一种从小麦面筋蛋白中酶法制备富含IPP和VPP水解物的方法与流程

本发明属于蛋白质水解技术领域，具体涉及一种从小麦面筋蛋白中酶法制备富含ipp和vpp水解物的方法。

背景技术：

ile-pro-pro（ipp）和val-pro-pro（vpp）是两种具有明确体内降血压功效的多肽。因为这两种三肽以及leu-pro-pro（lpp）最初是从瑞士乳杆菌发酵的酸奶中产生的，所以把这三种三肽合称为乳三肽，其中ipp位于β-酪蛋白的74-76位和κ-酪蛋白的84-86位、vpp位于β-酪蛋白的108-110位、lpp位于β-酪蛋白的151-153位。ipp和vpp对轻度高血压患者具有明确的预防和治疗作用，目前酪蛋白是乳三肽的唯一来源。为了开发新型的基于乳三肽的降血压产品，寻找除酪蛋白以外的乳三肽新来源具有重要意义。

小麦是世界上最重要的农作物之一，其生产面粉后的副产物小麦面筋蛋白来源极其丰富、蛋白质含量也很高。小麦面筋蛋白主要由麦醇溶蛋白和麦谷蛋白组成，其中麦醇溶蛋白占小麦蛋白总量的40%-50%、麦谷蛋白占小麦蛋白总质量的30%-40%，另有少量的淀粉、纤维、糖、脂肪和矿物质等。小麦面筋蛋白的氨基酸组成中，脯氨酸约占氨基酸总量的16%，表明其可能是乳三肽的潜在来源。美国国家生物信息中心（ncbi）的氨基酸序列查询结果表明，小麦面筋蛋白的α--醇溶蛋白（abq52121）和ω-醇溶蛋白（aaa34289）中分别含有1个和4个ipp片段、γ-醇溶蛋白（aat01617）和hmw-gs（cac40686）分别含有1个vpp片段（见表1~4），证实了小麦面筋蛋白是ipp、vpp的良好来源。如果能够将ipp、vpp从小麦面筋蛋白中定向释放出来，这对于寻找乳三肽除酪蛋白外的新来源、提高小麦面筋蛋白的综合利用价值具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种从小麦面筋蛋白中酶法制备富含ipp和vpp水解物的方法，本发明通过多种蛋白酶酶解小麦面筋粉，然后通过精制制得富含ipp和vpp的水解物，该制备方法的蛋白质回收率高、水解产物的ipp和vpp丰富、体内降血压功效明确。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了一种从小麦面筋蛋白中酶法制备富含ipp和vpp水解物的方法，包括以下步骤：

（1）将小麦面筋蛋白在ph值为9.0~13.0的碱性溶液中溶解，再经超声处理，，得到小麦面筋蛋白溶液；

（2）将碱性蛋白酶加入到所述小麦面筋蛋白溶液中，在水浴摇床或水解罐内于40~60℃和100~150r/min转速下水解2~8h，得到水解液；

（3）调节所述水解液的ph值至中性或弱酸性，同时加入蛋白酶水解，在45~75℃，100~130r/min的转速下水解2~6h，100℃灭酶10~15min，得到水解液；

（4）所述水解液灭酶离心取上清液，并用超滤膜超滤，收集透过液；

（5）所述透过液用大孔树脂进行脱色脱苦，得到脱苦脱色液；

（6）所述脱色脱苦液用离子交换树脂进行吸附后，对离子交换树脂进行洗脱，得到富含ipp和vpp的水解物；

（7）对水解物进行干燥，得到富含ipp和vpp的小麦面筋蛋白水解物粉末。

进一步的，所述步骤（1）中所述碱性溶液为naoh或naco3溶液；超声处理条件为50~100w功率，处理时间5~25min。

最优的，所述碱性溶液为naco3溶液，超声处理条件为50w处理10min。

进一步的，所述步骤（2）中使用的碱性蛋白酶为alcalase2.4l或地衣芽孢杆菌2709碱性蛋白酶；碱性蛋白酶的添加量为反应体系中小麦面筋蛋白重量的0.1~3.0%。

最优的，所述碱性蛋白酶为alcalase2.4l，其添加量为反应体系中小麦面筋蛋白重量的0.5%。

进一步的，所述步骤（3）中使用的ph调节试剂为0.1mol/l的hcl或柠檬酸溶液；所加入的蛋白酶为风味蛋白酶和复合蛋白酶或风味蛋白酶和木瓜蛋白酶；所述蛋白酶的添加量为反应体系中小麦面筋蛋白重量的0.1~3.0%。

最优的，所述ph调节试剂为柠檬酸，所用的蛋白酶组合为风味蛋白酶和复合蛋白酶，其添加量为反应体系中小麦面筋蛋白重量的0.3%。

进一步的，所述步骤（4）中的离心条件为5000r/min离心20min；超滤中使用的超滤膜为分子截留量5000dal的biomax膜，入口压力为25psi，等透过液无蛋白质检出后即为超滤终点，收集透过液。

进一步的，所述步骤（5）中使用的是xad-16型大孔树脂，其添加量为5~25%（w/v）、料液ph值为4.0~8.0、脱色温度为20~40℃、脱色时间为0.5~2.5h。

最优的，所述的脱色条件为添加量5%、料液ph值5.0~7.0、温度20℃、脱色时间1.0h。

进一步的，所述步骤（6）中所使用的离子交换树脂为na型阳离子交换树脂，料液的ph值在3.5~5.5之间；吸附方法为将调节了ph值的料液流经离子交换柱，然后用3~5倍床体积的ph值为3.5~5.5的蒸馏水冲洗柱子，直至流出液在220nm下无吸收为止。

最优的，所述的离子交换树脂为732型阳离子交换树脂，料液的ph值在5.0，用4倍体积的、与料液相同ph值的蒸馏水冲洗柱子。

进一步的，所述步骤（6）中离子交换树脂的洗脱方法为用ph值为10.5的naoh溶液进行洗脱，直至洗脱液在220nm下无吸收为止。

进一步的，所述步骤（7）中的干燥方法为喷雾干燥法或冷冻干燥法。

最优的，所述的干燥方法为喷雾干燥法。

本发明还提供了所述的从小麦面筋蛋白中酶解法制备富含ipp和vpp水解物的方法制得的富含ipp和vpp的水解物。

本发明还提供了所述的富含ipp和vpp的水解物在制备用于降血压食品的补充剂中的应用。

本发明与现有技术相比，具有如下以下优点和有益效果：

1、本发明所述方法的小麦面筋蛋白的蛋白质回收率高。ipp和vpp含有脯氨酰肽键，欲将两者从原料中释放出来需要多种蛋白酶的共同参与。本发明采用的多酶体系水解能力强大，除可将ipp和vpp释放出来之外，还能深度水解小麦面筋蛋白，整个酶解过程蛋白质回收率高和小麦面筋蛋白的综合利用程度高。

2、本发明水解产物的脱苦脱色方法简单可行。由于小麦面筋蛋白中富含疏水性氨基酸，因此水解产物的苦味大、颜色深。目前普遍采用活性炭对水解产物进行脱苦和脱色处理，但是活性炭无法重复利用易造成环境污染，且有部分多肽会被活性炭吸附而损失。本发明采用大孔吸附树脂对水解产物进行脱苦和脱色处理，脱色效果与活性炭接近，但是大孔树脂可以重复利用，而且吸附在树脂上的多肽可回收利用，因此本发明的小麦面筋蛋白水解液脱苦脱色方法不仅能够减少污染物的排放，而且还能够实现多肽和色素的综合利用。

3、本发明利用小麦面筋蛋白作为原料通过多酶水解的方式获得富含ipp和vpp三肽的水解物，ipp和vpp含量和蛋白质回收率均较高的小麦面筋蛋白水解工艺；而且ipp和vpp已被临床证实具有明确的体内降血压功效，因此本发明的水解物体内降血压功效明确、市场化前景更好。

附图说明

图1为本发明制备ipp、vpp水解物的流程示意图。

图2为本发明实施例5所得水解物中ipp和vpp的gc-ms/ms谱图，其中a为ipp的gc-ms/ms谱图；b为vpp的gc-ms/ms谱图。

图3为本发明的超滤透过液ph值对脱色效果的影响。

具体实施方式

下面以具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件，未注明详细来源的材料，均为市售材料。

一种从小麦面筋蛋白中酶法制备富含ipp和vpp水解物的方法，其流程图如图1所示，包括以下步骤：

1、小麦面筋蛋白的预处理：将小麦面筋蛋白在ph值为9.0~13.0的naoh溶液或na2co3溶液中溶解，然后在50~100w功率下超声处理5~25min，得到小麦面筋蛋白溶液。

2、小麦面筋蛋白的碱性蛋白酶水解：将alcalase2.4l或地衣芽孢杆菌2709碱性蛋白酶按照小麦面筋蛋白重量的0.1%~3.0%添加到小麦面筋蛋白溶液中，在水浴摇床或水解罐内于40~60℃和100~150r/min下水解2~8h，得到碱性水解液。

3、小麦面筋蛋白的中性和酸性蛋白酶水解：用0.1mol/l的hcl或柠檬酸溶液调节上述碱性水解液的ph值至中性或弱酸性，同时按反应体系中小麦面筋蛋白重量的0.1~3.0%加入风味蛋白酶和复合蛋白酶或风味蛋白酶和木瓜蛋白酶，在45~75℃、100~130r/min的转速下水解2~6h，100℃灭酶10~15min，得到水解液。

4、小麦面筋蛋白水解液的超滤：将上述水解液灭酶后，在5000r/min下离心20min，收集上清液，使用的分子截留量为5000dal的biomax膜进行超滤，入口压力为25psi，等透过液无蛋白质检出后即为超滤终点，收集透过液。

5、超滤透过液的脱色和脱苦：采用xad-16型大孔树脂对透过液进行脱色，大孔树脂的添加量为5~25%（w/v）、料液ph值为4.0~8.0、脱色温度为20~40℃、脱色时间为0.5~2.5h，得到脱苦脱色液。

6、ipp和vpp的富集：使用na型阳离子交换树脂对脱苦脱色液中的ipp和vpp进行富集。调节料液的ph值至3.5~5.5之间，然后将其流经离子交换柱（ipp和vpp不得穿透），然后用3~5倍床体积的ph值为3.5~5.5的蒸馏水冲洗柱子，直至流出液在220nm下无吸收为止。

7、离子交换树脂的洗脱：用ph值为10.5的naoh溶液进行洗脱，直至洗脱液在220nm下无吸收为止，收集洗脱液，即为富含ipp和vpp的水解物。

8、水解物的干燥：采用喷雾干燥法或冷冻干燥法对水解物进行干燥，得到苦味低、颜色浅、富含ipp和vpp的小麦面筋蛋白水解物粉末,其质谱图如图2所示。

实施例1

将小麦面筋蛋白溶解在ph值为10.0的naoh溶液中，然后在50w功率下超声处理10min；再按照4000u/g面筋蛋白粉的量加入alcalase2.4l碱性蛋白酶，然后于40℃、100r/min磁力搅拌的条件下水解2h，100℃灭酶10min。

将上述水解液用1mol/lhcl溶液调节ph值至6.5，然后按照50lapu/g小麦面筋蛋白粉的量加入风味蛋白酶，在50℃的恒温水浴条件下以100r/min的搅拌速度水解2h，100℃灭酶10min。

水解液在10000r/min下离心15min，收集上清液，用分子截留量为5kda的biomax超滤膜在入口压力为15psi的条件下超滤1h；收集透过液，调节其ph值至4.0，然后用5%（w/v）的xad-16型大孔树脂在20℃下吸附脱色脱苦0.5h。将脱色液流经na型732阳离子交换柱，然后用3倍床体积的ph值为4.0的蒸馏水冲洗柱子；用ph10.5的naoh溶液进行洗脱，直至洗脱液在220nm下无吸收为止，收集洗脱液，然后喷雾干燥。

与原料小麦蛋白粉相比，该过程的蛋白质回收率为47.6%，冻干粉中ipp和vpp的总含量为0.038%（w/w）。

实施例2

将小麦面筋蛋白溶解在ph值为10.0的naoh溶液中，然后在50w功率下超声处理10min；再按照4000u/g面筋蛋白粉的量加入alcalase2.4l碱性蛋白酶，然后于40℃、100r/min磁力搅拌的条件下水解2h，100℃灭酶10min。

将上述水解液用1mol/lhcl溶液调节ph值至6.5，然后按照50lapu/g小麦面筋蛋白粉的量加入风味蛋白酶和4000u/g小麦面筋蛋白粉的量加入木瓜蛋白酶，在50℃的恒温水浴条件下以100r/min的搅拌速度水解2h，100℃灭酶10min。

水解液在10000r/min下离心15min，收集上清液，用分子截留量为5kda的biomax超滤膜在入口压力为15psi的条件下超滤1h；收集透过液，调节其ph值至4.0，然后用5%（w/v）的xad-16型大孔树脂在20℃下吸附脱色脱苦0.5h。将脱色液流经na型732阳离子交换柱，然后用3倍床体积的ph值为4.0的蒸馏水冲洗柱子；用ph10.5的naoh溶液进行洗脱，直至洗脱液在220nm下无吸收为止，收集洗脱液，然后喷雾干燥。

与原料小麦蛋白粉相比，该过程的蛋白质回收率为57.6%，冻干粉中ipp和vpp的总含量为0.061%（w/w）。

实施例3

将小麦面筋蛋白溶解在ph值为10.0的na2co3溶液中，然后在75w功率下超声处理5min；再加入地衣芽孢杆菌2709碱性蛋白酶，加酶量为4000u/g，将其在45℃、100r/min磁力搅拌的条件下水解2h，100℃灭酶10min。

将上述水解液用1mol/lhcl和1mol/lnaoh调节ph值至6.5，然后加入70lapu/g风味蛋白酶和4000u/g复合蛋白酶，在40℃恒温水浴条件下以100r/min的转速水解2h，100℃灭酶10min。

水解液在10000r/min下离心15min，收集上清液，用分子截留量为5kda的biomax超滤膜在入口压力为15psi的条件下超滤1h；收集透过液，调节其ph值至4.0，然后用5%（w/v）的xad-16型大孔树脂在20℃下吸附脱色脱苦0.5h。将脱色液流经na型732阳离子交换柱，然后用3倍床体积的ph值为4.0的蒸馏水冲洗柱子；用ph10.5的naoh溶液进行洗脱，直至洗脱液在220nm下无吸收为止，收集洗脱液，然后喷雾干燥。

与原料小麦蛋白粉相比，该过程的蛋白质回收率为43.5%，冻干粉中ipp和vpp的总含量为0.057%（w/w）。

实施例4

将小麦面筋蛋白溶解在ph值为10.0的na2co3溶液中，然后在75w功率下超声处理10min；再按照6000u/g面筋蛋白粉的量加入alcalase2.4l碱性蛋白酶，然后于40℃、100r/min磁力搅拌的条件下水解2h，100℃灭酶10min。

将上述水解液用1mol/lhcl和1mol/lnaoh调节ph值至6.5，然后加入90lapu/g风味蛋白酶和5000u/g木瓜蛋白酶，在40°c的恒温水浴条件下以100r/min的转速水解2h，100℃灭酶10min。

水解液在10000r/min下离心15min，收集上清液，用分子截留量为5kda的biomax超滤膜在入口压力为15psi的条件下超滤1h；收集透过液，调节其ph值至4.0，然后用5%（w/v）的xad-16型大孔树脂在20℃下吸附脱色脱苦1h。将脱色液流经na型732阳离子交换柱，然后用3倍床体积的ph值为4.0的蒸馏水冲洗柱子；用ph10.5的naoh溶液进行洗脱，直至洗脱液在220nm下无吸收为止，收集洗脱液，然后喷雾干燥。

与原料小麦蛋白粉相比，该过程的蛋白质回收率为63.5%，冻干粉中ipp和vpp的总含量为0.096%（w/w）。

实施例5

将小麦面筋蛋白溶解在ph值为10.0的na2co3溶液中，然后在75w功率下超声处理10min；再按照6000u/g面筋蛋白粉的量加入alcalase2.4l碱性蛋白酶，然后于40℃、100r/min磁力搅拌的条件下水解2h，100℃灭酶10min。

将上述水解液用1mol/lhcl和1mol/lnaoh调节ph值至6.5，然后加入90lapu/g风味蛋白酶和5000u/g木瓜蛋白酶，在40℃的恒温水浴条件下以100r/min的转速水解2h，100℃灭酶10min。

水解液在10000r/min下离心15min，收集上清液，用分子截留量为5kda的biomax超滤膜在入口压力为15psi的条件下超滤1h；收集透过液，调节其ph值至4.0，然后用5%（w/v）的xad-16型大孔树脂在20℃下吸附脱色脱苦0.5h。将脱色液流经na型732阳离子交换柱，然后用3倍床体积的ph值为4.0的蒸馏水冲洗柱子；用ph10.5的naoh溶液进行洗脱，直至洗脱液在220nm下无吸收为止，收集洗脱液，然后喷雾干燥。

与原料小麦蛋白粉相比，该过程的蛋白质回收率为67.1%，冻干粉中ipp和vpp的总含量为0.091%（w/w）。

实施例6

将小麦面筋蛋白溶解在ph值为10.0的na2co3溶液中，然后在75w功率下超声处理10min；再按照6000u/g面筋蛋白粉的量加入alcalase2.4l碱性蛋白酶，然后于40℃、100r/min磁力搅拌的条件下水解2h，100℃灭酶10min。

将上述水解液用1mol/lhcl和1mol/lnaoh调节ph值至6.5，然后加入90lapu/g风味蛋白酶和5000u/g木瓜蛋白酶，在40℃的恒温水浴条件下以100r/min的转速水解2h，100℃灭酶10min。

水解液在10000r/min下离心15min，收集上清液，用分子截留量为5kda的biomax超滤膜在入口压力为15psi的条件下超滤1h；收集透过液，调节其ph值至7.0，然后用5%（w/v）的xad-16型大孔树脂在20℃下吸附脱色脱苦0.5h。将脱色液流经na型732阳离子交换柱，然后用3倍床体积的ph值为4.0的蒸馏水冲洗柱子；用ph10.5的naoh溶液进行洗脱，直至洗脱液在220nm下无吸收为止，收集洗脱液，然后冷冻干燥。

与原料小麦蛋白粉相比，该过程的蛋白质回收率为62.9%，冻干粉中ipp和vpp的总含量为0.089%（w/w）。

综上，通过上述结果发现，由于小麦面筋蛋白具有溶解于碱性溶液的特性，因此先在碱性条件下利用碱性蛋白酶进行水解对于提高蛋白质回收率具有重要作用。碱性蛋白酶的种类对该目的有重要影响，当选用的碱性蛋白酶为本发明选择的两种碱性蛋白酶时蛋白质的回收率最高。蛋白质水解过程中，随着多肽不断被释放出来，反应体系的ph值会逐渐降低，这会对碱性蛋白酶的活性产物不利影响。naco3具有较强的缓冲能力，可以在没有外界干预的条件下尽可能的减少酶解过程中反应体系ph值的波动，因此更加有利于酶解过程的进行。由于风味蛋白酶特殊的专一性，该酶是释放ipp和vpp的关键，但是再额外加入其他蛋白酶有利于这两种三肽的进一步释放以及蛋白质回收率的提高。水解液的颜色较深，脱色是必不可少的步骤。在选择脱色条件时，必须保证在达到脱色效果的同时尽量减少ipp和vpp以及其它多肽的非特异性吸收，以提高整个过程的蛋白质回收率，xad-16可以很好的满足这一点；如图3所示，当在本发明规定的ph值范围内脱色效果较好，且ipp和vpp及其它多肽的损失率较低。另外，由于初始水解液中ipp和vpp的含量较低，必须对其进行富集才能使两者含量达到较高水平。阳离子交换树脂是工业生产中应用最为广泛的吸附剂，由于ipp和vpp是两性电解质，因此为了使两者能够吸附到离子交换树脂上，必须严格控制料液的ph值以使两者带正电荷，但是在洗脱时则需要采用高ph值的naoh溶液使两者带负电荷而解析。因此，在本发明限定的各操作参数的范围内，可以得到ipp和vpp含量和蛋白质回收率均较高的小麦面筋蛋白水解工艺。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。