植物乳杆菌及其混合发酵酸鲊鱼的方法与流程

本发明属于食品加工技术领域，具体涉及植物乳杆菌混合发酵酸鲊鱼的方法。

背景技术：

酸鲊鱼，是苗族及侗族少数名族的一种传统佳肴。酸鲊鱼，可生食，亦可炒食或放上辣椒煮成酸辣汤，味道鲜嫩爽口，使人食欲倍增。但是酸鲊鱼的制作以家庭作坊式的传统工艺为主，存在诸多问题，如规模小、季节性强、产品质量不稳定、生物胺含量高、生产周期长(一般为两个月左右)、产品无标准、难以实现工业化生产等缺陷。

酸鲊鱼风味的形成不仅只是依靠乳酸菌代谢产生，鱼体自身还含有大量的内源酶会使蛋白质降解，释放出游离氨基酸，这就为微生物提供了可利用的底物。然而内源酶的释放需要较长的时间，对风味的增加起到的作用比较慢。木瓜蛋白酶属于巯基蛋白酶，可水解蛋白质和多肽中精氨酸和赖氨酸的羧基端，并能优先水解那些在肽键的氮端具有二个羧基的氨基酸或芳香l-氨基酸的肽键，一般在ph为3～9.5环境中皆可，在中性或偏酸性时有作用。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的缺点，选择木瓜蛋白酶与内源酶共同作用的方式改善酸鲊鱼的风味，提供一种酶菌耦合的快速发酵酸鲊鱼方法，可有效祛除脂肪氧化的异味，促进酸鲊鱼风味物质的产生，提升酸鲊鱼滋味口感，抑制了酸鲊鱼生物胺的含量等。

为达到上述目的，本发明提供了一株植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)24，保藏号cgmccno.16613，于2018年10月24日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：10010。

本发明还提供了一种植物乳杆菌混合发酵酸鲊鱼的方法，包括如下步骤：

s1、原料预处理：活鱼去鳞、去头、去尾、去内脏，切成小块备用；实际操作时，可根据需要对鱼进行切块或者不切块，切块大小不影响酸鲊鱼发酵；

s2、发酵：将步骤s1所得鱼块、米粉、食盐、浓度为10⁶～10⁸cfu/ml的植物乳杆菌24菌液和浓度为10000～20000u/ml的木瓜蛋白酶液混合后搅拌均匀；装入容器中混合发酵，用米粉封住最上层，盖紧容器的盖子，20℃～30℃密封放置发酵20～30天，得酸鲊鱼；其中，鱼块、米粉、食盐的重量比为(90～115):(50～70):(2～4)；以鱼块的总重量计，所述植物乳杆菌24菌液的添加量为0.0006ml～0.06ml/g鱼块；木瓜蛋白酶液的添加量为0.005～0.025ml/g鱼块；所述米粉为大米炒熟后磨成的粉，植物乳杆菌24保藏号为cgmccno.16613。

优选方式下，步骤s1所述鱼为鲫鱼、鳙鱼、鲶鱼、草鱼或鲤鱼；也可以根据需要，选取其他种类的鱼。

优选方式下，步骤s2所述10⁶～10⁸cfu/ml植物乳杆菌24菌液的制备方法为：挑取-80℃保存的植物乳杆菌24(cgmccno.16613)，根据中华人民中和过出入境检验检疫行业标准snt2660-2010中的f2.7复苏方法使用mrs固体培养基30～37℃、16～24h对菌种进行复苏；挑取复苏后的单菌落接到mrs肉汤液体培养基，150～250rpm、37℃、培养16～24h，所得菌液5000～10000×g，室温离心5～10min弃去上清，所得菌体用0.9％生理盐水洗涤2次、离心所得菌体用无菌水稀释备用。

优选方式下，步骤s2所述10000～20000u/ml木瓜蛋白酶液的制备方法为：使用饮用水将木瓜蛋白酶稀释至10000～20000u/ml；所述饮用水为灭菌水或将水烧开后晾凉。

优选方式下，所述植物乳杆菌混合发酵酸鲊鱼的方法，包括如下步骤：

s1、原料预处理：活草鱼去鳞、去头、去尾、去内脏，所得鱼体切成小块备用，共5kg；

s2、发酵：按重量比100:65:3将步骤s1所得鱼块、米粉、食盐混合，加入10⁷cfu/ml植物乳杆菌24菌液和10000u/ml木瓜蛋白酶酶液混合后搅拌均匀；装入罐中混合发酵，用米粉封住最上层，拧紧盖子，25℃密封放置发酵28天，得酸鲊鱼；其中，米粉为炒熟的大米粉，步骤s2所得植物乳杆菌24菌液的添加量为0.006ml/g鱼块(共添加植物乳杆菌24菌液30ml)；步骤s3所得木瓜蛋白酶液添加量为0.005ml/g鱼块(共25ml)；

其中，所述10⁷cfu/ml植物乳杆菌24菌液的制备方法为：挑取-80℃保存的植物乳杆菌24(cgmccno.16613)，根据中华人民中和过出入境检验检疫行业标准snt2660-2010中的f2.7复苏方法使用mrs固体培养基37℃、18h对菌种进行复苏；挑取复苏后的单菌落接到15mlmrs肉汤液体培养基，180rpm、37℃、培养16h，所得菌液10000×g，室温离心8min弃去上清，所得菌体用0.9％生理盐水洗涤2次、离心所得菌体用无菌水稀释至10⁷cfu/ml，得植物乳杆菌24菌液备用；

所述10000u/ml木瓜蛋白酶液的制备方法为：使用饮用水将木瓜蛋白酶稀释至10000u/ml，得木瓜蛋白酶液。

本发明的有益效果是：

1、本发明采用木瓜蛋白酶与植物乳杆菌24混合的方法制备酸鲊鱼，使发酵周期缩短至20～30天。

2、本发明采用木瓜蛋白酶与植物乳杆菌24混合的方法制备酸鲊鱼，有效抑制了脂肪氧化，使产品的脂肪氧化异味降低。

3、本发明方法采用木瓜蛋白酶与植物乳杆菌24混合的方法制备酸鲊鱼，改善了酸鲊鱼产品的风味和滋味。

4、本发明所得酸鲊鱼，鱼肉中的生物胺含量有效降低，保证了产品的安全性。其中实施例2的组胺、酪胺、腐胺、尸胺、β-苯乙胺与对比例1相比较，分别降低1.5～3.5倍、1.2～2.8倍、1.0～3.8倍、1.2～2.1倍、1.5～2.5倍、1.3～2.7倍。

综上，本发明运用木瓜蛋白酶的内、外切功能来释放更多的游离氨基酸以及通过植物乳杆菌24的代谢二者相结合，在内源酶与外源酶的共同作用下改善酸鲊鱼品质，提升酸鲊鱼风味与滋味，缩短发酵周期，降低了脂肪氧化，抑制了酸鲊鱼的生物胺含量，使酸鲊鱼的发酵周期缩短。

附图说明

图1为本发明制备的发酵酸鲊鱼tbars值；

图2为本发明制备的发酵酸鲊鱼的电子鼻测定结果；

图3为本发明制备的发酵酸鲊鱼的电子舌测定结果；

图4为本发明制备的发酵酸鲊鱼的生物胺含量。

具体实施方式

以下实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，有助于了解本专利，但本发明的实施方案不受所述实施例的限制，本发明的保护范围有权利要求来决定。

下述实施例中的木瓜蛋白酶购自于：南宁庞博生物有限公司；米粉购自于：成芳特色养生杂粮馆

实施例1：

植物乳杆菌混合发酵酸鲊鱼的方法，包括如下步骤：

s1、原料预处理：活鲤鱼去鳞、去头、去尾、去内脏，所得鱼体切成小块备用，共5kg；

s2、发酵：按重量比90:50:2将步骤s1所得鱼块、米粉、食盐混合，加入10⁶cfu/ml植物乳杆菌24菌液和15000u/ml木瓜蛋白酶酶液搅拌均匀；装入罐中混合发酵，用米粉封住最上层，拧紧盖子，20℃密封放置发酵30天，得酸鲊鱼；其中，米粉为炒熟的大米磨成的粉，所述植物乳杆菌24菌液的添加量为0.0006ml/g鱼块(共添加植物乳杆菌24菌液3ml)；木瓜蛋白酶液添加量为0.0066ml/g鱼块、(共添加木瓜蛋白酶液33ml)；

其中，所述植物乳杆菌24菌液的制备方法为：挑取-80℃保存的植物乳杆菌24(cgmccno.16613)，根据中华人民中和过出入境检验检疫行业标准snt2660-2010中的f2.7复苏方法使用mrs固体培养基30℃、16h对菌种进行复苏；挑取复苏后的单菌落接到15mlmrs肉汤液体培养基，150rpm、37℃、培养16h，所得菌液5000×g，室温离心10min弃去上清，所得菌体用0.9％生理盐水洗涤2次、离心所得菌体用无菌水稀释至10⁶cfu/ml，得植物乳杆菌24菌液备用；

所述木瓜蛋白酶液的制备方法为：使用饮用水将木瓜蛋白酶稀释至15000u/ml。

实施例2：

植物乳杆菌混合发酵酸鲊鱼的方法，包括如下步骤：

s1、原料预处理：活草鱼去鳞、去头、去尾、去内脏，所得鱼体切成小块备用，共5kg；

s2、发酵：按重量比100:65:3将步骤s1所得鱼块、米粉、食盐混合，加入10⁷cfu/ml植物乳杆菌24菌液和10000u/ml木瓜蛋白酶酶液搅拌均匀；装入罐中混合发酵，用米粉封住最上层，拧紧盖子，25℃密封放置发酵28天，得酸鲊鱼；其中，米粉为炒熟的大米磨成的粉，所述植物乳杆菌24菌液的添加量为0.006ml/g鱼块(共添加植物乳杆菌24菌液30ml)；木瓜蛋白酶液添加量为0.005ml/g鱼块、(共添加木瓜蛋白酶液25ml)；

其中，所述植物乳杆菌24菌液的制备方法为：挑取-80℃保存的植物乳杆菌24(cgmccno.16613)，根据中华人民中和过出入境检验检疫行业标准snt2660-2010中的f2.7复苏方法使用mrs固体培养基37℃、18h对菌种进行复苏；挑取复苏后的单菌落接到15mlmrs肉汤液体培养基，180rpm、37℃、培养16h，所得菌液10000×g，室温离心8min弃去上清，所得菌体用0.9％生理盐水洗涤2次、离心所得菌体用无菌水稀释至10⁷cfu/ml，得植物乳杆菌24菌液备用；

所述木瓜蛋白酶液的制备方法为：使用饮用水将木瓜蛋白酶稀释至10000u/ml。

实施例3：

植物乳杆菌混合发酵酸鲊鱼的方法，包括如下步骤：

s1、原料预处理：活鳙鱼去鳞、去头、去尾、去内脏，所得鱼体切成小块备用，共5kg；

s2、发酵：按重量比115:70:4将步骤s1所得鱼块、米粉、食盐混合，加入10⁸cfu/ml植物乳杆菌24菌液和20000u/ml木瓜蛋白酶酶液搅拌均匀；装入罐中混合发酵，用米粉封住最上层，拧紧盖子，20℃密封放置发酵20天，得酸鲊鱼；其中，米粉为炒熟的大米磨成的粉，所述植物乳杆菌24菌液的添加量为0.025ml/g鱼块(共添加植物乳杆菌24菌液300ml)；木瓜蛋白酶液添加量为0.025ml/g鱼块、(共添加木瓜蛋白酶液125ml)；

其中，所述植物乳杆菌24菌液的制备方法为：挑取-80℃保存的植物乳杆菌24(cgmccno.16613)，根据中华人民中和过出入境检验检疫行业标准snt2660-2010中的f2.7复苏方法使用mrs固体培养基35℃、24h对菌种进行复苏；挑取复苏后的单菌落接到15mlmrs肉汤液体培养基，250rpm、37℃、培养24h，所得菌液8000×g，室温离心5min弃去上清，所得菌体用0.9％生理盐水洗涤2次、离心所得菌体用无菌水稀释至10⁷cfu/ml，得植物乳杆菌24菌液备用；

所述木瓜蛋白酶液的制备方法为：使用饮用水将木瓜蛋白酶稀释至20000u/ml。

对比例1：

传统酸鲊鱼的制备方法，包括步骤：

s1、原料预处理：活鲤鱼去鳞、去头、去尾、去内脏，所得鱼体切成小块备用，共5kg；

s2、发酵：按重量比110:70:4将步骤s1所得鱼块、米粉、食盐混合，装入罐中发酵，用米粉封住最上层，拧紧盖子，25℃密封放置发酵60天，得酸鲊鱼。其中米粉为购买的炒熟大米粉，组别为对比例1。

对比例2：

s1、原料预处理：活草鱼去鳞、去头、去尾、去内脏，所得鱼体切成小块备用，共5kg；

s2、发酵：按重量比100:65:3将步骤s1所得鱼块、米粉、食盐混合，加入10⁷cfu/ml植物乳杆菌24菌液充分搅拌均匀，装入罐中发酵，用米粉封住最上层，拧紧盖子，25℃密封放置发酵28天，得酸鲊鱼。其中米粉为购买的炒熟大米粉，所述植物乳杆菌24菌液的添加量为0.006ml/g鱼块(共添加植物乳杆菌24菌液30ml)，组别为对比例2。

其中，所述植物乳杆菌24菌液的制备方法为：挑取-80℃保存的植物乳杆菌24(cgmccno.16613)，根据中华人民中和过出入境检验检疫行业标准snt2660-2010中的f2.7复苏方法使用mrs固体培养基37℃、16h对菌种进行复苏；挑取复苏后的单菌落接到15mlmrs肉汤液体培养基，180rpm、37℃、培养18h，所得菌液10000×g，室温离心5min弃去上清，所得菌体用0.9％生理盐水洗涤2次、离心所得菌体用无菌水稀释至10⁷cfu/ml，得植物乳杆菌24菌液备用；

对比例3：

s1、原料预处理：活鳙鱼去鳞、去头、去尾、去内脏，所得鱼体切成小块备用，共5kg；

s2、发酵：按重量比100:65:3将步骤s1所得鱼块、米粉、食盐混合，加入10000u/ml木瓜蛋白酶酶液搅拌均匀；装入罐中混合发酵，用米粉封住最上层，拧紧盖子，25℃密封放置发酵28天，得酸鲊鱼；其中，米粉为炒熟的大米粉，木瓜蛋白酶液添加量为0.005ml/g鱼块、(共添加木瓜蛋白酶液25ml)，组别为对比例3；

所述木瓜蛋白酶液的制备方法为：使用饮用水将木瓜蛋白酶稀释至10000u/ml。

对比例4：

s1、原料预处理：活草鱼去鳞、去头、去尾、去内脏，所得鱼体切成小块备用，共5kg；

s2、发酵：按重量比115:70:4将步骤s1所得鱼块、米粉、食盐混合，加入10⁷cfu/ml植物乳杆菌菌液和10000u/ml木瓜蛋白酶酶液搅拌均匀；装入罐中混合发酵，用米粉封住最上层，拧紧盖子，25℃密封放置发酵28天，得酸鲊鱼；其中，米粉为炒熟的大米粉，所述植物乳杆菌菌液的添加量为0.006ml/g鱼块(共添加植物乳杆菌24菌液30ml)；木瓜蛋白酶液添加量为0.005ml/g鱼块、(共添加木瓜蛋白酶液25ml)，组别为对比例4；

其中，所述植物乳杆菌菌液的制备方法为：挑取-80℃保存的植物乳杆菌(购买于“中国工业微生物菌种保藏管理中心”，保藏号cicc22858)，根据中华人民中和过出入境检验检疫行业标准snt2660-2010中的f2.7复苏方法使用mrs固体培养基37℃、16h对菌种进行复苏；挑取复苏后的单菌落接到15mlmrs肉汤液体培养基，180rpm、37℃、培养18h，所得菌液10000×g，室温离心5min弃去上清，所得菌体用0.9％生理盐水洗涤2次、离心所得菌体用无菌水稀释至10⁷cfu/ml，得植物乳杆菌菌液备用；

所述木瓜蛋白酶液的制备方法为：使用饮用水将木瓜蛋白酶稀释至10000u/ml。

在完成发酵酸鲊鱼后，对本发明实施例和对比例制得的酸鲊鱼的理化指标tbars、游离氨基酸、电子鼻、电子舌(滋味)、生物胺进行了测定。

一、tbars值含量测定

采用硫代巴比妥酸法，对各组酸鲊鱼中脂肪氧化产物丙二醛进行测定，结果如图1所示，tbars值代表每千克鱼肉中含有的丙二醛的量(mg)。从图1中可看出，与对比例相比，实施例所得酸鲊鱼中的tbars值与对比例相比较而言，有明显的下降，这可能是由于酸鲊鱼中的蛋白被木瓜蛋白酶水解为抗氧化肽，随着发酵时间的延长，抗氧化肽含量升高，所以脂肪氧化受到了抑制。当tbars高于0.5mg/kg时，人才能感知到氧化的异味。与对比例相比，实施例在植物乳杆菌24与木瓜蛋白酶同时作用的情况下，降低了脂肪氧化，说明木瓜蛋白酶与微生物中的内源酶共同作用，使酸鲊鱼中的抗氧化肽逐渐增多，使脂肪氧化受到抑制。

二、游离氨基酸含量测定

运用高效液相色谱仪对各组酸鲊鱼中的游离氨基酸进行测定，结果如表1。游离氨基酸是许多风味物质的前体，从表1可看出，在添加植物乳杆菌24和木瓜蛋白酶后，酸鲊鱼蛋白水解的速度被促进，使得游离氨基酸的含量升高。与对比例相比，实施例制备的酸鲊鱼中的鲜味游离氨基酸(asp和glu)都比对比例组中高，说明接植物乳杆菌24和添加木瓜蛋白酶对酸鲊鱼中的游离氨基酸有一定的作用，可以释放更多的游离氨基酸，植物乳杆菌24与木瓜蛋白酶相互作用是最有效改善酸鲊鱼风味的。可以看出天冬氨酸、谷氨酸的水解在实施例中明显被促进了，这两种氨基酸主要是呈鲜味的，它们在实施例制备的酸鲊鱼中比在对比例所得酸鲊鱼中显著增多。苯丙氨酸可以生成苯丙酮酸，又可以进一步氧化生成苯甲醛或者苯乙醛，苯甲醛是发酵酸鲊鱼过程中一种重要的挥发性化合物，与对比例1(传统方法制备的酸鲊鱼)组相比，实施例中的苯丙氨酸都有所提高，因此有可能会提高酸鲊鱼的这种特有的风味。

表1发酵酸鲊鱼游离氨基酸含量表

三、电子鼻测定结果

使用电子鼻对各组酸鲊鱼的风味进行测定，采用pen3型便携式电子鼻(德国airsense公司)进行测定，其中电子鼻传感器性能描述如表2所示，结果如图2所示。从电子鼻的结果可看出，与对比例相比，实施例中的风味均大于对比例，与对比例1(传统方法)相比，实施例中风味的平均相似度达到88％，说明本发明制作的酸鲊鱼没有改变原有的风味，只是在不同程度上提高了风味及口感，表明接植物乳杆菌24和添加木瓜蛋白酶对酸鲊鱼发酵有一定的帮助，可以改善其风味以及品质。其中可以看出实施例的风味强于对比例，它的传感器所检测到的滋味较为明显，所以木瓜蛋白酶与植物乳杆菌24共同作用对酸鲊鱼发酵是起到有效作用的。

表2pen3型电子鼻传感器

四、电子舌的测定结果

使用电子舌对各组酸鲊鱼的滋味进行测定，结果如图3所示。从电子舌的结果来看，与对比例相比，实施例制得的酸鲊鱼在鲜味(umami)皆比对比例组大，在实施例1、2、3发酵所得酸鲊鱼中的鲜味为20.2、27.2、24.4，而在对比例1(传统工艺)所得酸鲊鱼的鲜味为14.3，电子舌的结果测定与对比例1(传统方法)相比滋味相似度达到89％左右，说明适量的添加木瓜蛋白酶与接植物乳杆菌24可以增加鱼肉鲜美的滋味，而且不会影响酸鲊鱼的原有风味，证明酶菌耦合对酸鲊鱼风味的形成是最好的。

五、生物胺含量测定

生物胺是评价水产品的安全性的重要指标之一，本发明采用液相色谱与质谱联用仪对样品中的生物胺进行了分析，如图4所示。从图中可看出，与对比例相比，实施例中酸鲊鱼的生物胺总量皆低于对比例组，其中实施例制得酸鲊鱼的组胺、酪胺、腐胺、尸胺、β-苯乙胺与对比例1(传统工艺)所得酸鲊鱼相比，都有不同程度的降低。传统酸鲊鱼产品中的主要生物胺为酪胺，实施例制得的酸鲊鱼的酪胺低于对比例所得酸鲊鱼的酪胺含量。生物胺的结果说明适量的酶菌耦合发酵酸鲊鱼会使产品的安全性得到提高。

综上所述，添加木瓜蛋白酶与乳酸菌混合发酵对酸鲊鱼发酵起到有效的作用，使酸鲊鱼的发酵周期缩短了，有效抑制了脂肪氧化，而且酸鲊鱼风味、滋味以及安全性都得到了提升。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。