本发明属于动物饲料加工
技术领域：
，具体涉及一种复合微生物饲料添加剂及其制备方法。
背景技术：
：微生物饲料添加剂是一种特殊的饲料添加剂，其是通过微生物菌株的生理代谢作用促进养殖动物的生长，减少药物的使用，提高养殖动物的品质，实现绿色养殖。由于微生物饲料添加剂具备如此多的优异特性，越来越多的研究者已经开始了这方面的研究，尤其是研究微生物饲料添加剂在养猪行业的应用已经成为目前的研究热点。在养猪行业中，为了减少母猪向仔猪传播疫病，对3-5周龄的仔猪实行断奶，但是，断奶后的仔猪由于自身消化机能不完善、免疫力低下，经常会发生腹泻，这样会影响仔猪的正常生长发育，严重的话还会导致仔猪死亡，这种状况的发生制约着仔猪早期断奶技术的推广应用。针对这一状况目前采取的主要措施是在断奶仔猪饲料中添加抗生素来提高仔猪免疫力，预防仔猪腹泻、促进生长，但长期使用抗生素易产生耐药性细菌，这些细菌容易通过食物链影响人类健康。因此，很有必要将微生物饲料添加剂应用到断奶仔猪的养殖过程中，以解决目前断奶仔猪容易腹泻的问题。技术实现要素：本发明提供了一种复合微生物饲料添加剂，解决了现有技术中使用抗生素来提高仔猪免疫力，预防仔猪腹泻易产生耐药性细菌，耐药性细菌容易通过食物链影响人类健康的问题。本发明的第一个目的是提供一种复合微生物饲料添加剂，由以下重量份的原料制备而成：乳酸菌发酵液30-50份、胶冻样芽孢杆菌发酵液10-15份、长枝木霉发酵液10-15份、小球藻藻液20-30份。其中，所述乳酸菌发酵液、所述胶冻样芽孢杆菌发酵液中有效活菌数均为1.0×1010-3.0×1010cfu/ml；所述长枝木霉发酵液中孢子量为1.0×108-1.5×109个/ml；所述小球藻藻液的浓度为1.0×105-2.0×105个/ml。本发明的第二个目的是提供一种复合微生物饲料添加剂的制备方法，包括以下步骤：步骤1，分别制备乳酸菌种子液、胶冻样芽孢杆菌种子液；步骤2，制备乳酸菌发酵液将乳酸菌种子液接种于ypd液体培养基中，然后在35±2℃下以200r/min的振荡速度培养至对数末期，培养完毕得到乳酸菌发酵液；步骤3，制备胶冻样芽孢杆菌发酵液将柿子皮干燥后研磨成粉，得到柿子皮粉；将柿子核干燥后研磨成粉，得到柿子核粉；将柿子皮粉、柿子核粉、牛肉膏蛋白胨液体培养基按照1-2：2-5：20的质量比混合均匀，得到胶冻样芽孢杆菌培养基质；往胶冻样芽孢杆菌培养基质中接种胶冻样芽孢杆菌种子液，混合均匀，然后在28±2℃下以200r/min的振荡速度培养至对数末期，得到胶冻样芽孢杆菌发菌液；步骤4，制备长枝木霉发酵液将长枝木霉按照质量分数为5％的接种量接种于pdb液体培养基中，于30±2℃培养5d，得到长枝木霉发酵物；然后用蒸馏水洗脱长枝木霉发酵物上的长枝木霉孢子，得到长枝木霉发酵液；步骤5，制备小球藻藻液将小球藻按照质量分数为5％的接种量接种于bg11培养基中，在25±1℃、光照强度5000lux、光暗比12h：12h的条件下培养至对数生长期，得到小球藻藻液；步骤6，按重量份称取乳酸菌发酵液30-50份、胶冻样芽孢杆菌发酵液10-15份、长枝木霉发酵液10-15份、小球藻藻液20-30份，混合均匀，得到混合发酵液，将混合发酵液在35-40℃条件下通风干燥至水分含量≤10％，即得到所述复合微生物饲料添加剂。优选的，所述乳酸菌种子液、所述胶冻样芽孢杆菌种子液的接种量均为10ml种子液/千克基质。优选的，所述柿子皮粉和所述柿子核粉的粒度均为10-20目。与现有技术相比，本发明的有益效果在于：1)本发明采用多种微生物配合使用，利用其协同增效作用发挥效果；其中，乳酸菌能够促进仔猪对饲料中营养物质的吸收，还具有增加肠道有益菌群，改善仔猪胃肠道功能的功效；胶冻样芽孢杆菌在仔猪肠道内会产生多种激素类物质、生物酶、氨基多糖、蛋白质、氨基酸类物质，能够促进仔猪生长发育，增强仔猪抗病毒能力；长枝木霉可以利用病原菌菌丝体为营养进行生长、繁殖，同时还能诱导自身产生多种胞外细胞壁水解酶，通过协同酶溶作用使病原菌细胞崩解，并且能够产生较强的抗菌活性物质，对仔猪肠道内病原菌生长产生抑制作用；小球藻营养丰富，含有天然的蛋白质、氨基酸、不饱和脂肪酸、维生素、矿物质等，能够为仔猪提供全面营养供其生长，且小球藻也有一定的抗菌作用，胶冻样芽孢杆菌、长枝木霉、小球藻多种机制共同作用阻止仔猪肠道内病原菌的生长、繁殖，增强了仔猪的抗病效果。2)本发明提供的复合微生物饲料添加剂具有显著的抗菌、抗病毒的作用，可以显著的提高仔猪的免疫力，有效的预防仔猪断奶后出现腹泻的现象；还能改善仔猪肠道功能，提高断奶仔猪日增重量和饲料转化效率，具备广泛的应用前景。具体实施方式为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但所举实施例不作为对本发明的限定。下述实施例中所用乳酸菌、胶冻样芽孢杆菌、长枝木霉菌、小球藻均为在微生物菌种保藏管理中心可购买到的现有菌种，不涉及新菌种的开发，只涉及这几种现有菌株的应用。并且，下述实施例中所用的乳酸菌具体为中国典型培养物保藏中心保藏编号为cctccno：m2017382的菌株；胶冻样芽孢杆菌具体为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏编号为cgmccno.16005的菌株；长枝木霉菌具体为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏编号为cgmccno.8723的菌株；小球藻保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：m209256；实施例中乳酸菌种子液、胶冻样芽孢杆菌种子液均是采用常规方法培养得到的，下述各实施例中所述试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例1一种复合微生物饲料添加剂，由以下重量份的原料制备而成：乳酸菌发酵液30份、胶冻样芽孢杆菌发酵液15份、长枝木霉发酵液10份、小球藻藻液20份；其中，乳酸菌发酵液、胶冻样芽孢杆菌发酵液中有效活菌数均为2.6×1010cfu/ml；长枝木霉发酵液中孢子量为1.0×108个/ml；小球藻藻液的浓度为1.8×105个/ml。具体制备方法如下：步骤1，分别制备乳酸菌种子液、胶冻样芽孢杆菌种子液；步骤2，制备乳酸菌发酵液将乳酸菌种子液接种于ypd液体培养基中，然后在35±2℃下以200r/min的振荡速度培养至对数末期，培养完毕得到乳酸菌发酵液；步骤3，制备胶冻样芽孢杆菌发酵液将柿子皮干燥后研磨成粉，过10目筛，得到柿子皮粉；将柿子核干燥后研磨成粉，过10目筛，得到柿子核粉；将柿子皮粉、柿子核粉、牛肉膏蛋白胨液体培养基按照1：2：20的质量比混合均匀，得到胶冻样芽孢杆菌培养基质；往胶冻样芽孢杆菌培养基质中接种胶冻样芽孢杆菌种子液，混合均匀，然后在28±2℃下以200r/min的振荡速度培养至对数末期，得到胶冻样芽孢杆菌发菌液；步骤4，制备长枝木霉发酵液将长枝木霉按照质量分数为5％的接种量接种于pdb液体培养基中，于30±2℃培养5d，得到长枝木霉发酵物；然后用蒸馏水洗脱长枝木霉发酵物上的长枝木霉孢子，得到长枝木霉发酵液；步骤5，制备小球藻藻液将小球藻按照质量分数为5％的接种量接种于bg11培养基中，在25±1℃、光照强度5000lux、光暗比12h：12h的条件下培养至对数生长期，得到浓度为1.8×105个/ml的小球藻藻液；步骤6，按重量份称取乳酸菌发酵液30-50份、胶冻样芽孢杆菌发酵液10-15份、长枝木霉发酵液10-15份、小球藻藻液20-30份，混合均匀，得到混合发酵液，将混合发酵液在35-40℃条件下通风干燥至水分含量为5.3％，即得到复合微生物饲料添加剂。实施例2一种复合微生物饲料添加剂，由以下重量份的原料制备而成：乳酸菌发酵液40份、胶冻样芽孢杆菌发酵液10份、长枝木霉发酵液12份、小球藻藻液25份；其中，乳酸菌发酵液、胶冻样芽孢杆菌发酵液中有效活菌数均为1.0×1010cfu/ml；长枝木霉发酵液中孢子量为1.0×109个/ml；小球藻藻液的浓度为1.5×105个/ml。具体制备方法同实施例1，不同之处在于将实施例1的配方换成实施例2的，同时，胶冻样芽孢杆菌发酵液的制备方法如下：将柿子皮干燥后研磨成粉，过20目筛，得到柿子皮粉；将柿子核干燥后研磨成粉，过20目筛，得到柿子核粉；将柿子皮粉、柿子核粉、牛肉膏蛋白胨液体培养基按照1：5：20的质量比混合均匀，得到胶冻样芽孢杆菌培养基质；往胶冻样芽孢杆菌培养基质中接种胶冻样芽孢杆菌种子液，混合均匀，然后在28±2℃下以200r/min的振荡速度培养至对数末期，得到胶冻样芽孢杆菌发菌液。实施例2制得的复合微生物饲料添加剂的水分含量为10％。实施例3一种复合微生物饲料添加剂，由以下重量份的原料制备而成：乳酸菌发酵液50份、胶冻样芽孢杆菌发酵液12份、长枝木霉发酵液15份、小球藻藻液30份；其中，乳酸菌发酵液、胶冻样芽孢杆菌发酵液中有效活菌数均为3.0×1010cfu/ml；长枝木霉发酵液中孢子量为1.5×109个/ml；小球藻藻液的浓度为1.0×105个/ml。具体制备方法同实施例1，不同之处在于将实施例1的配方换成实施例3的，同时，胶冻样芽孢杆菌发酵液的制备方法如下：将柿子皮干燥后研磨成粉，过20目筛，得到柿子皮粉；将柿子核干燥后研磨成粉，过20目筛，得到柿子核粉；将柿子皮粉、柿子核粉、牛肉膏蛋白胨液体培养基按照2：2：20的质量比混合均匀，得到胶冻样芽孢杆菌培养基质；往胶冻样芽孢杆菌培养基质中接种胶冻样芽孢杆菌种子液，混合均匀，然后在28±2℃下以200r/min的振荡速度培养至对数末期，得到胶冻样芽孢杆菌发菌液。实施例3制得的复合微生物饲料添加剂的水分含量为3.8％。实施例4一种复合微生物饲料添加剂，由以下重量份的原料制备而成：乳酸菌发酵液30份、胶冻样芽孢杆菌发酵液15份、长枝木霉发酵液10份、小球藻藻液20份；其中，乳酸菌发酵液、胶冻样芽孢杆菌发酵液中有效活菌数均为1.8×1010cfu/ml；长枝木霉发酵液中孢子量为3.5×108个/ml；小球藻藻液的浓度为2.0×105个/ml。具体制备方法同实施例1，不同之处在于胶冻样芽孢杆菌发酵液的制备方法如下：将柿子皮干燥后研磨成粉，过10目筛，得到柿子皮粉；将柿子核干燥后研磨成粉，过10目筛，得到柿子核粉；将柿子皮粉、柿子核粉、牛肉膏蛋白胨液体培养基按照2：5：20的质量比混合均匀，得到胶冻样芽孢杆菌培养基质；往胶冻样芽孢杆菌培养基质中接种胶冻样芽孢杆菌种子液，混合均匀，然后在28±2℃下以200r/min的振荡速度培养至对数末期，得到胶冻样芽孢杆菌发菌液。实施例4制得的复合微生物饲料添加剂的水分含量为8.7％。为了验证柿子皮粉和柿子核粉的效果，本发明设置了下述对比例。对比例1胶冻样芽孢杆菌发酵液的制备方法如下：将柿子皮干燥后研磨成粉，过10目筛，得到柿子皮粉；将柿子皮粉与牛肉膏蛋白胨液体培养基按照1：20的质量比混合均匀，得到胶冻样芽孢杆菌培养基质；往胶冻样芽孢杆菌培养基质中接种胶冻样芽孢杆菌种子液，混合均匀，然后在28±2℃下以200r/min的振荡速度培养至对数末期，得到胶冻样芽孢杆菌发菌液。对比例2胶冻样芽孢杆菌发酵液的制备方法如下：将柿子核干燥后研磨成粉，过10目筛，得到柿子核粉；将柿子核粉与牛肉膏蛋白胨液体培养基按照2：20的质量比混合均匀，得到胶冻样芽孢杆菌培养基质；往胶冻样芽孢杆菌培养基质中接种胶冻样芽孢杆菌种子液，混合均匀，然后在28±2℃下以200r/min的振荡速度培养至对数末期，得到胶冻样芽孢杆菌发菌液。对比例3胶冻样芽孢杆菌发酵液的制备方法如下：往牛肉膏蛋白胨液体培养基中接种胶冻样芽孢杆菌种子液，混合均匀，然后在28±2℃下以200r/min的振荡速度培养至对数末期，得到胶冻样芽孢杆菌发菌液。检测实施例1和对比例1-3中得到的胶冻样芽孢杆菌发菌液中胶冻样芽孢杆菌的有效活菌数，具体见表1。表1胶冻样芽孢杆菌发酵液中有效活菌数方法实施例1对比例1对比例2对比例3有效活菌数(1010cfu/ml)2.61.21.80.5由表1可知，对比例3的胶冻样芽孢杆菌发菌液中胶冻样芽孢杆菌的有效活菌数最低，其他组均较高，说明发酵培养基中添加柿子皮粉和柿子核粉有助于增加胶冻样芽孢杆菌的生长，而普通的牛肉膏蛋白胨液体培养基中不含柿子皮粉和柿子核粉，故有效活菌数较低；实施例1、对比例1-2中都添加有柿子皮粉和柿子核粉，故有效活菌数较高，比单独使用牛肉膏蛋白胨液体培养基效果好，说明柿子皮粉和柿子核粉对于促进胶冻样芽孢杆菌的生长具有重要作用；通过比较实施例1、对比例1和对比例2的数据，我们发现柿子核粉的效果较柿子皮粉好，且柿子皮粉和柿子核粉配合使用的效果更好，说明二者能够协同增效。以上试验结果表明，本发明实施例的培养基培养具备显著增加胶冻样芽孢杆菌有效活菌数的效果。为了进一步说明本发明的效果，本发明还设置了下述对比例，具体如下：对比例4微生物饲料添加剂中仅含乳酸菌发酵液。对比例5一种复合微生物饲料添加剂，其配方和实施例1相同，不同之处在于对比例1的配方中没有添加胶冻样芽孢杆菌发酵液，且制备方法中也不含胶冻样芽孢杆菌发酵液的制备步骤。对比例6一种复合微生物饲料添加剂，其配方和实施例1相同，不同之处在于对比例1的配方中没有添加长枝木霉发酵液，且制备方法中也不含长枝木霉发酵液的制备步骤。对比例7一种复合微生物饲料添加剂，其配方和实施例1相同，不同之处在于对比例1的配方中没有添加小球藻藻液，且制备方法中也不含小球藻藻液的制备步骤。需要说明的是，本发明实施例和对比例中，乳酸菌种子液、胶冻样芽孢杆菌种子液的接种量均为10ml种子液/千克基质。下面仅以实施例1和对比例4-7制备出的微生物饲料添加剂进行性能测试，以对本发明的效果进行说明。1、试验对象试验动物选取日龄28±1、平均体重5.5-6.5kg，且在相同饲养条件下饲养的健康仔猪120头，随机分为6组，每组20头，组间差异不显著。试验组为1组，喂食实施例1制备的微生物饲料添加剂+普通饲料；对照组为4组，分别喂食对比例1-4制备的微生物饲料添加剂+普通饲料；药物对照组喂普通饲料+抗生素(硫酸黏杆菌素10mg/kg+利高霉素25mg/kg)。所有仔猪于28日龄当天经耳静脉注入5ml质量浓度为1.0％的绵羊红细胞悬液，试验期为14d。需要说明的是，上述各组中微生物饲料添加剂的添加量和普通饲料添加量的质量比为1：99，抗生素与普通饲料的质量比也是1：99，且普通饲料是购买自安徽兴皖畜牧科技开发有限公司的10％仔猪复合预混合饲料。2、试验方法各组仔猪采用高床漏缝饲养，按照常规方法对猪舍进行消毒，使其自由采食、饮水。在试验前、试验7d后、试验14d后的清晨，空腹条件下，分别从9组活体经耳静脉采血少量，经颈静脉采血8-10ml(加1％肝素钠抗凝)，然后进行中性粒细胞及外周血淋巴细胞百分数的测定、绵羊红细胞抗体效价的测定、血清γ-球蛋白含量的测定以及外周血中单核细胞增殖率的测定。其中，中性粒细胞及外周血淋巴细胞百分数的测定采用耳静脉血进行常规的白细胞分类计数；绵羊红细胞抗体效价的测定采用耳静脉血用常规微量法血凝试验测定仔猪绵羊红细胞抗体效价(绵羊红细胞浓度为1.0％)；血清γ-球蛋白含量的测定方法如下：耳静脉血分离血清，醋酸纤维薄膜电泳法分离血清中各蛋白组分，染色、洗脱后于分光光度计上620nm测定od值，测γ-球蛋白相对含量；外周血中单核细胞增殖率的测定方法如下：肝素钠抗凝血液hank’s液稀释后，加入ficoll分离液(gehealthcare)，2000r/min水平离心30min；吸取单个核细胞界面层，hank’s液洗涤2次，以rpmi1640完全培养液调整细胞浓度为2×106/ml，加入40孔无菌细胞培养板，每孔加入细胞悬液0.1ml，并加入含有或不含有pha的rpmi1640完全培养液(终浓度10μg/ml)，以作刺激转化或自发转化对照，每份样品加3孔。置37℃、5％co2培养箱培养66h，然后加入mtt液(pbs配制，ph7.2)使其终浓度为0.5mg/ml。继续培养6h，再加入20％sds液(含50％二甲基酰胺，ph4.7)，37℃作用12h，于分光光度计上570nm处测od值。在试验期间，记录试验期内每天每组仔猪的腹泻率，并在试验期的第14d早晨对仔猪只进行空腹称重，计算猪增重和料重比。3、数据处理采用spss12.0统计软件进行统计处理，计量资料数据以表示，用多个样本均数比较的单因素方差分析，计数资料采用x2检验。4、试验结果试验结果如表2所示。表2对仔猪中性粒细胞及外周血淋巴细胞百分数的影响/％从表2可以看出，本发明实施例1提供的微生物饲料添加剂可以显著提高仔猪血液系统中的中性粒细胞，显著降低淋巴细胞，其效果和抗生素效果相当。表3对仔猪血清绵羊红细胞抗体效价(log2)的影响从表3可以看出，本发明实施例1提供的饲料添加剂能够显著提高仔猪的免疫应答反应，其效果和抗生素效果相当。表4对仔猪血清γ-球蛋白含量(od值)的影响从表4可以看出，本发明实施例1提供的饲料添加剂能够显著增强仔猪免疫力，其效果和抗生素效果相当。表5对仔猪外周血中单核细胞增殖率(od值)的影响从表5可以看出，采用抗生素显著降低了外周血单核细胞增值率，但是采用本发明的实施例和对比例对外周血单核细胞增值率无显著影响。表6对仔猪生产性能的影响由表6可以得出，饲喂实施例1的复合微生物饲料添加剂后，在2周内仔猪的日采食量、日增量和腹泻控制率都和药物对照组相当，表明本发明提供的复合微生物饲料添加剂可以显著改善仔猪的肠道发育和健康，可以缓解仔猪断奶后的应激反应，有效提高仔猪采食量和体量，有效的解决了仔猪的腹泻问题。本发明描述了优选的实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。当前第1页12