一种茯苓菌丝体木姜叶柯发酵茶的制备方法及其应用与流程

【技术领域】

本发明涉及一种茯苓菌丝体木姜叶柯发酵茶的制备方法及其应用。

背景技术：

妊娠糖尿病(gestationaldiabetesmellitus,gdm)发病率高，呈现逐年增加的趋势，严重危害母子妊娠期和产后健康。gdm的管控，主要沿用防治糖尿病的方式。尽管糖尿病防治取得了长足的进步，但对gdm的药物防治仍然存在许多不确定性，如给药途径、药物本身的毒副作用等，因此，从药食同源资源中开发gdm防治制剂非常必要。鉴于木姜叶柯叶资源丰富而利用率低，本试验以木姜叶柯粗老叶为原料，接种茯苓菌丝体，发酵制备木姜叶柯发酵茶，然后检测茯苓菌丝体木姜叶柯发酵茶对高脂喂养c57bl6j小鼠gdm模型的缓解作用，为有效合理开发利用木姜叶柯粗老叶提供理论及实践基础。

木姜叶柯(lithocarpuslitseifoliusfolium)又名甜茶(通称)、多穗石柯，为壳斗科石柯属植物，以野生形式零星分布于我国长江以南各省区的低山密林中，其中湖南中西部雪峰山脉一带分布较多。据《全国中草药汇编》记载，多穗柯茶能防治高血压、治疗湿热痢疾、皮肤瘙痒等症，而且具有滋养肝肾、和胃降逆、润肺止咳、解困醒酒等功效。现有科学研究表明，木姜叶柯的化学成分主要为黄酮类和三萜类成分，其中二氢查尔酮类是其主要的甜味成分和有效成分，在抗炎、镇痛、调节免疫、增强抗应激能力、降血脂、抗脂肪肝、抗ii型糖尿病及糖尿病并发症、协同增进抗肿瘤药物疗效等方面有作用。鉴于木姜叶柯的甜度高、热量低、口感好，再加上其药用功效，已在2017年通过国家卫计委审批可以作为新资源食品使用。

茯苓为多孔菌科真菌的干燥菌核，我国首载于《神农本草经》。作为我国传统的食药同源真菌，茯苓中富含多糖、三萜、脂肪酸、甾醇、酶、矿质元素等多种活性成分，其中，茯苓多糖具有抗肿瘤、抗癌、抗病源微生物、抗炎、抗氧化、抗衰老、增强免疫力、保肝、催眠、消石、降血糖等药理活性。三萜类化合物具有调节免疫、抗肿瘤、抗hbv、保肝、抗白血病、抗衰老、抗炎、改善大脑记忆、防结石等功效。

目前，茯苓的来源大多还是延续传统，以人工栽培为主，但是此方法容易受到外界环境以及生产条件的影响，存在生产周期长、对劳动力需求大、产品性质不稳定等缺点。现有研究表明，茯苓皮和茯苓发酵菌丝体中茯苓萜类化合物的含量显著高于茯苓块。因此，采用液态发酵技术生产茯苓功效成分，可达到缩短生长周期、活性成分稳定且可实现规模化自动化生产等优点。自20世纪70年代以来，中外学者己从茯苓皮、茯苓菌核或菌株培养液中提取分离了多种三萜类化合物。高学玲等研究了茯苓液态发酵产总三萜的提取工艺和最佳培养条件，张雪莉等研究了茯苓中三萜酸类化合物提取的最佳工艺，为提取研究实验提供了理论数据。张杨等茯苓发酵菌丝体中3种主要三萜酸类成分的积累动态，但是对于茯苓三萜类化合物的化学组成还有待研究。周燕丽等通过调控茯苓液态发酵条件，发现菌丝体的生长与其代谢产物的积累密切相关。

微生物代谢产物的生理活性是目前国内外天然产物提取的研究热点，但是，关于茯苓菌丝体的代谢产物的生理活性研究的相关报道还非常有限，因此，从事相关科学研究具有很好的现实意义。

发酵茶是以茶叶为基质，通过自然接种或人工接种微生物，借助微生物生长代谢作用使茶叶发生深度生化变化的产物，典型代表有黑茶(普洱茶和茯砖茶)。在黑茶渥堆发酵过程中，微生物产生的胞外酶作用和微生物呼吸产热作用下发生复杂的物质转化，如碳水化合物被分解成小分子的糖及可溶性糖，现出感官上的＂甘＂；叶中所含蛋白质在蛋白酶作用多种氨基酸，增加茶汤＂鲜爽＂；香物质及糖类反应产生萜烯醇类化合物呈现出陈香味；茶多酚经发酵部分转化为茶色素，赋予其独特的红褐汤色；同时微生物通过自身的代谢产生氨基酸、维生素、矿物质等营养物质一同进入茶汤被人们饮用，利于于人体的健康。

魏晓惠向粗老绿毛茶中人工接种不同浓度的茯苓菌丝体进行发酵，发现可以缩短发花周期，改善绿毛茶原有的粗涩品质，形成独特的色香味品质。赵云林等研究了在绿茶样品接种茯苓菌丝体，通过控制温度和湿度，使得发酵茶兼具传统绿茶和茯砖茶的特点，提升了绿茶的内在品质及附加值。另外，还有科研工作者将茯苓菌丝体与荷叶茶、普洱茶、台湾茶、夏秋茶鲜叶的制备工艺结合，改善茶叶品质，提供茶叶附加值，开发新的茶叶加工工艺。近年来，发酵茶因为其独特的品质特点和保健功效，收到消费者的广泛喜爱，其中，茯砖茶作为黑茶中较为独特的一种，收到越来越多人的关注，引发许多学者的研究兴趣，而茯砖茶中特有的茯苓菌丝体是大家关注及研究的热点。茯苓菌丝体作为一种利于人体健康的优势菌种在茶产品加工、研制茶叶新产品方面还有待进一步的开发利用。

俗话说：“春茶香，夏茶涩，秋茶好喝无人摘”。春茶滋味浓醇鲜爽，香气高雅而持久，适宜用于加工名茶，而夏秋茶中多酚类物质含量较高，氨基酸、维生素、芳香物质等含量偏低，使得夏秋茶口感苦涩，清香缺乏。但是，按照木姜叶柯树叶的生长规律及其叶片在生长不同阶段中活性成分的含量变化，仅对其嫩叶进行开发利用，造成了资源的极大浪费，因此，木姜叶柯粗老鲜叶的充分利用已是木姜叶柯生产基地一个亟待解决的问题。

技术实现要素：

本发明的目的在于利用木姜叶柯粗老鲜叶进行茯苓菌丝体木姜叶柯发酵茶的研究，分析jh-1木姜叶柯发酵茶产品发酵过程中化学成分和品质特征的变化，得出切实可行的发酵工艺，最终得到茯苓菌丝体木姜叶柯发酵茶产品，不仅可以提高木姜叶柯粗老鲜叶的利用率，同时，还可以利用微生物发酵技术，开发具有特殊风味及营养保健功效的新型微生物发酵茶制品，使产品品质得到改善，丰富了产品种类。最后，在得到茯苓菌丝体木姜叶柯发酵茶产品的基础上，研究其对高脂喂养c57bl6j小鼠gdm模型的缓解作用，促进了茶叶生物技术的研究，为功能性食品的研究提供科学的理论依据。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种茯苓菌丝体木姜叶柯发酵茶的制备方法，包括如下步骤：

步骤一、茯苓菌丝体剂的制备；

挑取茯苓菌丝体保存菌株，接种入pdb培养液体基，28℃静置培养24h，震荡混匀，倍比稀释，以10⁵-10⁸稀释度涂布入pda培养固体基，28℃倒置培养3d，直至出现典型单菌落；

挑取典型单菌落接种入pdb培养液体基，28℃培养3d，收集培养液，在4℃温度下，5000rpm离心5min分离收集菌体，用无菌生理盐水洗涤3次，加入无盐离子的营养液，震荡混匀，在-20℃温度冷冻过夜，在-80℃温度冷冻40min，再进行冷冻干燥处理，冷冻干燥处理后的菌种以1mg/瓶，装瓶，置于-20℃温度冰箱保存，即为茯苓菌丝体剂；

步骤二、茯苓菌丝体木姜叶柯叶发酵处理；

准确称取一定量经过杀青处理的木姜叶柯叶和质量体积1:1的饮用水，混匀，装入干湿分离的发酵容器，121℃温度灭菌30min，取出冷却，按照1mg/100g的木姜叶柯叶接种茯苓菌丝体剂，摇匀，28℃温度培养4d；

步骤三、发酵茶制备；

充分发酵后的木姜叶柯叶经过121℃温度灭菌30min，成型，烘干，得到茯苓菌丝体木姜叶柯叶发酵茶。

优选的，所述发酵容器为带隔层滤网的广口发酵瓶。

优选的，在步骤二中，准确称取500.00g木姜叶柯和500ml饮用水，并接种5～10支茯苓菌丝体剂。

本发明还提供了一种茯苓菌丝体木姜叶柯发酵茶对高脂喂养c57bl6j小鼠gdm模型的缓解作用的应用，包括如下步骤：

步骤一、发酵茶浸提液制备及冻干；

称取500g茶叶，加入8倍质量体积分数的60％的乙醇溶液，室温浸提4h，粉碎后，超声波辅助浸提10min，然后60℃条件下浸提50min，过滤，重复上述操作2次，合并滤液，浸提物经旋蒸浓缩至约100ml，经冷冻干燥，既为发酵茶浸提剂；

步骤二、高脂喂养c57bl6j小鼠gdm模型；

实验动物分组和模型建立；

提供8w龄c57bl/6j小鼠，包括雌鼠40只，雄鼠20只，体重18～22g，所有小鼠饲料适应性喂养1w后，雌鼠随机标记二标，按照数字先后分成普通饲料饲养组和高脂饲料饲养组，所有小鼠延续饲养1w，隔2d测定空腹糖耐量和胰岛素耐量，排除前期出现糖尿病症状小鼠；

小鼠gdm模型缓解作用；

延续饲养1w后，雄雌鼠按照1:2合笼，查到阴栓，查到阴栓时计算为第1d，妊娠建立后，妊娠1-12d每隔2d测定空腹糖耐量和胰岛素耐量，妊娠12-18d，隔1d测定空腹糖耐量和胰岛素耐量，妊娠18d下午4点后终止实验，排除普通饲料饲养组糖尿病症状小鼠，高脂饲料饲养组于妊娠9d的开始以发酵茶浸提物灌胃直至实验结束，最优剂量为90mg/kg/d；安乐处死小鼠，采集血液、胎盘、胎儿和内脏器官，用于后续实验，同时测定胎盘指数和胎儿指数。

优选的，浸提包括水浸提和有机溶剂浸提，浸提温度包括常温和40～80℃水浴浸提。

优选的，发酵茶浸提物给药小鼠方式为口服，包括自由采食、自有饮水和灌胃，给药剂量为1-1000mg/kg/d。

优选的，给药剂量为90mg/kg/d。

本发明的有益效果如下：

1、经发酵后，木姜叶柯叶色由黄色变为红褐色，表面有明显的茯苓菌丝体附着，汤色橙红明亮，香气由原来的略带青草气变得醇香，滋味变得更为醇和；

2、木姜叶柯发酵茶的干物质含量为96.21％，水浸出物含量为49.54％，粗纤维含量下降至19.42％，总黄酮含量上升至85.30mg/100g，茶多酚含量为22.5％，游离氨基酸总量为0.75％，含有多种氨基酸，并且赖氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、苏氨酸、亮氨酸和异亮氨酸等7种人体必需氨基酸的含量均有不同程度的升高；

3、从妊娠期12d开始，以90mg/kg/d剂量灌服高脂喂养c57bl6j小鼠gdm模型5d，小鼠焦虑表型消失，糖耐量水平逐渐恢复至正常。

【附图说明】

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：

图1为木姜叶柯叶氨基酸分析图；

图2为茯苓菌丝体木姜叶柯叶发酵茶氨基酸分析图；

图3为经茯苓菌丝体发酵后的木姜叶柯叶纤维素含量图；

图4为经茯苓菌丝体发酵后的益生因子含量图；

图5为浸提剂灌服后的妊娠小鼠的体重增长图；

图6为浸提剂灌服后的妊娠小鼠的糖耐量能力图；

图7为孕鼠经浸提剂灌服后，胎儿重量与模型、对照组的对比图；

图8为孕鼠经浸提剂灌服后，胎盘重量与模型、对照组的对比图。

【具体实施方式】

下面将结合本发明具体实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供一种茯苓菌丝体木姜叶柯发酵茶的制备方法，包括如下步骤：

步骤一、茯苓菌丝体剂的制备；

挑取茯苓菌丝体保存菌株，接种入pdb培养液体基，28℃静置培养24h，震荡混匀，倍比稀释，以10⁵-10⁸稀释度涂布入pda培养固体基，28℃倒置培养3d，直至出现典型单菌落；

挑取典型单菌落接种入pdb培养液体基，28℃培养3d，收集培养液，在4℃温度下，5000rpm离心5min分离收集菌体，用无菌生理盐水洗涤3次，加入无盐离子的营养液，震荡混匀，在-20℃温度冷冻过夜，在-80℃温度冷冻40min，再进行冷冻干燥处理，冷冻干燥处理后的菌种以1mg/瓶，装瓶，置于-20℃温度冰箱保存，即为茯苓菌丝体剂；

步骤二、茯苓菌丝体木姜叶柯叶发酵处理；

准确称取一定量经过杀青处理的木姜叶柯叶和质量体积1:1的饮用水，混匀，装入干湿分离的发酵容器，121℃温度灭菌30min，取出冷却，按照1mg/100g的木姜叶柯叶接种茯苓菌丝体剂，摇匀，28℃温度培养4d；

具体的，准确称取500.00g木姜叶柯和500ml饮用水，并接种5～10支茯苓菌丝体剂，所述发酵容器为带隔层滤网的广口发酵瓶。

步骤三、发酵茶制备；

充分发酵后的木姜叶柯叶经过121℃温度灭菌30min，成型，烘干，得到茯苓菌丝体木姜叶柯叶发酵茶。

请参阅图3和4所示，可见，经茯苓菌丝体发酵以后，木姜叶柯叶纤维素含量显著减少，木姜叶柯叶半纤维素等益生因子含量显著增多。

对本发明提供的制备方法制备的茯苓菌丝体木姜叶柯叶发酵茶进行测评：

1、感官审评；

木姜叶柯经发酵后，叶色由黄色变为红褐色，表面有明显的茯苓菌丝体附着，汤色橙红明亮，香气由原来的略带青草气变得醇香，滋味变得更为醇和。由此可见，经过发酵，木姜叶柯叶的感官品质发生了一定的变化，口感尚佳，适于饮用。

2、茯苓菌丝体木姜叶柯叶发酵茶干物质含量；

茯苓菌丝体木姜叶柯叶发酵茶的干物质含量相比发酵前有略微升高，达到96.21％，这可能是由发酵代谢产物的增加所致。

3、茯苓菌丝体木姜叶柯叶发酵茶水浸出物含量；

茯苓菌丝体木姜叶柯叶发酵茶的水浸出物含量相比发酵前有略微升高，达到48.54％，这可能是由于微生物的发酵作用，产生大量的可溶性发酵代谢产物所致。

4、茯苓菌丝体木姜叶柯叶发酵茶粗纤维含量；

茯苓菌丝体木姜叶柯叶发酵茶的粗纤维含量相比发酵前大幅下降，由81.2％降低至19.42％，这可能是因为茯苓菌丝体的代谢过程中分泌大量的胞外酶，而这些胞外酶部分具有降解纤维素的能力，从而使得粗纤维含量大量降低；另外，此类粗纤维也可以作为微生物生长代谢所需要的能源物质。

5、茯苓菌丝体木姜叶柯叶发酵茶总黄酮含量；

茯苓菌丝体木姜叶柯叶发酵茶的总黄酮含量相比发酵前有小幅升高，由9.6％上升至15.30％，这可能是因为微生物的代谢作用、温度、ph、氧气等外在条件的改变，有利于总黄酮的稳定，且茯苓的代谢产物中产生新的黄酮类化合物，从而使得总黄酮含量上升。

6、茯苓菌丝体木姜叶柯叶发酵茶茶多酚含量；

茯苓菌丝体木姜叶柯叶发酵茶的茶多酚含量相比发酵前有略微降低，由24.87％下降至22.5％，这可能是因为在发酵的过程，茶多酚由于氧化作用逐渐转化为茶黄素、茶红素等茶色素，使得汤色黄橙明亮，滋味上消除了苦涩感而变得醇厚回甘。

7、茯苓菌丝体木姜叶柯叶发酵茶游离氨基酸总量；

茯苓菌丝体木姜叶柯叶发酵茶的游离氨基酸总量相比发酵前中的游离氨基酸总量显著上升，由0.32％上升至0.75％，这可能是由于茯苓菌丝体分泌的蛋白酶使蛋白质分解为游离氨基酸造成的含量显著增高。

对木姜叶柯叶和茯苓菌丝体木姜叶柯叶发酵茶的氨基酸成分进行分析测定，测定结果如图1、图2所示。

由图1可知，多穗石柯叶中共检测到16种氨基酸，其中有7种人体必需氨基酸：赖氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、苏氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。

通过比较图1、图2可知，木姜叶柯叶通过茯苓菌丝体发酵后，氨基酸含量均有不同程度的升高，其中蛋氨酸的升高幅度最大，发酵后的含量比发酵前提高了近7倍，可作为蛋氨酸获取的一个有效来源。

综上可见，经发酵后，木姜叶柯叶色由黄色变为红褐色，表面有明显的茯苓菌丝体附着，汤色橙红明亮，香气由原来的略带青草气变得醇香，滋味变得更为醇和。由此可见，经过发酵，木姜叶柯叶的感官品质发生了一定的变化，口感尚佳，适于饮用。

木姜叶柯发酵茶的干物质含量为96.21％，水浸出物含量为49.54％，粗纤维含量下降至19.42％，总黄酮含量上升至85.30mg/100g，茶多酚含量为22.5％，游离氨基酸总量为0.75％，含有多种氨基酸，并且赖氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、苏氨酸、亮氨酸和异亮氨酸等7种人体必需氨基酸的含量均有不同程度的升高。

本发明还提供了一种茯苓菌丝体木姜叶柯发酵茶在对高脂喂养c57bl6j小鼠gdm模型的缓解作用的应用，所述茯苓菌丝体木姜叶柯发酵茶由茯苓菌丝体木姜叶柯发酵茶的制备方法制得；

一种茯苓菌丝体木姜叶柯发酵茶对高脂喂养c57bl6j小鼠gdm模型的缓解作用的应用，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、发酵茶浸提液制备及冻干；

称取500g茶叶，加入8倍质量体积分数的60％的乙醇溶液，室温浸提4h，粉碎后，超声波辅助浸提10min，然后60℃条件下浸提50min，过滤，重复上述操作2次，合并滤液，浸提物经旋蒸浓缩至约100ml，经冷冻干燥，既为发酵茶浸提剂；

需要进一步说明的是，浸提包括水浸提和有机溶剂浸提，浸提温度包括常温和40～80℃水浴浸提，发酵茶浸提物给药小鼠方式为口服，包括自由采食、自有饮水和灌胃，给药剂量为1-1000mg/kg/d，优选的，给药剂量为90mg/kg/d。

步骤二、高脂喂养c57bl6j小鼠gdm模型；

实验动物分组和模型建立；

提供8w龄c57bl/6j小鼠，包括雌鼠40只，雄鼠20只，体重18～22g，所有小鼠饲料适应性喂养1w后，雌鼠随机标记二标，按照数字先后分成普通饲料饲养组(normal＝12只)和高脂饲料饲养组(又分为2组，既gdmmodels＝14；pf-treat＝14)，所有小鼠延续饲养1w，隔2d测定空腹糖耐量和胰岛素耐量，排除前期出现糖尿病症状小鼠；

小鼠gdm模型缓解作用；

延续饲养1w后，雄雌鼠按照1:2合笼，查到阴栓，查到阴栓时计算为第1d，妊娠建立后，妊娠1-12d每隔2d测定空腹糖耐量和胰岛素耐量，妊娠12-18d，隔1d测定空腹糖耐量和胰岛素耐量，妊娠18d下午4点后终止实验，排除普通饲料饲养组糖尿病症状小鼠，高脂饲料饲养组于妊娠9d的开始以发酵茶浸提物灌胃直至实验结束，最优剂量为90mg/kg/d；安乐处死小鼠，采集血液、胎盘、胎儿和内脏器官，用于后续实验，同时测定胎盘指数和胎儿指数。

需要进一步说明的是，妊娠期18d安乐处死小鼠，收集内脏器官，肝脏组织westernblot检测显示，与模型对照组比较，灌服组irs和akt磷酸化水平显著增加，glut4表达水平显著上调。从妊娠期9d开始，以90mg/kg/d剂量灌服高脂喂养c57bl6j小鼠gdm模型5d，小鼠焦虑表型消失，糖耐量水平逐渐恢复至正常。

参阅图5所示，浸提剂灌服减缓了妊娠小鼠的体重增长速度；请参阅图6所示，浸提剂灌服部分恢复了妊娠小鼠的糖耐量能力；请参阅图7所示，孕鼠经浸提剂灌服后，胎儿重量与模型比较显著减轻，而与对照组比较体重接近，缓解了胎儿的过大生长，避免产生巨大儿；请参阅图8所示，孕鼠经浸提剂灌服后，胎盘重量与模型比较显著减轻，而与对照组比较体重接近，缓解了妊娠小鼠胎盘指数过大增长。

本发明提供的一种茯苓菌丝体木姜叶柯发酵茶的制备方法及其应用，茯苓发酵有利于木姜叶柯活性成分释放，二者药食性物质互补增强；而发酵后，茶多酚的降低对于妊娠期使用安全提供了一定的保障；根据复杂理论体系推测发酵剂中黄酮和三萜类物质有利于提高胰岛素敏感性，增加糖原合成，从而减轻血糖压力，通过上调glut增加机体糖脂平衡能力。据此，木姜叶柯-茯苓菌丝体发酵剂能够缓解gdm模型小鼠表型，产生保护性作用，是一种非常有前景的药食同源物。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但并不仅仅限于说明书和实施方案中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。