从而轻微改变周围ph。对于ph敏感的微量检测器与板上的孔相关联，并且当这些变化发生时，所述检测器进行记录。不同的碱基(a、c、g、t)依序冲刷通过所述孔，从而允许推断来自每个孔的序列。ionproton平台每次运行可产生高达5000万个读段，其具有200个碱基的读段长度。个人基因组机器平台具有400个碱基的更长读段。可获得双向测序。通过标准的在线分子条形码测序，多路复用是可能的。

pacificbiosciences(pacbio)smrt测序使用单分子实时测序方法，并且在一个实施方案中，与本文所述的方法一起用于检测第一标记和/或第二标记的存在和丰度(图1，1003-1004；图2，2003-2004)。pacbio测序系统不涉及扩增步骤，从而使它有别于其他主要下一代测序系统。在一个实施方案中，所述测序在含有许多零模式波导(zmw)检测器的芯片上执行。dna聚合酶附接至zmw检测器并且当合成dna链时，磷酸连接的染料标记的核苷酸并入得以实时成像。pacbio系统产生非常长的读段长度(平均约4,600个碱基)和每次运行非常高数目的读段(约47,000个)。典型“配对末端”方法不用于pacbio，因为读段通常足够长以致于可经由ccs来覆盖片段多次而无需独立地从每个端测序。使用pacbio的多路复用不涉及独立读段，而是实际上遵循标准“内联”条码模型。

在第一独特标记是its基因组区域的一个实施方案中，在一个实施方案中使用自动核糖体基因间隔区分析(arisa)来确定样品中的微生物菌株的数量和身份(图1，1003；图2，2003)(ranjard等人(2003).environmentalmicrobiology5,第1111-1120页，其出于所有目的以引用的方式整体并入)。its区域在长度和核苷酸序列上具有显著异质性。使用荧光标记的正向引物和自动dna测序仪允许高分离分辨率和高通量。在每个样品中包含内部标准提供了确定总体片段大小的准确性。

在另一个实施方案中，pcr扩增的rdna片段的片段长度多态性(rflp)(也称为扩增的核糖体dna限制性分析(ardra))用于表征样品中的独特第一标记及其丰度(图1，1003；图2，2003)(massol-deya等人(1995)。mol.microb.ecol.manual.3.3.2,第1-18页，其出于所有目的以引用的方式整体并入)。使用通用引物通过pcr生成rdna片段，用限制酶消化，在琼脂糖或丙烯酰胺凝胶中电泳，并用溴化乙锭或硝酸银染色。

用于检测独特第一标记的存在和丰度的一种指纹分析技术是单链构象多态性(sscp)(lee等人(1996).applenvironmicrobiol62,第3112-3120页；scheinert等人(1996).j.microbiol.methods26,第103-117页；schwieger和tebbe(1998).appl.environ.microbiol.64,第4870-4876页，其各自以引用的方式整体并入本文)。在这种技术中，将使用对16srrna基因具有特异性的引物获得的dna片段(如pcr产物)变性，并在非变性凝胶上直接电泳。分离是基于单链dna的大小和折叠构象的差异，其影响电泳迁移率。可通过许多策略防止电泳过程中dna链的再退火，包括在pcr中使用一种磷酸化引物，然后用λ外切核酸酶特异性消化磷酸化链，并使用一种生物素化引物进行变性后的一个单链的磁分离。为了评估给定生物集合体中优势群体的身份，在一个实施方案中，切除条带并进行测序，或者sscp图案可与特异性探针杂交。电泳条件(如凝胶基质、温度和向凝胶中添加甘油)可影响分离。

除了基于测序的方法，其他用于量化第二标记的表达(例如，基因、蛋白质表达)的方法也适合与本文提供的方法一起用于确定一种或多种第二标记的表达水平(图1，1004；图2，2004)。例如，定量rt-pcr、微阵列分析、线性扩增技术如基于核酸序列的扩增(nasba)都适用于本文所述的方法，并且可根据本领域普通技术人员已知的方法来进行。

在另一个实施方案中，对样品或其一部分进行定量聚合酶链式反应(pcr)以检测第一标记和/或第二标记的存在和丰度(图1，1003-1004；图2，2003-2004)。通过将转录的核糖体和/或信使rna(rrna和mrna)逆转录到互补dna(cdna)中、然后进行pcr(rt-pcr)来测量特异性微生物菌株活性。

在另一个实施方案中，对样品或其一部分进行基于pcr的指纹分析技术以检测第一标记和/或第二标记的存在和丰度(图1，1003-1004；图2，2003-2004)。可基于核苷酸组成通过电泳分离pcr产物。不同dna分子之间的序列变异影响解链行为，并且因此具有不同序列的分子将停止在凝胶中的不同位置迁移。因此，电泳概况可由不同条带或峰的位置和相对强度来定义，并且可被转换为数值数据以用于计算多样性指数。也可从凝胶上切下条带，且随后测序以揭示群落成员的系统发生关系。电泳方法包括但不限于：变性梯度凝胶电泳(dgge)、温度梯度凝胶电泳(tgge)、单链构象多态性(sscp)、限制性片段长度多态性分析(rflp)或扩增的核糖体dna限制性分析(ardra)、末端限制性片段长度多态性分析(t-rflp)、自动核糖体基因间间隔区分析(arisa)、随机扩增多态性dna(rapd)、dna扩增指纹分析(daf)以及bb-peg电泳。

在另一个实施方案中，使样品或其一部分经受基于芯片的平台，如微阵列或微流体，以确定独特第一标记的丰度和/或独特第二标记的存在/丰度(图1，1003-1004；图2，2003-2004)。从样品中的总dna扩增pcr产物，并直接与固定至微阵列的已知分子探针杂交。在荧光标记的pcr扩增子与探针杂交后，通过使用共聚焦激光扫描显微镜对阳性信号进行评分。微阵列技术允许通过复制快速评价样品，其是微生物群落分析中的显著优点。通常，微阵列上的杂交信号强度与靶生物体的丰度成正比。通用高密度16s微阵列(phylochip)含有约30,000个16srrna基因探针，所述探针靶向若干培养的微生物物种和“候选物分裂”。这些探针靶向所有121种划定的原核目，并允许同时检测8,741个细菌和古菌分类群。用于分析微生物群落的另一种微阵列是功能基因阵列(fga)。与phylochips不同，fga主要用于检测细菌的特定代谢组。因此，fga不仅揭示群落结构，而且还阐明原位群落代谢潜力。fga含有来自具有已知生物功能的基因的探针，因此它们可用于将微生物群落组成与生态系统功能相联系。称为geochip的fga含有>24,000种来自所有已知代谢基因的探针，所述基因参与各种生物地球化学、生态和环境过程，如氨氧化、甲烷氧化和固氮。

在一个实施方案中，蛋白质表达测定与本文所述的方法一起用于确定一种或多种第二标记的表达水平(图1，1004；图2，2004)。例如，在一个实施方案中，利用质谱法或免疫测定法如酶联免疫吸附测定法(elisa)来定量一种或多种独特第二标记的表达水平，其中所述一种或多种独特第二标记是蛋白质。

在一个实施方案中，使样品或其一部分经受溴脱氧尿苷(brdu)并入以确定第二独特标记的水平(图1，1004；图2，2004)。brdu(一种胸苷的合成核苷类似物)可并入新合成的复制细胞的dna中。然后可使用对brdu具有特异性的抗体来检测碱基类似物。因此，根据本文所述方法的一个实施方案，brdu并入鉴定了活跃复制其dna的细胞(微生物活性的一种量度)。brdu并入可与fish组合使用以提供靶向细胞的身份和活性。

在一个实施方案中，将样品或其一部分进行与fish组合的显微放射自显影术(mar)以确定第二独特标记的水平(图1，1004；图2，2004)。mar-fish是基于将放射性底物并入细胞中、使用放射自显影检测活性细胞和使用fish鉴定细胞。用显微镜进行单细胞分辨率下的活性细胞的检测和鉴定。mar-fish提供关于总细胞、探针靶向的细胞和并入给定放射性标记物质的细胞的百分比的信息。所述方法提供靶向微生物的原位功能的评估并且是用于研究微生物的体内生理学的有效方法。一种被开发用于结合mar-fish定量细胞特异性底物摄取的技术被称为定量mar(qmar)。

在一个实施方案中，将样品或其一部分进行进行与fish组合的稳定同位素拉曼光谱(拉曼-fish)以确定第二独特标记的水平(图1，1004；图2，2004)。这种技术组合稳定同位素探测、拉曼光谱和fish以将代谢过程与特定生物体联系起来。细胞的稳定同位素并入的比例影响光散射，从而导致标记的细胞组分(包括蛋白质和mrna组分)的可测量的峰移位。拉曼光谱可用于鉴定细胞是否合成化合物，包括但不限于：油(如烷烃)、脂质(如三酰基甘油(tag))、特定蛋白质(如血红素蛋白、金属蛋白)、细胞色素(如p450，细胞色素c)、叶绿素、发色团(如用于集光类胡萝卜素和视紫红质的色素)、有机聚合物(如聚羟基链烷酸酯(pha)、聚羟基丁酸酯(phb))、藿烷类、类固醇、淀粉、硫化物、硫酸酯和次级代谢产物(如维生素b12)。

在一个实施方案中，对样品或其一部分进行dna/rna稳定同位素探测(sip)以确定第二独特标记的水平(图1，1004；图2，2004)。sip能够确定与特定代谢途径相关的微生物多样性，并且通常用于研究涉及碳和氮化合物利用的微生物。将目标底物用稳定同位素(如13c或15n)标记并添加到样品中。仅能够代谢底物的微生物将其并入它们的细胞中。随后，13c-dna和15n-dna可通过密度梯度离心分离并用于宏基因组分析。基于rna的sip可以是用于sip研究的响应性生物标记，因为rna本身是细胞活性的反映。

在一个实施方案中，使样品或其一部分经受同位素阵列以确定第二独特标记的水平(图1，1004；图2，2004)。同位素阵列允许以高通量方式对活性微生物群落进行功能和系统发生筛选。所述技术使用sip的组合来监测底物摄取概况和微阵列技术来确定活性微生物群落的分类身份。将样品与14c标记的底物一起孵育，所述底物在生长过程期间变得并入微生物生物质中。将14c标记的rrna与未标记的rrna分离且然后用荧光染料标记。将荧光标记的rrna与系统发生微阵列杂交，然后扫描放射性和荧光信号。因此，所述技术允许通过复杂微生物群落的代谢活性微生物同时研究微生物群落组成和特定底物消耗。

在一个实施方案中，对样品或其一部分进行代谢组学测定以确定第二独特标记的水平(图1，1004；图2，2004)。代谢组学研究代谢组，其代表生物细胞、组织、器官或生物体中的所有代谢物、细胞过程的最终产物的集合。所述方法可用于监测微生物和/或微生物介导的过程的存在，因为它允许将特定代谢物概况与不同的微生物相关联。可使用诸如气相色谱-质谱(gc-ms)的技术获得与微生物活性相关的细胞内和细胞外代谢物的概况。代谢组学样品的复杂混合物可通过诸如气相色谱、高效液相色谱和毛细管电泳的技术分离。代谢物的检测可通过质谱、核磁共振(nmr)光谱、离子迁移谱、电化学检测(与hplc结合)和放射性标记(当与薄层色谱组合时)进行。

根据本文描述的实施方案，确定样品中一种或多种活性微生物菌株的存在和相应数量(图1，1006；图2，2006)。例如，对从测定第一标记的数量和存在获得的菌株身份信息进行分析，以确定存在独特第一标记的出现次数，从而代表独特的微生物菌株(例如，通过计数测序测定中的序列读段的数量)。这一值可在一个实施方案中表示为第一标记的总序列读段的百分比，以给出特定微生物类型的独特微生物菌株的百分比。在另一实施方案中，将此百分比乘以微生物类型的数量(在步骤1002或2002获得，参见图1和图2)以给出样品和给定体积中一种或多种微生物菌株的绝对丰度。

如果阈值水平的第二独特标记表达的水平高于阈值，例如，与对照水平相比高至少约5％、至少约10％、至少约20％或至少约30％，则如上所述，所述一种或多种微生物菌株被认为是活性的。

在本发明的另一个方面，在多个样品中测定用于确定一种或多种微生物菌株的绝对丰度的方法(图2，特别是参见，2007)。对于被分类为活性的微生物菌株，其仅需要在样品中的一个中有活性。所述样品可从同一来源在多个时间点内取得，或者可来自不同的环境来源(例如，不同的动物)。

在一个实施方案中，使用样品上的绝对丰度值来将一种或多种活性微生物菌株与环境参数相关联(图2，2008)。在一个实施方案中，环境参数是第二活性微生物菌株的存在。在一个实施方案中，通过相关性或通过网络分析确定菌株和参数的共现来进行将一种或多种活性微生物菌株与环境参数相关联。

在一个实施方案中，确定一种或多种活性微生物菌株与环境参数的共现包括网络和/或聚类分析方法，以测量菌株或菌株与网络内的环境参数的连通性，其中所述网络是共享共同或类似环境参数的两种或更多种样品的集合。在另一个实施方案中，网络和/或聚类分析方法可应用于确定样品中的两种或更多种活性微生物菌株的共现(图2，2008)。在另一个实施方案中，网络分析包括非参数方法，包括用于在变量之间建立连通性的交互信息。在另一个实施方案中，网络分析包括链接分析、模块性分析、稳健性度量、中间性度量、连通性度量、传递性度量、中心性度量或其组合(图2，2009)。在另一个实施方案中，聚类分析方法包括构建连通性模型、子空间模型、分布模型、密度模型或质心模型和/或使用群落检测算法，如louvain、bron-kerbosch、girvan-newman、clauset-newman-moore、pons-latapy以及wakita-tsurumi算法(图2，2010)。

在一个实施方案中，聚类分析方法是基于模块性优化的启发性方法。在另一实施方案中，聚类分析方法是louvain方法。参见，例如，由blondel等人(2008).fastunfoldingofcommunitiesinlargenetworks.journalofstatisticalmechanics:theoryandexperiment,第2008卷,2008年10月所描述的方法，其出于所有目的以引用的方式整体并入本文。

在另一个实施方案中，网络分析包括通过链接挖掘和预测、集体分类、基于链接的聚类、关系相似性或其组合的网络预测建模。在另一个实施方案中，网络分析包括基于微分方程的群体建模。在另一个实施方案中，网络分析包括lotka-volterra建模。

在一个实施方案中，将样品中的一种或多种活性微生物菌株与环境参数相关联(例如，确定共现)包括创建填充有表示环境参数和微生物菌株关联的链接的矩阵。

在一个实施方案中，对在步骤2007获得的多个样品数据进行编译(例如，在两种或更多种样品上，所述样品可在两个或更多个时间点收集，其中每个时间点对应于单独样品)。在另一实施方案中，将每个样品中的一种或多种微生物菌株中的每一种的细胞数量存储在关联矩阵中(其在一些实施方案中可以是丰度矩阵)。在一个实施方案中，关联矩阵用于使用通过关联(例如，丰度)数据加权的规则挖掘方法来鉴定特定时间点样品中的活性微生物菌株之间的关联。在一个实施方案中应用过滤器以删除不重要的规则。

在一个实施方案中，将一种或多种或两种或更多种活性微生物菌株的绝对丰度例如通过共现确定与一种或多种环境参数相关联(图2，2008)。用户根据待分析的一种或多种样品选择环境参数，并且不受本文所述方法的限制。环境参数可以是样品本身的参数，例如，ph、温度、样品中蛋白质的量。或者，环境参数是影响微生物群落的身份变化的参数(即，其中微生物群落的“身份”通过微生物菌株的类型和/或群落中特定微生物菌株的数量进行表征)，或受微生物群落的身份变化的影响。例如，在一个实施方案中，环境参数是动物的食物摄入量或家禽的产蛋量。在一个实施方案中，环境参数是存在于同一样品中的微生物群落中的第二微生物菌株的存在、活性和/或丰度。

在本文描述的一些实施方案中，环境参数被称为元数据参数。

元数据参数的其他实例包括但不限于来自获得样品的宿主的遗传信息(例如，dna突变信息)、样品ph、样品温度、特定蛋白质或mrna的表达、营养条件(例如，周围环境/生态系统的一种或多种营养素的水平和/或身份)、对疾病的易感性或抗性、疾病的发生或进展、样品对毒素的易感性或抗性、异型生物质化合物(药物)的功效、天然产物的生物合成或其组合。

例如，根据一个实施方案，根据图2(即，2001-2007)的方法计算多个样品上的微生物菌株数量变化。对一种或多种活性菌株随时间推移的菌株数量变化进行编译(例如，根据步骤2006最初被鉴定为活性的一种或多种菌株)，并注意变化的方向性(即，负值表示减少，正值表示增加)。将随时间推移的细胞数量表示为网络，其中微生物菌株代表节点，并且丰度加权规则代表边缘。利用马尔可夫链和随机游走来确定节点之间的连通性并定义集群。使用元数据过滤一个实施方案中的集群，以便鉴定与期望的元数据相关联的集群(图2，2008)。

在另一个实施方案中，通过整合随时间推移的细胞数量变化和靶集群中存在的菌株，根据重要性对微生物菌株进行排序，其中细胞数的最高变化排序最高。

在一个实施方案中，网络和/或聚类分析方法用于测量网络内的一种或多种菌株的连通性，其中网络是共享共同或类似环境参数的两个或更多个样品的集合。在一个实施方案中，网络分析包括链接分析、模块性分析、稳健性度量、中间性度量、连通性度量、传递性度量、中心性度量或其组合。在另一个实施方案中，网络分析包括通过链接挖掘和预测、社会网络理论、集体分类、基于链接的聚类、关系相似性或其组合的网络预测建模。在另一个实施方案中，网络分析包括基于微分方程的群体建模。在另一个实施方案中，网络分析包括lotka-volterra建模。

聚类分析方法包括构建连通性模型、子空间模型、分布模型、密度模型或质心模型。

例如，用于执行图2的方法步骤2008的基于网络和集群的分析可通过模块进行。如本文所用，模块可以是例如任何组件、指令和/或一组可操作地耦合的电子组件，并且可包括例如存储器、处理器、电迹线、光学连接器、软件(在硬件中执行)和/或类似物。

网络分析

在一个实施方案中，网络和/或聚类分析方法用于测量网络内的一种或多种菌株的连通性，其中网络是共享共同或类似环境参数的两个或更多个样品的集合。在一个实施方案中，网络分析包括链接分析、模块性分析、稳健性度量、中间性度量、连通性度量、传递性度量、中心性度量或其组合。在另一个实施方案中，网络分析包括通过链接挖掘和预测、社会网络理论、集体分类、基于链接的聚类、关系相似性或其组合的网络预测建模。在另一个实施方案中，网络分析包括交互信息、最大信息系数(mic)计算或变量之间的其他非参数方法以建立连通性。在另一个实施方案中，网络分析包括基于微分方程的群体建模。在另一个实施方案中，网络分析包括lotka-volterra建模。

环境参数可以是样品本身的参数，例如，ph、温度、样品中蛋白质的量。或者，环境参数是影响微生物群落的身份变化的参数(即，其中微生物群落的“身份”通过微生物菌株的类型和/或群落中特定微生物菌株的数量进行表征)，或受微生物群落的身份变化的影响。例如，在一个实施方案中，环境参数是动物的食物摄入量或产蛋量。在一个实施方案中，环境参数是存在于同一样品中的微生物群落中的第二微生物菌株的存在、活性和/或丰度。在一些实施方案中，环境参数被称为元数据参数。

元数据参数的其他实例包括但不限于来自获得样品的宿主的遗传信息(例如，dna突变信息)、样品ph、样品温度、特定蛋白质或mrna的表达、营养条件(例如，周围环境/生态系统的一种或多种营养素的水平和/或身份)、对疾病的易感性或抗性、疾病的发生或进展、样品对毒素的易感性或抗性、异型生物质化合物(药物)的功效、天然产物的生物合成或其组合。

家禽病原体抗性和清除率

在一些方面，本公开涉及将本文所述的一种或多种微生物组合物施用至家禽以清除胃肠道的病原微生物。在一些实施方案中，本公开进一步涉及施用本文所述的微生物组合物以防止胃肠道中病原微生物的定殖。在一些实施方案中，本文所述的微生物组合物的施用进一步清除来自家禽的外皮和呼吸道的病原体，和/或防止外皮上和呼吸道中的病原体的定殖。在一些实施方案中，本文所述的微生物组合物的施用降低肠漏症/肠道渗透性、炎症和/或肝脏疾病的发生率。在一些实施方案中，施用本文所述的微生物组合物促进免疫系统的发育。

在一些实施方案中，本公开的微生物组合物包含以小于15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％或0.01％的相对丰度存在于家禽的胃肠道中的一种或多种微生物。

在一些实施方案中，在施用本公开的微生物组合物之后，所述一种或多种微生物以至少0.5％、1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的相对丰度存在于家禽的胃肠道中。

家禽的病原微生物包括以下：鸡毒支原体、火鸡支原体、滑液囊支原体、产气荚膜梭菌、鹑梭菌、肉毒梭菌、伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、肠道沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、鸡沙门氏菌、禽嗜血杆菌、猪丹毒杆菌、空肠弯曲杆菌、大肠弯曲杆菌、红嘴鸥弯曲杆菌、单核细胞增多性李斯特氏菌、布氏弓形杆菌、鸟型结核分支杆菌以及大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌的致病菌株。在一些实施方案中，病原微生物包括病毒病原体。在一些实施方案中，病原微生物对家禽和人都是病原性的。在一些实施方案中，病原微生物对家禽或人都是病原性的。

在一些实施方案中，向家禽施用本公开的组合物调节胃肠微生物组的构成，以使得所施用的微生物胜过胃肠道中存在的微生物病原体。在一些实施方案中，向具有微生物病原体的家禽施用本公开的组合物胜过所述病原体并清除家禽的病原体。在一些实施方案中，本公开的组合物的施用刺激宿主免疫，并有助于清除微生物病原体。在一些实施方案中，本公开的组合物的施用引入产生抑菌和/或杀菌组分的微生物，所述组分减少或清除家禽的微生物病原体。在一些实施方案中，本公开的组合物的施用引入调节胃肠道的ph、营养物可用性、矿物质组成和/或维生素组成的微生物。在一些实施方案中，本公开的组合物的施用引入增加胃肠ph的微生物，从而产生病原体生长的抑制。在一些实施方案中，本公开的组合物的施用引入降低胃肠ph的微生物，从而产生病原体生长的抑制。

在一些实施方案中，在施用本公开的一种或多种组合物后，用微生物定殖者或微生物病原体激发家禽可防止微生物定殖者或微生物病原体生长至大于15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％或0.01％的相对丰度。在其他实施方案中，在施用本公开的一种或多种组合物后，用微生物定殖者或微生物病原体激发家禽可防止微生物定殖者或微生物病原体定殖家禽。

在一些实施方案中，微生物定殖者或微生物病原体的清除在施用本公开的一种或多种组合物后少于25天、少于24天、少于23天、少于22天、少于21天、少于20天、少于19天、少于18天、少于17天、少于16天、少于15天、少于14天、少于13天、少于12天、少于11天、少于10天、少于9天、少于8天、少于7天、少于6天、少于5天、少于4天、少于3天或少于2天内发生。

在一些实施方案中，微生物定殖者或微生物病原体的清除在施用本公开的一种或多种组合物后1-30天、1-25天、1-20天、1-15天、1-10天、1-5天、5-30天、5-25天、5-20天、5-15天、5-10天、10-30天、10-25天、10-20天、10-15天、15-30天、15-25天、15-20天、20-30天、20-25天或25-30天内发生。

改善的形状

在一些方面，本公开涉及向家禽施用本文所述的微生物组合物以改善一种或多种合乎需要的性状，如调节体重、肌肉组织、肉质特性、蛋量、蛋重、蛋体积、蛋品质、蛋壳密度、消化化学、饲料利用和消化效率、粪便排出量、甲烷产量、整体禽类健康、病原微生物定殖的预防和病原微生物的清除的方面。在一些方面，性状的改善包括家禽或家禽的蛋的先天性免疫应答的改善。在一些方面，改善的先天性免疫应答是家禽或家禽的蛋中溶菌酶、类固醇、抗生物素蛋白、脱辅基蛋白、卵类粘蛋白、卵粘蛋白、卵黄素蛋白、卵抑制剂和伴清蛋白的增加或减少。在某些方面，性状的改善包括孵化成功率提高、正常雏鸡形态发生率提高、胚胎存活率提高、雏鸡和或胚胎的生长速率提高、雏鸡和家禽的总体重增加以及蛋清蛋白增加或减少。

在一些方面，一种或多种合乎需要的性状的改善是通过施用本文所述的微生物组合物在家禽中改善2、3、4、5、6、7、8、9或10种所需性状。

在一些实施方案中，相对于尚未施用本公开的组合物的动物，蛋量的增加是至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个蛋的增加。在一些实施方案中，相对于尚未施用本公开的组合物的动物，蛋量的增加是少于2、3、4、5、6、7、8、9或10个蛋的增加。在一些实施方案中，相对于尚未施用本公开组合物的动物，蛋量的增加是至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％或200％的增加。

在一些实施方案中，相对于尚未施用本公开组合物的动物，蛋体积的增加是至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的增加。在一些实施方案中，相对于尚未施用本公开组合物的动物，蛋体积的增加是少于5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的增加。

在一些实施方案中，相对于尚未施用本公开组合物的动物，粪便排出量被降低至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在一些实施方案中，相对于尚未施用本公开组合物的动物，粪便排出量被降低少于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。

在一些实施方案中，相对于尚未施用本公开组合物的家禽，已经施用本公开的组合物的家禽表现出至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的重量增加。

在一些实施方案中，相对于尚未施用本公开组合物的家禽，已经施用本公开的组合物的家禽表现出至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的重量增加。

在一些实施方案中，相对于尚未施用本公开组合物的家禽，已经施用本公开的组合物的家禽表现出至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的饲料转化率下降。

在一些实施方案中，相对于尚未施用本公开组合物的家禽，已经施用本公开的组合物的家禽表现出至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的饲料转化率下降。

在一些实施方案中，相对于尚未施用本公开组合物的家禽，已经施用本公开的组合物的家禽表现出至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的胃肠道中引起坏死性肠炎的细菌数量的减少。

在一些实施方案中，相对于尚未施用本公开组合物的家禽，已经施用本公开的组合物的家禽表现出至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的胃肠道中引起坏死性肠炎的细菌数量的减少。

在一些实施方案中，相对于尚未施用本公开组合物的家禽，已经施用本公开的组合物的家禽表现出至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的胃肠道中病原菌数量的减少。

在一些实施方案中，相对于尚未施用本公开组合物的家禽，已经施用本公开的组合物的家禽表现出至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的胃肠道中人病原菌数量的减少。

在一些实施方案中，相对于尚未施用本公开组合物的家禽，已经施用本公开的组合物的家禽表现出至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的胃肠道中家禽病原菌数量的减少。

在一些实施方案中，相对于尚未施用本公开组合物的家禽群，已经施用本公开的组合物的一个或多个家禽群表现出至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的变异系数下降。

在一些实施方案中，相对于尚未施用本公开组合物的家禽群，已经施用本公开的组合物的一个或多个家禽群表现出群均一性增加至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。

在一些实施方案中，相对于尚未施用本公开组合物的家禽群，已经施用本公开的组合物的一个或多个家禽群表现出死亡率降低至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。

在一些实施方案中，需要改善由家禽产生的蛋，其中所述蛋包含甘油三酯、三酰基甘油酯、二酰基甘油酯、单酰基甘油酯、磷脂、胆固醇、糖脂和游离脂肪酸。在其他实施方案中，游离脂肪酸包括短链脂肪酸(即c4:0、c6:0和c8:0)、中链脂肪酸(即，c10:0、c10:1、c12:0、c14:0、c14:1和c15:0)和长链脂肪酸(即，c16:0、c16:1、c17:0、c17:1、c18:0、c18:1、c18:2、c18:3以及c20:0)。

在一些实施方案中，需要提高由家禽产生的蛋中维生素的量或浓度。在蛋中发现的维生素包括b1、b2、b3、b5、b6、b12、胆碱、生物素和叶酸。

在一些实施方案中，需要提高由家禽产生的蛋中矿物质的量或浓度。在蛋中发现的矿物质包括磷、碘、硒和钙。在蛋中可发现痕量的以下各项：钡、铜、铁、锰、镍、铅、硒、锶、钒、硒、铷以及锌。

在一些实施方案中，希望提高或降低钙、磷、镁、甘油三酯、胆固醇和糖类的鸡血清水平。这些血清组分的调节影响蛋性状，如厚度、孔隙度、密度、营养含量、所希望的味道、脂肪含量、胆固醇含量和着色。

在一些实施方案中，希望提高动物饲料的效率和消化率。在一些实施方案中，希望增加来自动物饲料的木质纤维素组分的降解。木质纤维素组分包括木质素、纤维素和半纤维素。

在一些实施方案中，希望增加胃肠道中脂肪酸的浓度。脂肪酸包括乙酸、丙酸和丁酸。在一些实施方案中，希望维持胃肠道中的ph平衡以防止有益微生物生物集合体的破坏。在一些实施方案中，希望增加胃肠道中乳酸的浓度。乳酸降低周围环境的ph，包括可破坏微生物质子动力的细胞内ph。乳酸还可使革兰氏阴性细菌的外膜透化，以使得它们表现出对抗微生物剂的易感性增加。

在一些实施方案中，希望减少由家禽产生的甲烷和粪肥的量。

在一些实施方案中，希望产生的总粪肥量的减少。在其他实施方案中，希望所产生的总粪肥中磷和/或氮的总量减少。

在一些实施方案中，希望改善采食量。在一些实施方案中，希望提高由家禽摄取的饲料和/或干物质的氮利用效率。

在一些实施方案中，本公开的改善的性状是施用当前描述的微生物组合物的结果。据认为，所述微生物组合物调节家禽的微生物组，以使得胃肠道的一种或多种元素的生物化学以与尚未施用本公开的微生物组合物的家禽的胃肠道相比，胃肠液体和固体基质更有效且更完全地降解成子组分和代谢物的这样一种方式改变。

在一些实施方案中，效率的提高和胃肠基质的降解的增加产生本公开的改善的性状的增加。

在一些实施方案中，相对于尚未施用本公开的一种或多种微生物组合物的动物，本公开的任何一种或多种性状的改善是约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、约30％、约31％、约32％、约33％、约34％、约35％、约36％、约37％、约38％、约39％、约40％、约41％、约42％、约43％、约44％、约45％、约46％、约47％、约48％、约49％、约50％、约51％、约52％、约53％、约54％、约55％、约56％、约57％、约58％、约59％、约60％、约61％、约62％、约63％、约64％、约65％、约66％、约67％、约68％、约69％、约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％的变化。

在一些实施方案中，相对于尚未施用本公开的一种或多种微生物组合物的动物，本公开的任何一种或多种性状的改善是至少0.1％、至少0.2％、至少0.3％、至少0.4％、至少0.5％、至少0.6％、至少0.7％、至少0.8％、至少0.9％、至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％、至少21％、至少22％、至少23％、至少24％、至少25％、至少26％、至少27％、至少28％、至少29％、至少30％、至少31％、至少32％、至少33％、至少34％、至少35％、至少36％、至少37％、至少38％、至少39％、至少40％、至少41％、至少42％、至少43％、至少44％、至少45％、至少46％、至少47％、至少48％、至少49％、至少50％、至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％的变化。

在一些实施方案中，相对于尚未施用本公开的一种或多种微生物组合物的动物，本公开的任何一种或多种性状的增加是约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、约30％、约31％、约32％、约33％、约34％、约35％、约36％、约37％、约38％、约39％、约40％、约41％、约42％、约43％、约44％、约45％、约46％、约47％、约48％、约49％、约50％、约51％、约52％、约53％、约54％、约55％、约56％、约57％、约58％、约59％、约60％、约61％、约62％、约63％、约64％、约65％、约66％、约67％、约68％、约69％、约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％的增加。

在一些实施方案中，相对于尚未施用本公开的一种或多种微生物组合物的动物，本公开的任何一种或多种性状的增加是至少0.1％、至少0.2％、至少0.3％、至少0.4％、至少0.5％、至少0.6％、至少0.7％、至少0.8％、至少0.9％、至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％、至少21％、至少22％、至少23％、至少24％、至少25％、至少26％、至少27％、至少28％、至少29％、至少30％、至少31％、至少32％、至少33％、至少34％、至少35％、至少36％、至少37％、至少38％、至少39％、至少40％、至少41％、至少42％、至少43％、至少44％、至少45％、至少46％、至少47％、至少48％、至少49％、至少50％、至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％的增加。

在一些实施方案中，相对于尚未施用本公开的一种或多种微生物组合物的动物，本公开的任何一种或多种性状的减少是约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、约30％、约31％、约32％、约33％、约34％、约35％、约36％、约37％、约38％、约39％、约40％、约41％、约42％、约43％、约44％、约45％、约46％、约47％、约48％、约49％、约50％、约51％、约52％、约53％、约54％、约55％、约56％、约57％、约58％、约59％、约60％、约61％、约62％、约63％、约64％、约65％、约66％、约67％、约68％、约69％、约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％的减少。

在一些实施方案中，相对于尚未施用本公开的一种或多种微生物组合物的动物，本公开的任何一种或多种性状的减少是至少0.1％、至少0.2％、至少0.3％、至少0.4％、至少0.5％、至少0.6％、至少0.7％、至少0.8％、至少0.9％、至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％、至少21％、至少22％、至少23％、至少24％、至少25％、至少26％、至少27％、至少28％、至少29％、至少30％、至少31％、至少32％、至少33％、至少34％、至少35％、至少36％、至少37％、至少38％、至少39％、至少40％、至少41％、至少42％、至少43％、至少44％、至少45％、至少46％、至少47％、至少48％、至少49％、至少50％、至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％的减少。

在一些实施方案中，在施用本公开的一种或多种微生物和/或生物集合体后，家禽的胃肠道的绒毛的直径和/或长度增加。

在一些实施方案中，在施用本公开的一种或多种微生物和/或生物集合体后，家禽的胃肠道的绒毛的直径和/或长度增加至少1μm、至少2μm、至少3μm、至少4μm、至少5μm、至少6μm、至少7μm、至少8μm、至少9μm、至少10μm、至少11μm、至少12μm、至少13μm、至少14μm、至少15μm、至少16μm、至少17μm、至少18μm、至少18μm、至少20μm、至少21μm、至少22μm、至少23μm、至少24μm、至少25μm、至少30μm、至少35μm、至少40μm、至少45μm、至少50μm、至少55μm、至少60μm、至少65μm、至少70μm、至少75μm、至少80μm、至少85μm、至少90μm、至少95μm、至少100μm、至少110μm、至少120μm、至少130μm、至少140μm、至少150μm、至少160μm、至少170μm、至少180μm、至少190μm或至少200μm。

在一些实施方案中，在施用本公开的一种或多种微生物和/或生物集合体后，家禽的胃肠道的绒毛的直径和/或长度小于1μm、小于2μm、小于3μm、小于4μm、小于5μm、小于6μm、小于7μm、小于8μm、小于9μm、小于10μm、小于11μm、小于12μm、小于13μm、小于14μm、小于15μm、小于16μm、小于17μm、小于18μm、小于18μm、小于20μm、小于21μm、小于22μm、小于23μm、小于24μm、小于25μm、小于30μm、小于35μm、小于40μm、小于45μm、小于50μm、小于55μm、小于60μm、小于65μm、小于70μm、小于75μm、小于80μm、小于85μm、小于90μm、小于95μm、小于100μm、小于110μm、小于120μm、小于130μm、小于140μm、小于150μm、小于160μm、小于170μm、小于180μm、小于190μm或小于200μm。

在一些实施方案中，在施用本公开的一种或多种微生物和/或生物集合体后，家禽的回肠或回肠组织变薄。回肠组织被定义为回肠的组织，其横跨管腔至基底膜。

在一些实施方案中，在施用本公开的一种或多种微生物和/或生物集合体后，家禽的回肠或回肠组织变薄至少1μm、至少2μm、至少3μm、至少4μm、至少5μm、至少6μm、至少7μm、至少8μm、至少9μm、至少10μm、至少11μm、至少12μm、至少13μm、至少14μm、至少15μm、至少16μm、至少17μm、至少18μm、至少18μm、至少20μm、至少21μm、至少22μm、至少23μm、至少24μm、至少25μm、至少30μm、至少35μm、至少40μm、至少45μm、至少50μm、至少55μm、至少60μm、至少65μm、至少70μm、至少75μm、至少80μm、至少85μm、至少90μm、至少95μm、至少100μm、至少110μm、至少120μm、至少130μm、至少140μm、至少150μm、至少160μm、至少170μm、至少180μm、至少190μm或至少200μm。

在一些实施方案中，在施用本公开的一种或多种微生物和/或生物集合体后，家禽的回肠或回肠组织变薄小于1μm、小于2μm、小于3μm、小于4μm、小于5μm、小于6μm、小于7μm、小于8μm、小于9μm、小于10μm、小于11μm、小于12μm、小于13μm、小于14μm、小于15μm、小于16μm、小于17μm、小于18μm、小于18μm、小于20μm、小于21μm、小于22μm、小于23μm、小于24μm、小于25μm、小于30μm、小于35μm、小于40μm、小于45μm、小于50μm、小于55μm、小于60μm、小于65μm、小于70μm、小于75μm、小于80μm、小于85μm、小于90μm、小于95μm、小于100μm、小于110μm、小于120μm、小于130μm、小于140μm、小于150μm、小于160μm、小于170μm、小于180μm、小于190μm或小于200μm。

在一些实施方案中，在施用本公开的一种或多种微生物和/或生物集合体后，提高或改善了家禽中脂肪的消化率。在一些实施方案中，通过从食用食物中的脂肪中减去排泄物中的脂肪来确定所利用的粗脂肪的测量。

在一些实施方案中，在施用本公开的一种或多种微生物和/或生物集合体后，家禽中脂肪的消化率提高或改善至少0.5％、至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。在一些实施方案中，通过从食用食物中的粗脂肪中减去排泄物中的粗脂肪来测量脂肪的消化率。参见duerr等人(2017.j.avianmed.surg.31(2):132-141.)

在一些实施方案中，在施用本公开的一种或多种微生物和/或生物集合体后，提高或改善了家禽中氨基酸或寡肽/多肽的消化率。

在一些实施方案中，在施用本公开的一种或多种微生物和/或生物集合体后，家禽中氨基酸或寡肽/多肽的消化率提高或改善至少0.5％、至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。

在一些实施方案中，在施用本公开的一种或多种微生物和/或生物集合体后，提高或改善了家禽中视黄醇和/或叶黄素的消化率。

在一些实施方案中，在施用本公开的一种或多种微生物和/或生物集合体后，家禽中视黄醇和/或叶黄素的消化率提高或改善至少0.5％、至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。

在一些实施方案中，在施用本公开的一种或多种微生物和/或生物集合体后，提高或改善了家禽中钙、铁、锌、铜、磷或其离子的吸收。

在一些实施方案中，在施用本公开的一种或多种微生物和/或生物集合体后，家禽中钙、铁、锌、铜、磷或其离子的吸收提高或改善至少0.5％、至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。

在一些实施方案中，在施用本公开的一种或多种微生物和/或生物集合体后，家禽的胃肠道中出现泡沫状消化物。

在一些实施方案中，在施用本公开的一种或多种微生物和/或生物集合体后，家禽的胃肠道中出现泡沫状消化物减少至少0.5％、至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。

在一些实施方案中，在施用本公开的一种或多种微生物和/或生物集合体后，减少了家禽的胃肠道中甲烷的产生。

在一些实施方案中，在施用本公开的一种或多种微生物和/或生物集合体后，家禽的胃肠道中甲烷的产生减少至少0.5％、至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。

作用模式：胃肠健康改善和竞争性排除

胃肠道微生物组对肉鸡健康的影响是众所周知的(roberts,2015；yeoman,2012；lee(展示)；oakley,2014)—健康的肠道系统将改善商业农场环境中禽类的总体福祉和表现。尽管在这个错综而复杂的系统中单独物种的确切作用和机制仍然很大程度上未知，但已经研究了微生物对宿主健康和表现的总体有益作用。目前的代谢知识和作用机制总结如下。参见图5.(pourabedin和zhao.2015.femsmicrobiol.lett.362:fnv122)。图5描述了一系列相互作用，所述相互作用均受具有均衡的共生微生物群体并具有足够的益生元组合物供应的胃肠道组成的调节。例如，共生细菌是(1)产生抗菌化合物以与包括病原体在内的其他生物体竞争，(2)产生参与代谢调节和能量使用的简单脂肪酸，(3)与淋巴细胞和抗原呈递细胞一起免疫调节局部免疫应答等。

总体营养和肠道健康

在肉鸡的胃肠道中增加有益分子(包括短链脂肪酸和其他有机酸)的浓度可改善禽类表现。

特别是微生物短链脂肪酸产生被禽类吸收并代谢，并且可提供禽类维持能量的每日需要的5％至15％(chichlowski,2007；annison,1968；gasaway,1976ab)。先前研究表明，补充丁酸盐可在每天给予禽类时提高总体重增加和饲料转化，并且补充任何有机酸(包括富马酸和乳酸)可提高禽类体重增加(levy,2015；gilliland,1977；afil,2010)。levy,等人(2015)表明随着包封的丁酸水平增加，体重增加和饲料转化的改善呈线性增加。丁酸盐还可增强绒毛发育(chamba，2014)、激活免疫反应，并且也可具有直接杀菌作用(gantois，2006)。

改善胃肠道的发育，增强绒毛生长，并且刺激免疫系统。

向禽类饮食中补充丁酸盐和其他有机酸已被证明增强绒毛发育并刺激免疫系统(chamba,2014；adil2010；adil2011)。

改善饮食的表观代谢能

各种微生物的发酵可将碳水化合物转化为各种最终产物。由这些微生物产生的大多数短链脂肪酸被禽类吸收并利用(rinttila,2013；annison,1968；gasaway,1976ab)。包括维生素b和k在内的维生素的合成也由微生物进行(cummings，1997)。

竞争性排除

细菌素产生

胃肠道内的微生物通过产生各种抗微生物化学物质而自我调控。例如，细菌素通常由乳酸微生物产生，并且可防止病原体的定殖(chen,2007；juven1990)。短链脂肪酸已被证明可影响并抑制肠道细菌，包括鼠伤寒沙门氏菌，但不抑制有益的天然微生物(vanderwielen等人，2000)。丙酸、丁酸、乙酸盐也被证明可抑制病原菌(marounek,1999；vanderwielen,2000；immerseei,2003)。

营养素/结合位点的竞争性使用

出生后不久，将禽类首先接种微生物。随着禽类不断发育，微生物组定殖并自我建立，最终创建稳定的生态系统，所述生态系统容纳占据所有生态位并利用所有可用营养素的生物体(callaway，2008)。这种广阔、稳定的群落可防止病原体定殖。

创建不利于病原体生长的环境

驻留在肠道内的微生物降低肠道内的氧化还原电位，从而创建适合于专性厌氧菌繁殖的环境(cummings,1997；chicklowki,20017；juven1990)。乳酸和其他短链脂肪酸的产生降低胃肠环境的ph，从而使病原体更难以定殖和生长(pourabedin，2015)。天然微生物也被证明可中和肠毒素(m'sadeq，2015)。

实施例

实施例i.将天然细菌饲料施用和定殖至小肉鸡雏鸡

目的：确定在发育期间的不同时间饲喂至肉鸡雏鸡的天然微生物的定殖功效。

程序：将ascusbbr_105932、ascusbbr_10593和ascusbbr_2676施用至雏鸡。将总计60只雏鸡平均分成20只鸡的3个组。将每组20只鸡圈养在独立的层架式笼中，各组之间具有至少有一个空笼以避免交叉污染。三个组是：实验组1、实验组2和对照组。

实验组1在0日龄经由管饲接受0.5ml的微生物组合物，所述微生物组合物含有悬浮在1xramm盐水溶液中的ascusbbr_10593、asucsbbr_2676和ascusbbr_105932。实验组2在5日龄经由管饲接受0.5ml的微生物组合物，所述微生物组合物含有悬浮在1xramm盐水溶液中的ascusbbr_10593、asucsbbr_2676和ascusbbr_105932。对照组经由管饲接受0.5ml的无菌1xramm盐水溶液。实验组1和实验组2接受每种菌株的大约1x10⁶个细胞。在第7日龄、第11日龄、第14日龄和第18日龄从每组中随机选择4只鸡，并从待取样的笼中取出。每只鸡均采样了以下器官：盲肠、小肠内容物和经由拭子取得的小肠刮片。对于盲肠和小肠内容物，将样品收集在含有200μl终止溶液(95％乙醇和5％苯酚)的2ml管中。对于拭子，将2ml收集管用600μl的终止溶液-pbs混合物(25％终止溶液(95％乙醇和5％苯酚)和75％1x无菌pbs)预填充。将拭子浸入所述终止溶液-pbs混合物中，且然后放入新的空2ml收集管中进行储存。然后将样品储存在-20直至运输和加工。

从每种样品中提取核酸。使用pcr扩增dna和rna，并准备文库用于illuminamiseq测序。在测序后，使用usearch软件分析16s数据，并在实验组和对照组中鉴定所施用的菌株。表12、表13和表14示出与对照组相比每种菌株的丰度的增加和减少。

结果：

表12：所施用菌株在肉鸡盲肠内容物中的的丰度变化

*省略了第7天数据，因为样品具有<100个总读段。‘-’表示此样品的相对丰度低于或等于对照的相对丰度。‘+’表示相对丰度大于对照样品的相对丰度。

表13：所施用菌株在肉鸡的小肠内容物中的丰度变化

*‘-’表示此样品的相对丰度低于或等于对照的相对丰度。‘+’表示相对丰度大于对照样品的相对丰度。

表14：所施用菌株在肉鸡的小肠壁刮片中的丰度变化

*‘-’表示此样品的相对丰度低于或等于对照的相对丰度。‘+’表示相对丰度大于对照样品的相对丰度。

讨论：

ascusbbr_105932未能在所有时间点内测试的任何器官中定殖。ascusbbr_10593在实验组2的盲肠中似乎以比对照组更高的丰度建立。在组2的盲肠中，在第11日龄和第14日龄存在建立，而在第18日龄相对丰度等于或小于对照组的相对丰度。ascusbbr_10593的丰度增加表明与对照相比ascusbbr_10593的定殖增加。在不连续施用ascusbbr_10593的情况下，盲肠的微生物群将在第18日龄时恢复至更自然的状态。在试图改变天然微生物群的多种动物和研究中已经显示出这种趋势。参见preidis等人(2012.fasebj.26:1960-1969)，weimer等人(2010.j.dairysci.93:5902-5912)，weimer(2015.front.microbiol.6:1-16)以及weimer等人(2017.j.dairysci.100:7165-7182)。ascusbbr_10593在微生物群于第11日龄恢复至其自然状态之前，在第7日龄的第2组的小肠刮片上显示定殖。小肠刮片的结果也反映在小肠内容物中，从而表明当在第5日龄对小鸡管饲时，存在ascusbbr_10593的更大定殖。

实验组2中的ascusbbr_2676在其于第18日龄恢复至对照的相似微生物群之前在第7日和第11日龄定殖在小肠刮片中。小肠内容物中缺乏ascusbbr_2676定殖表明ascusbbr_2676通过胶原蛋白(iii、iv和v型)、明胶、纤维蛋白原、凝集素、层粘连蛋白或玻连蛋白与粘膜层结合。

对于在第0日龄施用微生物的实验组1，似乎存在不一致的结果，并且缺乏ascusbbr_10593、ascusbbr_2676和ascusbbr_105932定殖的证据。这可能是由于幼雏鸡在其生命早期在胃肠道内具有抗微生物性质。与0日龄相比，在第5日龄施用微生物似乎有益于ascus微生物的建立和定殖。

参考文献

preidis，g.a.etal.probioticsstimulateenterocytemigrationandmicrobialdiversityintheneonatalmouseintestine.fasebj.26，1960-1969(2012).

weimer，p.j.，stevenson，d.m.，mantovani，h.c.&man，s.l.c.hostspecificityoftheruminalbacterialcommunityinthedairycowfollowingnear-totalexchangeofruminalcontents.j.dairysci.93，5902-5912(2010).

weimer，p.j.redundancy，resilience，andhostspecificityoftheruminalmicrobiota：implicationsforengineeringimprovedruminalfermentations.front.microbiol.6，1-16(2015).

weimer，p.j.etal.transientchangesinmilkproductionefficiencyandbacterialcommunitycompositionresultingfromnear-totalexchangeofruminalcontentsbetweenhigh-andlow-efficiencyholsteincows.j.dairysci.100，7165-7182(2017).

实施例ii.肉鸡分离物的凝集素结合测试

在孵化后即刻，蛋清的抗微生物性质保护肉鸡雏鸡免受病原体侵害。参见hager等人(1983.poultryscience.62：247-254)。在这种保护作用消失后，雏鸡不断受到病原体的激发，并且从不会聚于核心微生物组上。由于坏死性肠炎和肠上皮慢性发炎，这导致高死亡率。经由创始者效应的竞争性排除，展示胶原蛋白和粘蛋白结合的肉鸡菌株具有排除病原体的能力。在许多情况下，这已显示出可提高整体免疫健康水平并减轻肠上皮细胞慢性发炎。参见yadav等人(2013.microbiol.res.168：639-645)。在此，使用elisa测试4种菌株(菌株1、菌株2、阳性对照和阴性对照)结合特定凝集素的能力。

设计凝集素结合测定以经由夹心elisa鉴定表型甘露糖、岩藻糖和n-乙酰葡糖胺凝集素结合。每种菌株一式三份进行测试，并与阳性对照和阴性对照进行比较。结合是参与免疫防御的钙依赖性凝集素结合蛋白。elisa夹心测定利用对鸡甘露糖结合凝集素具有特异性的抗体。这种结合类型有很多同义词，包括但不限于胶原凝集素-1、甘露聚糖结合蛋白、甘露糖结合凝集素、甘露糖结合蛋白c、mbl2、mbl2鸡、mbp-c、mbp1。此外，这种测定测试含有1个c型凝集素结构域和1个胶原蛋白样结构域两者的两种细菌。

标准品制备

连续稀释的标准品在使用前新鲜制备。肉鸡mbl标准品与肉鸡血清/血浆样品组合用作阳性对照。将管轻轻混合。将25ng/ml标准品以200ul连续稀释，在每次稀释时轻轻混合。空白对照不含蛋白质。

样品和板制备

使所有分离物生长至足够浊度，并通过旋转使其成粒。将所有样品均分以产生技术三次重复进行测试，对正常血清/血浆的建议稀释度为：800倍。

测定方案

将所有材料平衡至室温，所有样品和标准品一式三份进行。将100ul的每种样品和标准品吸移至适当的孔中。覆盖板并在室温于4下孵育过夜。在孵育后，将样品用pbs洗涤缓冲液洗涤4次，并通过抽吸除去。100ul制备的生物素化的人mbl检测抗体，且然后在室温下在轻轻振荡下孵育一小时。将100ul的1xhrp-链霉亲和素溶液添加至每个孔，并在室温下在轻轻振荡下孵育45分钟。将100ultmb添加至每个孔，并在室温下在轻轻振荡下孵育30分钟。最后，将50μl终止溶液添加至每个孔。随后立即读取450nm处的光密度。

体内抗炎测试

在肉鸡中，通过口服管饲使对结合结构域测试为阳性的生物体生长并进行体内测试。测试了肉鸡的血清α-1-agp、cd4+淋巴细胞、cd8+淋巴细胞、细胞因子il8和tnfsf15、il17f、inos表达以及紧密连接蛋白jam2、封闭蛋白、zo1和muc2的基因表达。参见gadde等人(2017.res.vetsci.114:236-243)。

结果

对菌株分离物一和二的结合测定的测试将可能揭示仅在分离物二中的清楚结合(图6)。然后将分离物二用于对肉鸡进行口服管饲。确认来自管饲鸡的血清可通过血清α-1-agp、cd4+淋巴细胞、cd8+淋巴细胞、细胞因子il8和tnfsf15、il17f、inos表达以及紧密连接蛋白jam2、封闭蛋白、zo1和muc2的基因表达在免疫学上得到改善，将与对照血清进行比较，p值为1e-16。

参考文献

hagerje，beanewl.1983.posthatchincubationtimeandearlygrowthofbroilerchickens.poultsci62：247-254.

yadavak，tyagia，kaushikjk，saklaniac，grovers，batishvk.2013.roleofsurfacelayercollagenbindingproteinfromindigenouslactobacillusplantarum91inadhesionanditsanti-adhesionpotentialagainstgutpathogen.microbiolres168：639-645.

gaddeud，ohs，leey，davise，zimmermann，rehbergert，lillehojhs.2017.dietarybacillussubtilis-baseddirect-fedmicrobialsalleviatelps-inducedintestinalimmunologicalstressandimproveintestinalbarriergeneexpressionincommercialbroilerchickens.resvetsci114：236-243.

实施例iii.肉鸡分离物的胶原蛋白结合测试

长期以来公认，产气荚膜梭菌是坏死性肠炎(估计全世界每年消耗60亿美元的一种常见的家禽疾病)的主要病原体。参见immerseel等人(2009.trendsmicrobiol.17：32-36)以及wade和keyburn(2015.worldpoultry.31(7)：16-17)。“粘附至宿主肠道上皮和肠道中的细胞外基质分子的能力是细菌性肠病原体使用的众所周知的策略”，并且据推测，产气荚膜梭菌使用类似的策略通过细胞外基质分子(包括胶原蛋白)的结合来定殖家禽肠细胞。参见martin和smyth(2010.anaerobe.16(5)：533-539)。各种研究表明，产气荚膜梭菌粘附至各种胶原蛋白类型的能力与菌株的毒力之间存在强相关性。参见wade等人(2016.vet.microbiol.197：53-61)。因此，设计胶原蛋白结合测定，目的是发现通过优先结合也由产气荚膜梭菌粘附的选定胶原基序而能够竞争性地抑制产气荚膜梭菌定殖的微生物。结果将表明，无毒菌株能够以与毒性产气荚膜梭菌相似或更大的亲和力结合iii至v型胶原蛋白和明胶。

该测定基于wade等人设计的方案，所述方案研究各种细菌与明胶和ii、iii、iv、v型胶原的结合。参见，wade等人(2015.vet.microbiol.180(3-4):299-303)。

使胶原蛋白和明胶增溶

产生以下原液：将1mgii和iv型胶原蛋白添加至50mlpbs和0.13ml乙酸，并在4下振荡过夜。将1mgiii型胶原蛋白添加至48.5mlpbs和1.5ml乙酸中，并在4下振荡过夜。将1mgv型胶原蛋白添加至48.8mlpbs和1.2ml乙酸，并在室温下振荡3小时。将明胶添加至49.7mlpbs和0.3ml乙酸，并在室温下振荡3小时。

胶原和明胶粘附

将50ul的ii、iii、iv、v型胶原蛋白、明胶或pbs的1mg/50ml溶液添加至96孔nunclonδ表面处理板的每个孔。然后将板在黑暗中在4孵育过夜。

封闭所述孔

封闭溶液由40mlpbs中的1gbsa和20ultween20制成。将200ul的这种封闭溶液添加至板的每个孔。将板在黑暗中在4孵育2小时。此后，将每个孔用200ulpbs冲洗3次。

细胞粘附

使对cnaa基因呈阳性的毒性产气荚膜梭菌、对cnaa基因呈阳性的无毒革兰氏阳性菌株和对cnaa基因呈阴性的革兰氏阳性菌株在厌氧tsb+5％去纤维蛋白的绵羊血中生长至指数晚期。然后将来自这些培养物的40ml在4下于4,300rcf下离心30分钟。然后将团块用新鲜pbs洗涤3次，并将细胞悬浮液调节至在600nm下光密度为0.8。将50ul细胞悬浮液添加至每个孔，并将板在黑暗中在搅拌下在室温孵育2小时。此后，将每个孔用100ul新鲜pbs洗涤3次。

结晶紫染色

制备0.5％(w/v)的结晶紫的pbs溶液。向每个孔中添加100ul的此溶液，并在室温下在黑暗中孵育5分钟。然后将每个孔用100ul新鲜pbs洗涤3次。然后将细胞用50ul的1∶1乙醇∶丙酮(v/v)脱色，并在562nm处读取每个孔的吸光度。

结果

所有报告的结果均通过其各自的对照进行校正。从结果中，预期观察到cnaa阳性菌株产气荚膜梭菌和菌株1对所有测试蛋白质的结合亲和力均高于cnaa阴性菌株2。(图7)这与先前的数据3-5一致，其显示cnaa基因的存在与菌株结合胶原蛋白的能力之间的相关性。此外，这些结果将表明与产气荚膜梭菌相比，菌株1对明胶和iii、iv和v型胶原蛋白具有更大粘附。因为这一原因，有可能菌株1可用作肉鸡中的细胞外基质分子的产气荚膜梭菌结合的竞争性抑制剂。通过抑制产气荚膜梭菌的定殖，菌株1可降低坏死性肠炎的发生率，并改善肉鸡的健康。

参考文献

vanimmerseel，f.，rood，j.i.，moore，r.j.，titball，r.w.，2009.rethinkingourunderstandingofthepathogenesisofnecroticenteritisinchickens.trendsmicrobiol.17，32-36.

wade，b.，keyburn，a.l.，2015.thetruecostofnecroticenteritis.worldpoultry31(7)，16-17.

thomasg.martin，joana.smyth，theabilityofdiseaseandnon-diseaseproducingstrainsofclostridiumperfringensfromchickenstoadheretoextracellularmatrixmoleculesandcaco-2cells，inanaerobe，volume16，issue5，2010，pages533-539，issn1075-9964，https://doi，org/10.1016/j，anaerobe.2010.07.003.

benwade，anthonyl.keyburn，volkerhating，markford，juliani.rood，robertj.moore，theadherentabilitiesofclostridiumperfringensstrainsarecriticalforthepathogenesisofaviannecroticenteritis，inveterinarymicrobiology，volume197，2016，pages53-61

b.wade，a.l.keyburn，t.seemann，j.i.rood，rj.moore，bindingofclostridiumperfringenstocollagencorrelateswiththeabilitytocausenecroticenteritisinchickens，inveterinarymicrobiology，volume180，issues3-4，2015，pages299-303.

实施例iii.肉鸡分离物的胶原蛋白结合测试

目的：此研究的目的是测试配制的微生物在混合到粉状饲料中35天后定殖幼雏鸡的能力。

程序：将ascusbbr_105932、ascusbbr_5796和ascusbbr_2676施用至雏鸡。将总计192只雏鸡平均分为4个处理组。每个处理组由3个围栏组成，每个围栏含有16只鸡。所述四个组是：未激发的对照组、阳性对照(经由管饲施用的所有3种微生物)、实验组1和实验组2。

实验组1接受每天混合至饲料中的微生物组合物，所述微生物组合物含有ascusbbr_105932、ascusbbr_2676和载体。实验组2接受每天混合至饲料中的微生物组合物，所述微生物组合物含有ascusbbr_105932、ascusbbr_5796、ascusbbr_2676和载体。实验组1和实验组2接受每种菌株的大约1x106个细胞。阳性对照经由管饲在第5日龄接受悬浮在1xramm盐水溶液中的ascusbbr_105932、acusbbr_5796和ascusbbr_2676。对照组经由饲料每天接受载体。在第2日龄、第7日龄、第14日龄、第21日龄、第28日龄和第35日龄从每组中随机选择2只鸡，并从待取样的笼中取出。每只鸡均采样了以下器官：盲肠、小肠内容物和经由拭子取得的小肠刮片。对于盲肠和小肠内容物，将样品收集在含有200μl终止溶液(95％乙醇和5％苯酚)的2ml管中。对于拭子，将2ml收集管用600μl的终止溶液-pbs混合物(25％终止溶液(95％乙醇和5％苯酚)和75％1x无菌pbs)预填充。将拭子浸入所述终止溶液-pbs混合物中，且然后放入新的空2ml收集管中进行储存。然后将样品储存在-20直至运输和加工。

从每种样品中提取核酸。使用pcr扩增dna和rna，并准备文库用于illuminamiseq测序。在测序后，使用usearch软件分析16s数据，并在实验组和对照组中鉴定所施用的菌株。表12、表13和表14示出与对照组相比每种菌株的丰度的增加和减少。

结果：ascusbbr_105932显示到第7天在实验组1、实验组2和阳性对照中在小肠粘膜上的定殖。在未激发的对照中未检测到其。

ascusbbr_2676显示在实验组1、实验组2和阳性对照中在小肠内容物中和小肠粘膜上的定殖。在未激发的对照中未检测到。

ascusbbr_5796显示在实验组1、实验组2和阳性对照中在小肠内容物和粘膜中到第7天的定殖。在小肠粘膜样品中仅在未激发的对照组中检测到其丰度。

关于跨实验组的微生物会聚的速率的描述，参见图8。在此，假定第35天代表禽群的最终微生物组。将整个实验中微生物组之间的距离与禽类的平均第35天最终微生物组进行比较。接受微生物的禽类，特别是实验组2(饲料中的3种微生物)和阳性对照组(口服管饲，3种微生物)展示比实验组1和未激发的对照更快的会聚至最终微生物组。

关于实验的最终死亡率百分比，参见图9。接受微生物的所有组(阳性对照、实验组1和实验组2)的死亡率百分比均表现出低于对照。

讨论：在此，将天然微生物经由饲料以稳定的形式成功地递送至肉鸡的胃肠道。主要靶微生物的定殖模式与阳性对照中使用的不稳定的微生物相似。仅在接受微生物的三组中检测到ascusbbr_105932和ascusbbr_2676。在未激发的对照中未检测到它们。然而，ascusbbr_5796确实出现在所有4个实验组中，尽管仅施用至实验组2和阳性对照。在接受微生物的3个组中，在小肠内容物和粘膜中检测到ascusbbr_5796。在未激发的对照中，仅在小肠粘膜中发现它。ascusbbr_5796在所有4个处理组中的出现并不出人意料，因为它是天然肉鸡微生物组的常见成员。

还发现施用微生物可改善禽类的表现。接受微生物的所有三个组的死亡率百分比均表现出低于未激发的对照。类似地，接受三种微生物的两个组(实验组2和阳性对照)表现出比实验组1和未激发的对照更快的微生物组成熟速率。更成熟的微生物组对病原体和感染的抵抗力更强，因此这些禽类更可能在细菌感染爆发后存活。

表15：本公开的布达佩斯条约保藏

本公开的编号的实施方案

尽管具有随附权利要求，但是本公开阐述以下编号的实施方案：

1.一种用于刺激b细胞的产生、刺激t细胞的产生、增加绒毛长度、减少家禽的炎性细胞因子的表达的方法，所述方法包括：

a)向家禽施用有效量的家禽补充剂，所述家禽补充剂包含：

i)纯化的微生物群体，所述纯化的微生物群体包含具有16s核酸序列的细菌，和/或具有its核酸序列的真菌，所述核酸序列与选自由seqidno:1-387组成的组的核酸序列至少约97％同一，并且所述细菌和/或真菌具有至少约0.2的mic评分；以及

ii)适用于家禽施用的载体，

其中与尚未施用所述补充剂的家禽相比，施用了有效量的所述家禽补充剂的所述家禽表现出b细胞的产生增加、t细胞的产生增加、绒毛的长度增加或炎性细胞因子的表达减少。

2.如实施方案1所述的方法，其中所述家禽是肉鸡。

3.根据实施方案1所述的方法，其中所述家禽补充剂在环境条件下稳定至少一周。

4.根据实施方案1所述的方法，其中所述家禽补充剂被配制为：包囊、片剂、胶囊、丸剂、饲料添加剂、食物成分、食物添加剂、食物制剂、食物补充剂、水添加剂、水混合的添加剂、热稳定的添加剂，水分稳定的添加剂、消耗性溶液、消耗性喷雾添加剂、消耗性固体、消耗性凝胶、注射液、栓剂、浸液或其组合。

5.根据实施方案1所述的方法，其中所述家禽补充剂包封在聚合物或碳水化合物中。

6.根据实施方案1所述的方法，其中所述家禽补充剂包含玻璃状基质，所述玻璃状基质包含细菌和/或真菌。

7.根据实施方案1所述的方法，其中所述家禽补充剂表现出小于0.25的水活度。

8.根据实施方案1所述的方法，其中在孵化后至少一天施用所述家禽补充剂一次或多次。

9.根据实施方案1所述的方法，其中在孵化日与孵化后14天之间施用所述家禽补充剂一次或多次。

10.根据实施方案1所述的方法，其中所述家禽补充剂包含第一微生物组合物和第二微生物组合物。

11.根据实施方案10所述的方法，其中从孵化后第4天或第5天开始每日施用所述第一微生物组合物，并且从第一次饲料改变开始每日施用所述第二微生物组合物。

12.如实施方案11所述的方法，其中一旦开始施用所述第二微生物组合物，就不再施用所述第一微生物组合物。

13.根据实施方案1所述的方法，其中所述家禽补充剂包含：

a)在所述孵化日之间一次或多次施用的第一微生物组合物，以及

b)在孵化后15天至家禽收获之间一次或多次施用的第二微生物组合物。

14.根据实施方案1所述的方法，其中施用包括：将所述家禽补充剂喂饲给家禽。

15.根据实施方案1所述的方法，其中施用包括：将所述家禽补充剂喷洒到家禽上。

16.根据实施方案1所述的方法，其中所述纯化的微生物群体以至少102个细胞的浓度存在于所述家禽补充剂中。

17.如实施方案1所述的方法，其中所述家禽表现出b细胞产生的增加。

18.如实施方案17所述的方法，其中所述b细胞选自由以下组成的组：b-1细胞、b-2细胞、边缘区b细胞、滤泡性b细胞、记忆b细胞、浆细胞和浆母细胞或它们的组合。

19.如实施方案1所述的方法，其中所述家禽表现出t细胞产生的增加。

20.如实施方案19所述的方法，其中所述t细胞选自由以下组成的组：γδ(γδ)t细胞、αβ(αβ)t细胞、自然杀伤t细胞、调控性t细胞、记忆t细胞、细胞毒性t细胞、辅助t细胞和效应t细胞；或它们的组合。

21.如实施方案1所述的方法，其中所述家禽表现出绒毛的长度增加。

22.如实施方案21所述的方法，其中所述绒毛长度增加至少1μm。

23.如实施方案22所述的方法，其中所述绒毛长度增加小于10μm。

24.如实施方案13所述的方法，其中所述第二微生物组合物引发所述家禽的回肠组织变薄、回肠的ph降低和/或胃肠道中的气体产生减少。

25.如实施方案11所述的方法，其中所述第二微生物组合物引发所述家禽的胃肠道中独特物种数目的变异性降低。

26.如实施方案24所述的方法，其中所述家禽表现出所述回肠组织变薄。

27.如实施方案26所述的方法，其中所述回肠组织变薄至少1μm。

28.如实施方案26所述的方法，其中所述回肠组织变薄小于200μm。

29.如实施方案24所述的方法，其中所述家禽表现出回肠的ph降低至少0.6ph。

30.如实施方案24所述的方法，其中所述家禽的胃肠道中的气体产生减少至少5％。

31.如实施方案25所述的方法，其中所述独特物种数目的变异性降低是小肠中微生物的独特物种的总数减少至约100与400物种之间。

尽管本公开已示出和描述了本公开的优选实施方案，但对于本领域技术人员来说将显而易见，此类实施方案仅作为举例提供。本领域技术人员现在将想到许多变化、改变和取代而不偏离本公开。应当理解的是，可在实践本公开时采用在本文中描述的本公开的实施方案的各种替代方案。以下权利要求书意图限定本公开的范围，并且这些权利要求范围内的方法和结构以及其等效物意图由其涵盖。

以引用的方式并入

本文引用的所有参考文献、文章、出版物、专利、专利公布以及专利申请出于所有目的以引用的方式整体并入。

然而，提及本文引用的任何参考文献、文章、出版物、专利、专利公布和专利申请不是、也不应被视为承认或任何形式的认可，即它们构成有效现有技术或构成世界上任何国家的公知常识的一部分。