一种含山茶籽粕的菌酶协同发酵方法与流程

本发明涉及一种含山茶籽粕的菌酶协同发酵方法，属于发酵工程技术领域。

背景技术：

乳酸菌(lacticacidbacteria，lab)归类于乳酸菌科。乳酸菌是革兰氏染色阳性、无芽孢(个别属除外)、不运动或少运动、耐酸的球菌或杆菌，其能利用可发酵糖产大量乳酸。乳酸菌广泛存在于人和动物肠道及许多食品中。乳酸菌不但可以提升食品的营养价值，改善食品风味，帮助改善食品的保藏性，还可以调节人体胃肠道正常菌群、保持微生态平衡，对人和动物健康都有益。乳酸菌通过发酵碳水化合物，可以分泌大量有机酸、乳酸菌素、过氧化氢等抑菌物质来抑制腐败菌的生长来改善食品的风味和品质。近年来，在豆粕发酵过程中常常人工添加发酵剂以获得更好的产品风味和质量，而乳酸菌因其优异的性能在食品生产方面被认为是良好的发酵剂且可取代添加剂。

油茶是广泛分布于中国和西方国家的一种多用途植物，含有多种活性化合物，具有较高的营养特性和药用价值，是近年来被关注的小油种之一。我国山茶树的种植量逐年增长，传统方法只注重出油率，不重视副产品的质量，在生产山茶籽油的过程产生大量的山茶籽粕，这些山茶籽粕粗纤维含量高，粗蛋白含量和消化率(氨基酸利用率)低，而且有毒物质如茶皂素含量极高。当其作为饲料添加剂使用时，具有溶血作用的茶皂素的存在不仅会降低饲料的适口性，还会引起动物胃肠中毒、肝脏损害、惊厥和昏迷，甚至死亡。目前饲料加工厂普遍采用添加酸化剂以求达到适合牲畜的最适酸碱度，忽略了适口性对牲畜的重要性，此外，目前也无法有效处理山茶籽粕中的单宁及黄酮等多酚类物质，导致蛋白质消化率降低，干扰某些营养元素的吸收(如fe、ca等)。还有一些大型机械制造商曾试图在前期处理工艺中对山茶籽粕脱溶进行优化，来提高山茶籽粕的品质，但加工成本高，适口性差。若山茶籽粕未经发酵和脱毒，其味辛辣苦涩，适口性差，对牲畜类毒性极强，因此，传统上山茶籽粕不作为饲料资源，也没有被很好地利用，造成大量的浪费。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是提供一种降解山茶籽粕的方法，是将水、植物乳杆菌dy6、碱性蛋白酶和纤维素酶添加到含山茶籽粕的环境中进行发酵；所述水分的含量为30-50％(m/m)，所述纤维素酶的含量为300-400u/g底物，所述碱性蛋白酶的含量为800-1500u/g底物，所述植物乳杆菌dy6的接种量为1-5％(v/m)。

所述植物乳杆菌dy6，公开于cn107446852a的专利申请中，已于2017年6月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，分类学命名为植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)dy6，保藏编号为cctccno:m2017138，保藏地址为中国武汉，武汉大学。

在本发明的一种实施方式中，所述植物乳杆菌dy6的菌体浓度为10⁵-10⁷cfu/g或10⁵-10⁷cfu/ml。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵的条件为在35℃-37℃发酵20-30h。

在本发明的一种实施方式中，所述水分的含量为50％(m/m)，所述纤维素酶的含量为300u/g底物，所述碱性蛋白酶的含量为800u/g底物，所述植物乳杆菌dy6的接种量为5％(v/m)。

在本发明的一种实施方式中，所述水分的含量为40％(m/m)，所述纤维素酶的含量为400u/g底物，所述碱性蛋白酶的含量为800u/g底物，所述植物乳杆菌dy6的接种量为4％(v/m)。

在本发明的一种实施方式中，所述水分的含量为30％(m/m)，所述纤维素酶的含量为300u/g底物，所述碱性蛋白酶的含量为1200u/g底物，所述植物乳杆菌dy6的接种量为4％(v/m)。

本发明的第二个目的是提供一种发酵剂，包括水、植物乳杆菌dy6、碱性蛋白酶和纤维素酶；所述发酵剂中水分含量为30-50％(m/m)、纤维素酶含量为300-400u/g底物、碱性蛋白酶含量为800-1500u/g底物、植物乳杆菌dy6接种量为1-5％(v/m)。

本发明的第三个目的是提供上述发酵剂或上述方法在食品防腐方面的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用是先利用上述的降解山茶籽粕的方法进行发酵，再将发酵产物添加到食品中抑制金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和/或大肠杆菌的繁殖。

本发明的第四个目的是提供上述发酵剂或上述方法在制备饲料中的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用用于提高有机酸含量。

在本发明的一种实施方式中，所述有机酸包括乳酸、柠檬酸、苹果酸的一种或多种。

在本发明的一种实施方式中，所述应用用于增加香气物质。

本发明的第五个目的是提供上述发酵剂或上述方法在制备香精或香料中的应用。

本发明的有益效果：

(1)本发明提供的植物乳杆菌菌酶协同发酵山茶籽粕方法，不仅大大提高了山茶籽粕的抑菌能力和有机酸(尤其是乳酸)的含量，还有效地减少了山茶籽粕辛酸苦涩味，提高适口性，这让山茶籽粕成为饲料添加剂变成了可能；

(2)发酵后乳酸产量较未发酵之前提高了6.3倍，产酸能力适中，不会导致山茶籽粕的过分酸化；

(3)发酵后检测到的发酵产物苯甲酸是一种新型的抑菌剂，96孔板检测的抑菌率高达62％，用于饲料添加剂中，能够提高禽畜类免疫力并建立良好的肠道微生物系统；

(4)菌酶协同发酵后出检测出含量不等的乙偶姻、3-甲基丁酸、2，3-丁二酮、十二酸乙酯、壬酸等，其中有许多都是制作香精香料的常用材料，这也大大提高了发酵山茶籽粕的适口性；

(5)该方法还提高了山茶籽粕的附加值，有利于废弃物再利用。

附图说明

图1是植物乳杆菌dy6在平板培养基形态。

图2是植物乳杆菌dy6在mrs培养基中的生长曲线。

图3是植物乳杆菌dy1-dy6抑菌实验抑菌圈。

图4是菌酶协同发酵山茶籽粕后，发酵上清液中主要的有机酸含量图。

图5是菌酶协同发酵山茶籽粕发酵前后风味物质的变化图。

具体实施方式

(一)菌株抑菌圈直径的测定方法

指示菌菌液的制备：将大肠杆菌、沙门氏菌和金黄葡萄球菌三种指示菌接种于lb液体培养基，37℃培养24h。

采用牛津杯法：取直径约90mm的平板，分别倾注加热融化的营养琼脂培养基15-20ml，使其在平板内均匀摊布，放置水平台面上使凝固，作为底层。另取半固体营养琼脂培养基(琼脂含量为1％)适量加热融化后，放冷至48-50℃，每50-100ml培养基加入指示菌的菌悬液0.1-0.2ml，在每个平板中分别加5ml，使其在底层上均匀摊布，作为菌层。在每个平板中以等距离均匀安置牛津杯4-5个备用，每个双层平板中的牛津杯中分别滴装200μl乳酸菌上清液，37℃培养10-13h后，测量各抑菌圈直径以作出评价。

(二)有机酸含量测定方法

用紫外法测定发酵上清液中有机酸的含量，有机酸标样1g/l，有机酸柱(aninexhpx-87hionexchangecolumn)柱温30℃，流动相5mmol/lh2so4溶液，流速0.6ml/min，进样量20μl，标样及样品跑14min。输出图谱进行分析。根据出峰时间和峰面积和标准品比对，计算样品中各种有机酸的含量。

(三)风味物质含量测定方法

精确称取2g发酵粕于20ml顶空瓶中。顶空条件：平衡温度120℃，传输线温度120℃，定量环温度120℃，加压时间0.5min，平衡时间30min，循环时间50min，定量环填充时间0.5min，定量环平衡时间0.5min，进样时间1min。

实施例1：菌株的筛选

本发明菌株采用平板稀释分离法从山茶籽粕样品中分离筛选出抑菌效果好的革兰氏阳性菌株。分离筛选方法如下所述：

1、混合菌种的稀释：称取山茶籽粕样品，将1g山茶籽粕放入mrs培养基37℃培养24小时，并进行菌液的梯度稀释；

2、配制mrs培养基：蛋白胨10.0g，牛肉膏8.0g，酵母粉4.0g，葡萄糖20.0g，磷酸氢二钾2.0g，柠檬酸三铵2.0g，乙酸钠5.0g，七水硫酸镁0.58g，四水硫酸锰0.25g，吐温801ml，蒸馏水1l，115℃灭菌20分钟；

3、菌株的初筛：取步骤1中梯度稀释后的菌液100微升涂于初筛添加有溴甲酚紫的mrs固体培养基平板，37℃培养24小时。选择生长快、菌落大、黄色菌圈大的菌株(见图1)，经过多次初筛，得到6株乳酸菌种，将其编号为dy1-dy6(dy6的生长曲线见图2)；

4、菌种的复筛：将初筛出来的6株菌dy1-dy6接入到复筛液体培养基(蛋白胨10.0g，牛肉膏8.0g，酵母粉4.0g，葡萄糖20.0g，磷酸氢二钾2.0g，柠檬酸三铵2.0g，乙酸钠5.0g，七水硫酸镁0.58g，四水硫酸锰0.25g，吐温801ml，蒸馏水1l，ph6.5)，37℃，200rpm培养24h，测定dy1-dy6的抑菌效果。

结果表明，dy6相对于其他5株菌对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌有良好的抑制作用(见表1和图3)。最终筛选出编号dy6的菌种作为发酵山茶籽粕的菌株。

表1植物乳杆菌抑菌效果

菌种的鉴定：将筛选出来的菌种dy6涂布于mrs固体培养基，挑取单菌落利用通用引物1492r和27f进行扩增，将扩增产物交由生工生物工程(上海)有限公司进行16srrna测序，序列所得结果通过ncbi中的nucleotideblast同源性比对。比对结果显示与genbank中相关模式菌株(lactobacillusplantarumwcfs1，编号1108)的16srna有99％的相似性，确定该菌株为植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)。

所述植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)dy6，已经公开于专利申请cn107446852a中。已于2017年6月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:m2017138。

实施例2：植物乳杆菌发酵山茶籽粕工艺确定及抑菌效果

为了探究菌酶协同发酵后抑菌活性的最优营养成分配比和发酵工艺，以mrs培养基为基础，设计正交试验来研究以下四个成分对发酵山茶籽粕的效果：水、纤维素酶、碱性蛋白酶、菌液dy6。因素水平见表2。

表2菌酶协同发酵成分的筛选因素与水平

表3正交实验结果

通过正交实验(见表3)分析，菌酶协同发酵山茶籽粕的较佳工艺条件是：水分为50％、纤维素酶为300u/g底物、碱性蛋白酶为800u/g底物、dy6接种量为5％。

通过96孔板法测定发酵山茶籽粕上清液对大肠杆菌的抑制效果。

取50μl的菌浓为10⁸cfu/ml大肠杆菌菌悬液添加到150μl过滤除菌的发酵上清液(添加水分含量50％(m/m)、纤维素酶含量为300u/g底物、碱性蛋白酶含量为800u/g底物、dy6接种量为5％(v/m)，以山茶籽粕为底物，以mrs为发酵培养基，在35℃-37℃发酵24h，将得到的固体发酵物2g溶于10ml的无菌水中，漩涡震荡10分钟充分混匀，分装在1.5ml的无菌离心管中，12000rpm，5min离心后在超净工作台用0.22μm孔径的无菌滤膜过滤除去固体颗粒)的96孔板中，37℃培养24h后应用酶标仪测定od600值，以接种大肠杆菌菌悬液与无菌水作为对照组。筛选出od600小于对照组的发酵粕(发酵后的山茶籽粕)。

表496孔板试验数据(od600)

注：对照组中的平行1、2、3加的是50μl大肠杆菌菌悬液和150μl未进行菌酶协同发酵的山茶籽粕的上清液；而发酵组中的平行1、2、3中加的是50μl大肠杆菌菌悬液+150μl菌酶协同发酵上清液；对照是50μl大肠杆菌菌悬液+150μl无菌水。

抑菌率的计算方式如下：

实验结果(见表4)表明对照组抑菌率为-11％，发酵组抑菌率为62％。对照组出现负抑菌率，可能是由于大肠杆菌利用未发酵的山茶籽粕为生长基质继续生长。

实施例3：菌酶协同发酵前后有机酸含量的变化

酸化剂可以降低饲料ph值，使胃内ph值下降，提高消化酶的活性。酸化剂在构建禽畜健康的肠道菌群的能力不如有机酸，为了禽畜的抗病性能，常常在饲料中添加过量的酸化剂，而这一方面影响了饲料的适口性，一方面增加了成本。

本发明用菌酶协同发酵山茶籽粕后得到的发酵产物乳酸代替酸化剂能很好地弥补酸化剂在构建健康肠道菌群能力方面的不足。

测定实施例2中所得发酵上清液中的有机酸含量，发现乳酸、柠檬酸、苹果酸等含量显著提高(见表5和图4)。其中乳酸在发酵后含量提高了6.3倍。

表5发酵前后有机酸含量的变化

实施例4：发酵前后提高饲料适口性的芳香物质

饲料风味剂又称诱食剂、食欲增进剂，其作用原理与动物的味觉、嗅觉、呼吸系统、消化系统等功能密切相关。可以提高饲料的适口性。

顶空试验检测结果表明，实施例2所得发酵上清液中的主要风味物质中乙偶姻、辛酸乙酯、1-辛酸-3-醇、辛酸、癸酸乙酯十二酸乙酯含量相对较高(见表6和图5)。采用植物乳杆菌dy6菌酶协同发酵后风味物质变化明显，其中包括：乙偶姻、3-甲基丁酸、2，3-丁二酮、十二酸乙酯、壬酸等。乙偶姻常用作医药中间体，食用香料，主要用于配置奶油、乳品、酸奶和草莓等型香料，具有强烈的奶油、脂肪、白脱样香气，高度稀释后有令人愉快的奶香气，其在发酵后提含量高了61％；3-甲基丁酸有刺激性酸败味，高度稀释后则有甜润的果香，常用于烘烤食品、肉制品，更多用于生产香料，在发酵后含量提高13倍；在菌酶协同发酵后出检测出含量不等的2，3-丁二酮、十二酸乙酯、壬酸，这些都是制作香精香料的常用材料；苯甲酸可作为抑菌剂。此外，发酵产物中检测到3％的苯甲醛，虽含量不高，但是也有少量的刺激性气味，在发酵后苯甲醛降低到1.5％；甲基环戊烷对眼睛、皮肤、粘膜和上呼吸道有刺激性，在发酵后没有检测到。

表6发酵前后风味物质的变化

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。