一种果汁中棒曲霉素的消减方法和果汁的安全生产方法与流程

本发明涉及果汁加工安全控制领域，尤其涉及一种果汁中棒曲霉素的消减方法和果汁的安全生产方法。
背景技术：
：棒曲霉素(patulin，pat)，又叫展青霉素，主要是由扩展青霉产生的次级代谢产物，具有致癌、致畸作用、神经毒性、基因毒性和细胞毒性，被iarc组织定为iii类致癌物。苹果汁(包括澄清苹果汁、浑浊苹果汁和浓缩苹果汁)因富含营养、口感好和易保存等优势而深受消费者的喜爱。我国是苹果汁的生产和消费大国，然而国内外生产的苹果汁经常被检测出棒曲霉素，这严重威胁着消费者的健康，并给生产经营者造成巨大的经济损失。为此，欧美及中国等国家规定苹果汁中棒曲霉素的最大残留限量为50μg/l。目前果汁企业去除棒曲霉素的主要方法就是利用大孔树脂吸附法，该方法虽能有效脱除棒曲霉素，但存在前处理复杂、使用成本高、易携带异味、产品损失大、易造成二次交叉污染和环境污染等问题，因此急需开发一种高效、安全、环保、经济的果汁中棒曲霉素消减方法。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种果汁中棒曲霉素的消减方法和一种果汁的安全生产方法，本发明以l-半胱氨酸为脱毒剂，可有效将棒曲霉素转化为稳定、无毒的产物。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了一种果汁中棒曲霉素的消减方法，包括如下步骤：将果汁半成品与l-半胱氨酸混合后，经巴氏杀菌，完成果汁中棒曲霉素的消减。优选地，所述巴氏杀菌在密闭条件进行，温度为70～100℃，时间为10～20min。优选地，所述l-半胱氨酸以溶液的形式加入，所述溶液为l-半胱氨酸的澄清果汁溶液。优选地，所述l-半胱氨酸的澄清果汁溶液中l-半胱氨酸的质量浓度为20～25％；优选地，所述果汁半成品和l-半胱氨酸的澄清果汁溶液的体积比为1000:0.50～0.80。优选地，所述果汁半成品为苹果汁半成品，所述l-半胱氨酸的澄清果汁溶液为l-半胱氨酸的澄清苹果汁溶液；所述苹果汁半成品为苹果原料依次经预处理、破碎、榨汁和过滤后所得产物，或为苹果原料依次经预处理、破碎、打浆、酶解、榨汁和澄清后所得产物。优选地，所述苹果汁半成品用于生产澄清苹果汁时，所述苹果汁半成品为苹果原料依次经预处理、破碎、打浆、酶解、榨汁和澄清后所得产物，所述苹果汁半成品与l-半胱氨酸的澄清苹果汁溶液的体积比为1000:0.50～0.60；所述巴氏杀菌前，还包括超滤。优选地，所述苹果汁半成品用于生产浓缩苹果汁时，所述苹果汁半成品为苹果原料依次经预处理、破碎、打浆、酶解、榨汁和澄清后所得产物，所述苹果汁半成品与l-半胱氨酸的澄清苹果汁溶液的体积比为1000:0.55～0.65；所述巴氏杀菌前，还包括超滤和浓缩。优选地，所述苹果汁半成品用于生产浑浊苹果汁时，所述苹果汁半成品为苹果原料依次经预处理、破碎、榨汁和过滤后所得产物，所述苹果汁半成品与l-半胱氨酸的澄清苹果汁溶液的体积比为1000:0.60～0.80；所述巴氏杀菌前，还包括脱气。本发明还提供了一种果汁的安全生产方法，包括如下步骤：生产果汁半成品，然后将所得果汁半成品按照上述技术方案所述的消减方法进行消减后，进行无菌灌装，得到果汁。本发明以l-半胱氨酸为脱毒剂，将果汁半成品与l-半胱氨酸混合后，经巴氏杀菌，完成果汁中污染的棒曲霉素的消减，具体机理为l-半胱氨酸是含有一个巯基(-sh)的氨基酸，具有还原性，棒曲霉素具有亲电特性，能与含巯基的半胱氨酸亲核试剂在巴氏杀菌条件下发生michael加成反应，生成多种更加稳定的加合物，且产物的毒性远小于棒曲霉素本身的毒性、甚至无毒。本发明所提供的消减方法在巴氏杀菌条件下即可完成，在应用于果汁生产时，可以不改变果汁的总体制备工艺，仅在巴氏杀菌前，加入l-半胱氨酸即可得到棒曲霉素含量低甚至无棒曲霉素的果汁，适合工业化应用。附图说明图1为本发明实施例中生产苹果汁的流程图；图2为本发明所提供的消减方法获得的果汁经棒曲霉素提取得到的提取液对hepg2细胞活力影响的测试结果图；图3为细胞毒理学测试中hepg2细胞形态变化图。具体实施方式本发明提供了一种果汁中棒曲霉素的消减方法，包括如下步骤：将果汁半成品与l-半胱氨酸混合后，经巴氏杀菌，完成棒曲霉素的消减。在本发明中，l-半胱氨酸是含有一个巯基(-sh)的氨基酸，具有还原性，棒曲霉素具有亲电特性，在巴氏杀菌条件下能与含巯基的半胱氨酸亲核试剂发生michael加成反应，生成多种更加稳定的产物，且产物的毒性远小于棒曲霉素本身的毒性、甚至无毒，所述michael加成反应的反应式如下式所示：在本发明中，所述巴氏杀菌优选在密闭条件下进行，温度优选为70～100℃，时间优选为10～20min。在本发明中，所述l-半胱氨酸(简称脱毒剂)优选以溶液的形式加入，所述溶液优选为l-半胱氨酸的澄清果汁溶液(简称为脱毒液)；配制所述l-半胱氨酸的澄清果汁溶液用澄清果汁优选为不含棒曲霉素的澄清果汁。在本发明中，l-半胱氨酸常温下呈固体粉末状态，为了保证半胱氨酸充分溶解并均匀分散在果汁中，先将l-半胱氨酸溶于少量果汁中，再加入到生产中的果汁中。在本发明中，所述l-半胱氨酸的澄清果汁溶液中l-半胱氨酸的质量浓度优选为20～25％；所述果汁半成品和l-半胱氨酸的澄清果汁溶液的体积比优选为1000:0.50～0.80。本发明对所述果汁半成品具体为哪一步骤所得产品没有特殊限定，本领域技术人员可以根据生产果汁的工艺，将巴氏杀菌前任意步骤所得半成品认定为本发明中所述的果汁半成品；此外，本领域技术人员可以根据生产果汁的工艺需求，在加入l-半胱氨酸的步骤和巴氏杀菌的步骤之间加入其他操作步骤。在本发明实施例中，所述果汁半成品优选为苹果汁半成品，所述l-半胱氨酸的澄清果汁溶液优选为l-半胱氨酸的澄清苹果汁溶液；所述苹果汁半成品优选为苹果原料依次经预处理、破碎、榨汁和过滤后所得产物，或优选为苹果原料依次经预处理、破碎、打浆、酶解、榨汁和澄清后所得产物；所述澄清果汁优选为不含有棒曲霉素的澄清果汁。本发明对所述澄清苹果汁的来源没有特殊限定，可以为市售不含棒曲霉素的澄清苹果汁或是按照本发明中所述的澄清苹果汁的安全生产方法生产得到的澄清苹果汁。本发明对所述预处理、破碎、榨汁和过滤的操作没有特殊限定，按照常规的生产苹果汁时所用的操作方式即可；本发明对所述预处理、破碎、打浆、酶解、榨汁和澄清的操作没有特殊限定，按照常规的生产苹果汁时所用的操作方式即可；在本发明中，所述预处理即常规生产苹果汁时对苹果原料的清洗、挑选和热处理的步骤。本发明对所述果汁半成品中的棒曲霉素含量没有特殊限定，符合gb2761-2017《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》的规定即可，即＜50μg/l。在本发明实施例中，所述苹果汁半成品用于生产澄清苹果汁时，所述苹果汁半成品优选为苹果原料依次经预处理、破碎、打浆、酶解、榨汁和澄清后所得产物，所述苹果汁半成品与l-半胱氨酸的澄清苹果汁溶液的体积比优选为1000:0.50～0.60，更优选为1000:0.55；所述巴氏杀菌前，还包括超滤。在本发明实施例中，所述苹果汁半成品用于生产浓缩苹果汁时，所述苹果汁半成品优选为苹果原料依次经预处理、破碎、打浆、酶解、榨汁和澄清后所得产物，所述苹果汁半成品与l-半胱氨酸的澄清苹果汁溶液的体积比为1000:0.55～0.65，更优选为1000:0.60；所述巴氏杀菌前，还包括超滤和浓缩。在本发明实施例中，所述苹果汁半成品用于生产浑浊苹果汁时，所述苹果汁半成品优选为苹果原料依次经预处理、破碎、榨汁和过滤后所得产物，所述苹果汁半成品与l-半胱氨酸的澄清苹果汁溶液的体积比为1000:0.60～0.80，更优选为1000:0.60；所述巴氏杀菌前，还包括脱气。在本发明中，完成棒曲霉素的消减后，进行无菌灌装，即可得到果汁。此外，本领域技术人员还可以根据需要在消减后进行后处理(如与其他种类的果汁混合，以制备其他口味的果汁)，然后再无菌灌装。本发明还提供了一种果汁的安全生产方法，包括如下步骤：生产果汁半成品，然后将所得果汁半成品按照上述技术方案所述的消减方法进行消减后，进行无菌灌装，得到果汁。在本发明实施例中，所述果汁优选为浑浊苹果汁、澄清苹果汁或浓缩苹果汁；当所述果汁为浑浊苹果汁时，具体包括如下步骤：将苹果原料依次经预处理、破碎、榨汁和过滤后，得到苹果汁半成品；将所述苹果汁半成品与l-半胱氨酸混合后，依次经脱气、巴氏杀菌和无菌灌装，得到浑浊苹果汁；当所述果汁为澄清苹果汁时，具体包括如下步骤：将苹果原料依次经预处理、破碎、打浆、酶解、榨汁和澄清后，得到苹果汁半成品；将所述苹果汁半成品与l-半胱氨酸混合后，依次经超滤、巴氏杀菌和无菌灌装，得到澄清苹果汁；当所述果汁为浓缩苹果汁时，具体包括如下步骤：将苹果原料依次经预处理、破碎、打浆、酶解、榨汁和澄清后，得到苹果汁半成品；将所述苹果汁半成品与l-半胱氨酸混合后，依次经超滤、浓缩、巴氏杀菌和无菌灌装，得到澄清苹果汁。在本发明实施例中，当所述果汁为浑浊苹果汁时，本发明对所述预处理、破碎、榨汁和过滤的操作没有特殊限定，按照常规的果汁半成品的生产方法生产即可。在本发明实施例中，所述预处理优选包括清洗、挑选和热处理；所述清洗优选包括初次清洗和二次清洗，所述初次清洗优选为浸泡清洗，可除去苹果表面的泥沙、石块、金属等，所述二次清洗优选为喷淋清洗，使苹果得到进一步清洗；所述挑选是指将霉烂变质果、杂质等挑选拣出，所述挑选后，所得苹果的烂果率优选≤2％；所述热处理优选在42～47℃的水中进行，时间优选为40～50min，所述热处理可提高浑浊果汁的出汁率和稳定性；所述破碎所得果浆中果块的粒度优选为4～6mm，所述破碎时加入占待破碎苹果的质量的0.05％的vc及0.02％的nacl，以进行护色处理；所述榨汁优选为使用双螺旋压榨机对破碎后的果浆进行压榨，压榨后果汁进入一级过滤工序，果汁出汁率达到80％以上，残留的果渣在压榨机内进行加水萃取并进行二级压榨；所述l-半胱氨酸优选以溶液的形式加入，所述溶液优选为l-半胱氨酸的澄清苹果汁溶液，所述l-半胱氨酸的澄清苹果汁溶液中l-半胱氨酸的质量浓度优选为20～25％；所述果汁半成品和l-半胱氨酸的澄清苹果汁溶液的体积比优选为1000:0.60～0.80；所述巴氏杀菌的条件与前述消减方法中的巴氏杀菌条件相同，在此不再赘述；本发明对所述脱气和无菌灌装的操作没有特殊限定，采用常规的生产果汁所用的脱气和无菌灌装的操作即可，如无菌灌装可以为在>95℃的灭菌条件下将果汁灌入无菌袋中。在本发明中，当所述果汁为澄清苹果汁时，本发明对所述预处理、破碎、打浆、酶解、榨汁、澄清、超滤、杀菌和无菌灌装的操作没有特殊限定，采用常规的果汁半成品的生产方法生产即可。在本发明实施例中，所述预处理和破碎的操作与生产浑浊苹果汁时的预处理和破碎操作相同，在此不再赘述；所述酶解所用酶优选为果胶酶和淀粉酶，所述酶解的温度优选为50～53℃，时间优选为90min，本领域技术人员可以根据需要选择果胶酶和淀粉酶的用量；酶解后的果汁输送至压榨装置进行榨汁，然后澄清；所述超滤可除去果汁中不溶性物质和分子大于0.02μm的物质(包括微生物)以及可能存在的金属碎屑等杂质；所述l-半胱氨酸优选以溶液的形式加入，所述溶液优选为l-半胱氨酸的澄清苹果汁溶液，所述l-半胱氨酸的澄清苹果汁溶液中l-半胱氨酸的质量浓度优选为20～25％；所述果汁半成品和l-半胱氨酸的澄清苹果汁溶液的体积比优选为1000:0.50～0.60；所述巴氏杀菌和无菌灌装的操作与浑浊苹果汁生产中的杀菌和无菌灌装的操作相同，在此不再赘述。在本发明中，当所述果汁为浓缩苹果汁时，本发明对所述预处理、破碎、打浆、酶解、榨汁、澄清、超滤、浓缩、巴氏杀菌和无菌灌装的操作没有特殊限定，采用常规的生产浓缩苹果汁的操作即可；所述l-半胱氨酸优选以溶液的形式加入，所述溶液优选为l-半胱氨酸的澄清苹果汁溶液，所述l-半胱氨酸的澄清苹果汁溶液中l-半胱氨酸的质量浓度优选为20～25％；所述果汁半成品和l-半胱氨酸的澄清苹果汁溶液的体积比优选为1000:0.55～0.65；在本发明实施例中，上述操作中，除浓缩外，其他操作与生产澄清苹果汁时的操作相同，在此不再赘述；本领域技术人员可以根据需要进行浓缩。下面结合实施例对本发明提供的一种果汁中棒曲霉素的消减方法和苹果汁的安全生产方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。实施例1按照图1所示的流程生产澄清苹果汁，脱毒液(l-半胱氨酸的澄清苹果汁(不含棒曲霉素))中l-半胱氨酸的质量浓度为20％；具体操作如下：将原料苹果在果槽中浸泡清洗后，经喷淋清洗后，进行挑选，挑选后的烂果率小于2％，然后用45℃的水处理40min后，与占苹果0.05％的vc和0.02％的nacl混合进行破碎，所述破碎所得果块的粒度为4～6mm；将破碎所得果块依次进行打浆、酶解、榨汁和澄清，得到果汁半成品，记为澄清果汁半成品，将所述澄清果汁半成品与脱毒液混合，其中所述澄清果汁半成品与脱毒液的用量比为1l:0.55ml；然后将所得混合液依次经超滤、巴氏杀菌和无菌灌装，得到澄清苹果汁；其中巴氏杀菌在密闭条件下进行，温度为95℃，时间为10min；采用高效液相色谱测试澄清苹果汁中的棒曲霉素含量，记为残留pat含量，结果如表1所示。按照上述方法，不加脱毒液，生产澄清苹果汁，并采用高效液相色谱测试其中的棒曲霉素含量，记为原始pat含量，并以此为基准，计算棒曲霉素脱除率，结果如表1所示。实施例2按照图1所示的流程生产浓缩苹果汁，脱毒液(l-半胱氨酸的澄清苹果汁(不含棒曲霉素))中l-半胱氨酸的质量浓度为20％；具体操作如下：按照实施例1所述的方法生产果汁半成品，记为浓缩果汁半成品，然后将所述浓缩果汁半成品与脱毒液混合，其中所述浓缩果汁半成品与脱毒液的用量比为1l:0.60ml；然后将所得混合液依次经超滤、浓缩、巴氏杀菌和无菌灌装，得到浓缩苹果汁；其中巴氏杀菌在密闭条件进行，温度为90℃，时间为15min；采用高效液相色谱测试浓缩苹果汁中的棒曲霉素含量，记为残留pat含量，结果如表1所示。按照上述方法，不加脱毒液，生产浓缩苹果汁，并采用高效液相色谱测试其中的棒曲霉素含量，记为原始pat含量，并以此为基准，计算棒曲霉素脱除率，结果如表1所示。实施例3按照图1所示的流程生产浑浊苹果汁，脱毒液(l-半胱氨酸的澄清苹果汁(不含棒曲霉素))中l-半胱氨酸的质量浓度为20％；具体操作如下：将原料苹果在果槽中浸泡清洗和喷淋清洗后，进行挑选，挑选后的烂果率小于2％，再用45℃的水处理40min后，与占苹果0.05％的vc和0.02％的nacl混合进行破碎，所述破碎所得果块的粒度为4～6mm；将破碎所得果块进行榨汁和过滤，得到果汁半成品，记为浑浊果汁半成品，将所述浑浊果汁半成品与脱毒液混合，其中浑浊果汁半成品与脱毒液的用量比为1l:0.60ml；然后将所得混合液依次经脱气、巴氏杀菌和无菌灌装，得到浑浊苹果汁；其中巴氏杀菌在密闭条件下进行，温度为80℃，时间为20min；采用高效液相色谱测试浑浊苹果汁中的棒曲霉素含量，记为残留pat含量，结果如表1所示。按照上述方法，不加脱毒液，生产浑浊苹果汁，并采用高效液相色谱测试其中的棒曲霉素含量，记为原始pat含量，并以此为基准，计算棒曲霉素脱除率，结果如表1所示。表1实施例1～3所得苹果汁中的棒曲霉素含量测试结果细胞毒理学实验：1.细胞培养使用dmem培养液(含10％胎牛血清，青霉素100u/ml和链霉素100μg/ml)，于37℃、5％co2细胞培养箱内培养hepg2细胞。待细胞生长至大约80％满时，用胰酶消化、传代。选用对数生长期且状态良好的细胞用于实验。2.mtt法测定细胞活力将上述收集的hepg2细胞重新悬浮于新鲜的培养液中调整细胞浓度，按每孔约2×105个细胞接种于96孔板里，置5％的co2培养箱(thermofisherscientific,waltham,ma,usa)培养过夜，待细胞充分贴壁，分别加入经不同巴氏杀菌时间消减处理后的澄清苹果汁提取液(即按照实施例1的方法生产澄清苹果汁，巴氏杀菌处理的时间分别为5、10、15和20min，然后按照gb5009.185-2016中的5.2.2的方法依次进行提取(不加同位素)和净化所得净化液100μl作为样品组，每个样品设6个复孔。将不含棒曲霉素的澄清苹果汁提取液作为阴性对照，将含棒曲霉素但未加脱毒液的苹果汁提取液(即按照实施例1的生产方法，不加脱毒液，生产澄清苹果汁(其中棒曲霉素浓度为25mg/l)，然后按照gb5009.185-2016中的5.2.2的方法依次进行提取和净化所得净化液)作为阳性对照，将阳性对照和阴性对照分别加入至细胞充分贴壁后的孔内。将上述样品组、阳性对照和阴性对照作用的hepg2细胞培养24h后，每孔加入20μlmtt溶液，继续培养4h后，用移液器吸去孔内培养液，每孔再加入150μldmso溶液，于摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解，酶标仪(infinitem200pro,tecan,switzeland)测定550nm处的吸光度(a550nm)。按照以下公式计算细胞活力：细胞活力(％)＝(a脱毒样品-a阴性对照)/(a阳性对照-a阴性对照)结果如图2所示，其中a、b、c和d为显著差异分析结果，横坐标表示杀菌处理的时间，control表示阴性对照组，反应时间为0处的柱子为阳性对照组的细胞活力测试结果。由图2可知，杀菌处理10～20min时，细胞活力与对照组接近，说明杀菌处理10～20min，可将棒曲霉素充分转化为毒性较小或无毒的加合物。3.细胞形态观察上述处理的细胞在倒置显微镜(olympus,tokyo,japan)下观察并拍照。结果如图3所示，其中(a)为阴性对照的细胞形态图，(b)为阳性对照的细胞形态图，(c)为杀菌处理5min时的细胞形态图，(d)为杀菌处理10min时的细胞形态图，(e)为杀菌处理15min时的细胞形态图，(f)为杀菌处理20min时的细胞形态图，由图3可知杀菌处理的时间越长，贴壁细胞的生长越好，细胞形态与阴性对照的细胞形态越接近，其中杀菌时间为10min以上时，与阴性对照的细胞形态基本相同，而阳性对照的细胞形态图中，细胞出现了离散和死亡，说明细胞受到棒曲霉素毒性的影响，细胞活力下降。对比例1大孔树脂的预处理：将大孔树脂用去离子水清洗浸泡1h，再用乙醇浸泡处理4h，放出浸液，再用水在室温下浸泡清洗10h后装柱，然后用澄清苹果汁(不含棒曲霉素)以一定流速通过树脂柱，得到湿树脂；分别按照实施例1～3所述的方法生产果汁半成品，然后分别加入湿树脂进行棒曲霉素消减，然后将所得消减果汁按照实施例1～3中的后处理方法，生产澄清苹果汁、浓缩苹果汁和浑浊苹果汁，其中湿树脂与果汁半成品的体积比为1:30；所得澄清苹果汁、浓缩苹果汁和浑浊苹果汁的颜色变浅，且带有异味。以前述实施例1～3中所测澄清苹果汁、浓缩苹果汁和浑浊苹果汁的原始pat浓度为基准，计算脱除率。结果如表2所示。对比例2分别按照实施例1～3所述的方法制备果汁半成品，然后分别加入活性炭进行棒曲霉素消减，然后按照实施例1～3中的后处理方法，制备澄清苹果汁、浓缩苹果汁和浑浊苹果汁，其中以每升果汁半成品活性炭的用量计，所述活性炭的用量为3.0g/l，具体的消减条件为在60℃处理5min，然后过滤，去除活性炭，得到苹果汁；所得澄清苹果汁、浓缩苹果汁和浑浊苹果汁的颜色变浅。以前述实施例1～3中所测澄清苹果汁、浓缩苹果汁和浑浊苹果汁的原始pat浓度为基准，计算脱除率。结果如表2所示。对比例3分别按照实施例1～3所述的方法生产果汁半成品，然后将所得果汁半成品在500w的功率超声处理90min，然后按照实施例1～3中的后处理方法，生产澄清苹果汁、浓缩苹果汁和浑浊苹果汁，所得澄清苹果汁、浓缩苹果汁和浑浊苹果汁的颜色变深。以前述实施例1～3中所测澄清苹果汁、浓缩苹果汁和浑浊苹果汁的原始pat浓度为基准，计算脱除率。结果如表2所示。由实施例1～3、对比例1～3和表1～2可知，大孔树脂吸附棒曲霉素时，大孔树脂使用前要进行复杂的预处理以除去残留的有机溶剂，同时还要使其充分溶胀；且脱毒效果差，受果汁ph、浑浊度等影响大，携带异味，果汁颜色变浅，易造成吸附剂残留，生产成本高、产品得率低(吸附过程会造成果汁的损失)、易造成二次交叉污染；活性炭的脱毒效果差，所得果汁颜色变浅，易造成吸附剂残留，生产成本高、产品得率低、易造成二次交叉污染；而超声脱毒的方法，虽然成本低，但是效果很差，且果汁颜色变深。表2对比例1～3的消减方法对棒曲霉素的脱除率脱除率对比例1对比例2对比例3澄清苹果汁66.37％68.11％45.82％浓缩果汁61.92％65.78％39.61％浑浊苹果汁54.46％52.55％35.27％以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3