[0001]本案关于一种野樱莓汁液的用途。特别是关于野樱莓汁液用于制备抑止肌肤老化的组合物的用途。
背景技术：
：：[0002]皮肤对于人类个体提供对抗阳光中紫外线(ultraviolet，uv)辐射、病原体、摩擦力等环境因子的第一阶段保护。皮肤由外向内依序包含表皮层、主要由结缔组织所构成的真皮层、及皮下组织。其中，真皮层包含有充足的胶原蛋白(collagen)、弹力蛋白(elastin)、及玻尿酸(hyaluronicacid)等分子，因此年轻的肌肤具有较佳的支撑性以及弹性。[0003]肌肤原本即会随年龄增长而正常老化，产生各种受损的肌肤状态。例如因受环境中的活性氧物质(reactiveoxygenspecies，ros，亦称自由基)影响，使肌肤中的胶原蛋白裂解，进而导致肌肤弹力下降、保水度不足(肌肤较为干燥、无光泽)、毛孔粗大、皱纹等现象；以及例如因黑色素沉淀，使肌肤产生斑点及/或整体较为暗沉、蜡黄等老化态样。[0004]然而，在某些其他的环境因素下，则会加速肌肤老化的进程。举例而言，一般常见的自然因素例如阳光中的紫外线。当暴露于紫外线中，紫外线将会促使肌肤细胞产生活性氧物质；此外，紫外线亦会诱发肌肤中的黑色素细胞产生黑色素，进而导致前述的各项肌肤老化态样加速生成。[0005]此外，由于在现代生活中，人们使用带有屏幕的电子产品的时间大幅增加，屏幕所发出的具有较短波长、较高能量的可见光(后称蓝光)在长时间照射肌肤的情况下，也会产生与紫外线类似的效果。因此，对于肌肤老化，蓝光亦成为不可被忽视的一项因素。技术实现要素：[0006]有鉴于此，研究或开发一种可减缓肌肤因紫外线或蓝光所造成的损害，以提供肌肤对于紫外线以及蓝光保护，进而减缓皮肤老化的组合物，来维持或改善肌肤外观是有其需求的。[0007]据此，本发明的一目的在于提供一种野樱莓汁液用于制备抗肌肤老化的组合物的用途。具体而言，本发明的一目的在于提供一种野樱莓汁液用于制备抑制自由基、抑制黑色素生成、以及促进纤维母细胞生长的组合物的用途。[0008]在一些实施例中，该组合物用以增加肌肤弹性、增加肌肤含水量、改善肌肤毛孔状态、减少肌肤皱纹、或抑止肌肤皱纹生成。[0009]在一些实施例中，该组合物中糖度为65-68°bx的野樱莓汁液占2wt％至10wt％。[0010]在一些实施例中，该组合物为医药组合物。[0011]在一些实施例中，该组合物进一步制备成保养品组合物、保健食品组合物、或化妆品组合物。[0012]在一些实施例中，该组合物为内服组合物或外用组合物。[0013]在一些实施例中，该组合物中糖度为65-68°bx的野樱莓汁液占0.5wt％。[0014]而如先前所述，紫外线、蓝光皆会以类似的机制使肌肤细胞中产生活性氧物质。又因活性氧物质具有高度活性，其将会与肌肤中的胶原蛋白分子产生反应，进而裂解胶原蛋白。由于胶原蛋白有如肌肤中的「支架」，用以赋予肌肤支撑性以及弹性，当肌肤在缺乏胶原蛋白的情况下，将会加速肌肤老化，使肌肤产生弹力下降、保水度不足(肌肤较为干燥、无光泽)、毛孔粗大、以及皱纹等现象。另一方面，紫外线与蓝光亦会诱发肌肤中的黑色素细胞产生黑色素，使得肌肤产生斑点及/或整体较为暗沉、蜡黄，此亦为肌肤老化的常见现象之一。[0015]而由于本案证实野樱莓汁液可抑制自由基产生、抑制黑色素生成，故野樱莓汁液可有效防止由紫外线或蓝光所产生的多种肌肤老化现象，提供肌肤对于紫外线以及蓝光的防护。[0016]此外，本案另亦证实野樱莓汁液可促进纤维母细胞的生长。而由于纤维母细胞可产生胶原蛋白，故野樱莓汁液可间接提升胶原蛋白的生成量。据此，对于胶原蛋白而言，野樱莓汁液不仅可被动地减少其受自由基影响的耗损，亦可主动地补充肌肤中的胶原蛋白，使肌肤状态更为健康。附图说明[0017]图1为空白控制组、对照组、及实验组的活性氧化物质(ros)高度表现的细胞比例的结果比较图。**p值<0.01，相较于对照组。[0018]图2为空白控制组、对照组、及实验组的黑色素生成量结果比较图。***p值<0.01，相较于对照组。[0019]图3为空白控制组及实验组的细胞增生率结果比较图。*p值<0.05，相较于对照组。[0020]图4为将安慰剂组及实验组的面膜使用于受试者脸部肌肤后，其各组的肌肤弹性变化比较图。**p值<0.01，相较于基线。##p值<0.01，相较于安慰剂组。[0021]图5为将安慰剂组及实验组的面膜使用于受试者脸部肌肤后，其各组的肌肤保水度变化比较图。**p值<0.01；***p值<0.001，相较于基线。#p值<0.05，相较于安慰剂组。[0022]图6为将安慰剂组及实验组的面膜使用于受试者脸部肌肤后，其各组的肌肤毛孔状态变化比较图。***p值<0.001，相较于基线。[0023]图7与图8分别为受试者在使用含野樱莓汁液的面膜前、含野樱莓汁液的面膜后的实拍照片(毛孔部分经由软件进行标记)。[0024]图9为将安慰剂组及实验组的面膜使用于受试者脸部肌肤后，其各组的肌肤皱纹变化比较图。[0025]图10与图11分别为受试者在使用含野樱莓汁液的面膜前、含野樱莓汁液的面膜后的实拍照片(纹理部分经由软件进行标记)。[0026]图12为受试者连续6周饮用含有野樱莓汁液的饮品前、后，受试者肌肤皱纹状态比较图。[0027]图13与图14分别为受试者饮用前(第0周)，以及连续6周饮用含有野樱莓汁液的饮品后(第6周)的实拍照片(纹理部分经由软件进行标记)。[0028]图15为受试者连续6周饮用含有野樱莓汁液的饮品前、后，受试者肌肤的毛孔状态比较图。*p值<0.05，相较于第0周。[0029]图16与图17分别为受试者饮用前(第0周)，以及连续6周饮用含有野樱莓汁液的饮品后(第6周)的实拍照片(毛孔部分经由软件进行标记)。[0030]图18为受试者连续6周饮用含有野樱莓汁液的饮品前、后，受试者的肌肤光泽状态比较图。[0031]图19与图20分别为受试者饮用前(第0周)，以及连续6周饮用含有野樱莓汁液的饮品后(第6周)的实拍照片。具体实施方式[0032]以下将描述本案的部分具体实施态样。在不背离本案精神下，本案尚可以多种不同形式的态样来实践，不应将保护范围限于说明书所具体陈述的条件。[0033]本案使用excel软件进行统计分析。数据以平均值±标准偏差(sd)表示，各组之间的差异以学生t检验(student'st-test)进行分析。[0034]本文中所使用数值为近似值，所有实验数据皆表示在正负10％的范围内，最佳为在正负5％的范围内。[0035]野樱莓(学名：aroniamelanocarpa，又名为blackchokeberry)是蔷薇科的一种落叶灌木的果实。[0036]在一些实施例中，由野樱莓果实所榨取的汁液(有时亦称为「野樱莓汁液」)可抑制自由基生成、可抑制黑色素生成、以及可促进皮肤纤维母细胞增生。因此，野樱莓汁液可用于制备抑制自由基生成、抑制黑色素生成、以及促进皮肤纤维母细胞增生的组合物。[0037]在一些实施例中，野樱莓汁液可有效防止由紫外线或蓝光所产生的多种肌肤老化现象，提供肌肤对于紫外线以及蓝光的防护。此外，本申请另亦证实野樱莓汁液可促进纤维母细胞的生长，故野樱莓汁液可主动地补充肌肤中的胶原蛋白。[0038]在一些实施例中，野樱莓汁液对肌肤多种受胶原蛋白影响的状况或外观，亦可具有改善效果。亦即，野樱莓汁液可例如：(1)减少细纹或皱纹；(2)缩小皮肤毛孔大小；(3)改善皮肤厚度、饱满度、及/或弹性；(4)改善肤色或光泽；(5)增加原胶原蛋白产生；(6)改善皮肤外观；或(7)增加肌肤含水量等。因此，野樱莓汁液可用于制备抑制改善皮肤状态的组合物，其中改善皮肤状态可为增加肌肤弹性、增加肌肤含水量、改善肌肤毛孔状态、减少肌肤皱纹、抑止肌肤皱纹生成或其组合。[0039]在一些实施例中，前述的组合物可为医药组合物、保养品组合物、食品组合物、保健食品组合物。[0040]医药组合物可利用本领域技术人员所详知的技术而被制造成一适合于经肠道地(enterally)、非经肠道地(parenterally)或局部地(topically)投药的剂型。例如可为：注射品(injection)[例如，无菌的水性溶液(sterileaqueoussolution)或分散液(dispersion)]、无菌的粉末(sterilepowder)、外部制剂(externalpreparation)或其他类似物。[0041]医药组合物可进一步包含有一被广泛地使用于药物制造技术的医药上可接受的载剂(pharmaceuticallyacceptablecarrier)。例如，医药上可接受的载剂可包含下列一种或多种载剂：乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspendingagent)、分解剂(decomposer)、崩解剂(disintegratingagent)、分散剂(dispersingagent)、黏结剂(bindingagent)、赋形剂(excipient)、安定剂(stabilizingagent)、螯合剂(chelatingagent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gellingagent)、防腐剂(preservative)、润湿剂(wettingagent)、润滑剂(lubricant)、吸收延迟剂(absorptiondelayingagent)、脂质体(liposome)以及类似之物。有关这些载剂的选用与数量是本领域技术人员可视情况进行选择的。[0042]在一些实施例中，医药上可接受的载剂可包含下列一种溶剂：水、生理盐水(normalsaline)、磷酸盐缓冲生理盐水(phosphatebufferedsaline，pbs)、含有醇的水性溶液(aqueoussolutioncontainingalcohol)以及其他任何合适的溶剂。[0043]在一些实施例中，该医药组合物可由下列所述的任一种非经肠道途径(parenteralroutes)来投药：皮下注射(subcutaneousinjection)、表皮内注射(intraepidermalinjection)、皮内注射(intradermalinjection)以及病灶内注射(intralesionalinjection)。[0044]在一些实施例中，医药组合物可利用本领域技术人员所详知的技术而被制造成一适合于局部地施用于皮肤上的外部制剂(externalpreparation)。举例而言，其可为下列所述的任一种，但不限于此：乳剂(emulsion)、凝胶(gel)、软膏(ointment)、乳霜(cream)、贴片(patch)、擦剂(liniment)、粉末(powder)、气溶胶(aerosol)、喷雾(spray)、乳液(lotion)、乳浆(serum)、糊剂(paste)、泡沫(foam)、滴剂(drop)、悬浮液(suspension)、油膏(salve)以及绷带(bandage)。[0045]在一些实施例中，外部制剂是借由将医药组合物与一为本领域技术人员所详知的基底(base)相混合而制成。[0046]在一些实施例中，该基底可包含下列一种或多种的添加剂(additives)：水、醇(alcohols)、甘醇(glycol)、碳氢化合物(hydrocarbons)[诸如石油胶(petroleum,jelly)以及白凡士林(whitepetrolatum,)]、蜡(wax)[诸如石蜡(paraffin)以及黄蜡(yellowwax)]、保存剂(preservingagents)、抗氧化剂(antioxidants)、界面活性剂(surfactants)、吸收增强剂(absorptionenhancers)、安定剂(stabilizingagents)、胶凝剂(gellingagents)[微结晶纤维素(microcrystallinecellulose)以及羧基甲基纤维素(carboxymethylcellulose)]、活性剂(activeagents)、保湿剂(humectants)、气味吸收剂(odorabsorbers)、香料(fragrances)、ph调整剂(phadjustingagents)、螯合剂(chelatingagents)、乳化剂(emulsifiers)、闭塞剂(occlusiveagents)、软化剂(emollients)、增稠剂(thickeners)、助溶剂(solubilizingagents)、渗透增强剂(penetrationenhancers)、抗刺激剂(anti-irritants)、着色剂(colorants)以及推进剂(propellants)等。有关这些添加剂的选用与数量是落在本领域技术人员的专业素养与例行技术范畴内。[0047]在一些实施例中，保养品中可包含有一被广泛地使用于保养品制造技术可接受的佐剂(acceptableadjuvant)。例如，该可接受的佐剂可包含下列一种或多种佐剂：溶剂、胶凝剂、活性剂、防腐剂、抗氧化剂、遮蔽剂(screeningagent)、螯合剂、界面活性剂、染色试剂(coloringagent)、增稠剂(thickeningagent)、填料(filler)、香料以及气味吸收剂。可根据实际需求对这些试剂的选用与数量进行合适的调整。[0048]在一些实施例中，保养品可利用本领域技术人员所详知的技术而被制造成一适合于护肤(skincare)或化妆(makeup)的形式，其可为下列中的任一种，但不限于此：水性溶液(aqueoussolution)、水-醇溶液(aqueous-ꢀalcoholsolution)或油性溶液(oilysolution)、呈水包油型(oil-in-watertype)、油包水型(water-in-oiltype)或复合型的乳剂、凝胶、软膏、乳霜、面膜(mask)、贴片、贴布(pack)、擦剂、粉末、气溶胶、喷雾、乳液、乳浆、糊剂、泡沫、分散液、滴剂、慕斯(mousse)、防晒油(sunblock)、化妆水(tonicwater)、粉底(foundation)、卸妆产品(makeupremoverproducts)、肥皂(soap)以及其他身体清洁产品(bodycleansingproducts)等。[0049]在一些实施例中，保养品亦可与下列中已知活性的外用剂(externaluseagents)的一种或多种一起合并使用：美白剂(whiteningagents)[诸如维生素a酸(tretinoin)、儿茶素(catechin)、曲酸、熊果苷以及维生素c]、保湿剂、杀菌剂(bactericides)、紫外线吸收剂(ultravioletabsorbers)、植物萃取物(plantextracts)[诸如芦荟萃取物(aloeextract)]、皮肤营养剂(skinnutrients)、麻醉剂(anesthetics)、抗痘剂(anti-acneagents)、止痒剂(antipruritics)、止痛剂(analgesics)、抗皮肤炎剂(antidermatitisagents)、抗过角化剂(antihyperkeratolyticagents)、抗干皮肤剂(anti-dryskinagents)、抗汗剂(antipsoriaticagents)、抗老化剂(antiagingagents)、抗皱剂(antiwrinkleagents)、抗皮脂溢出剂(antiseborrheicagents)、伤口治疗剂(wound-healingagents)、皮质类固醇(corticosteroids)以及激素(hormones)。有关这些外用剂的选用与数量是落在本领域技术人员的专业素养与例行技术范畴内。[0050]在一些实施例中，医药组合物可被当作食品添加物(foodadditive)，借由现有技术方法于原料制备时添加，或是于食品的制作过程中添加，而与任一种可食性材料配制成供人类与非人类动物摄食的食品产品。[0051]在一些实施例中，食品的种类可为但不限于：饮料(beverages)、发酵食品(fermentedfoods)、烘培产品(bakeryproducts)、健康食品(healthfoods)以及膳食补充品(dietarysupplements)。[0052]在一些实施例中，「野樱莓汁液」可为野樱莓的果实经榨取而得的汁液。举例而言，在一些实施例中，将野樱莓的果实经碾碎、挤压并去除果渣与较细小的悬浮物后，再将其浓缩至一定糖度而得。在另一些实施例中，野樱莓汁液于制备过程中亦可经过其他大致上不影响其产生本案所述功效的程序，例如发酵，以增添风味或其他用途。[0053]在一些实施例中，「野樱莓汁液」亦可为使用合适的萃取溶剂萃取野樱莓的果实而得到的萃取液。举例而言，可将野樱莓浸泡于水中于常温下经适当时间进行萃取，再经过滤去除固态杂质后可得到野樱莓果实萃取液。[0054]下列范例中的实验步骤若无特别叙明，即在室温(25±5℃)、常压(1atm)下进行。[0055][例1]细胞实验-野樱莓汁液抑制ros生成[0056]于此，以荧光探针dcfh-da配合流式细胞仪，测定人类皮肤纤维母细胞ccd-966sk经野樱莓汁液处理后，其活性氧物质含量的变化。[0057]材料与仪器[0058]1.细胞株：人类皮肤纤维母细胞(humanskinfibroblast)ccd-966sk(购自生物资源保存及研究中心(bcrc)，no.60153)。[0059]2.培养基：将eagle’s最低限度基本培养基(minimumessentialmedium，mem，购自gibco，15188-319)添加额外成分使其含有10vol％fbs(fetalbovineserum，购自gibco，10437-028)、90vol％1mm丙酮酸钠(sodiumpyruvate，购自gibco，11360-070)、1.5g/l碳酸氢钠(购自sigma)、0.1mm非必需胺基酸(non-essentialaminoacidsolution，购自gibco，11140-050)。[0060]3.磷酸缓冲盐溶液(pbs溶液)：购自gibco，产品编号10437-028。[0061]4.dcfh-da溶液：将二氯二氢荧光素二乙酸酯(2,7-dichloro-dihydro-ꢀfluoresceindiacetate，dcfh-da；产品编号si-d6883，购自sigma)溶于二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，dmso，购自sigma，产品编号si-d6883-ꢀ50mg)以配制成5mg/ml的dcfh-da溶液。[0062]5.流式细胞仪(flowcytometry)，beckman，catalogno.660519[0063]6.蓝光箱(波长400nm-500nm)[0064]7.野樱莓汁液：此实验中所使用的野樱莓汁液是野樱莓果实的榨取汁液，购自中国台湾地区绿源股份有限公司，其野樱莓汁液的糖度为65-ꢀ68°bx。[0065]实验步骤[0066]实验将会分为实验组、空白控制组(未添加野樱莓汁液、亦无经过蓝光照射的组别)、以及对照组(未添加野樱莓汁液，但经蓝光照射的组别)三组进行，各组分别进行三重复试验：[0067]1.将ccd-966sk细胞以每孔1×105个的方式，接种于每孔含2ml培养基的6孔培养盘中。[0068]2.将培养盘置于5％co2、37℃下，培养24小时。[0069]3.移除培养基。[0070]4.实验组：将野樱莓汁液样品0.625μl加入至每孔中，使其于37℃下反应1小时。其中，野樱莓汁液样品是将前述的野樱莓汁液以水稀释至糖度为20°bx后，再以培养基配制成每毫升含0.0625毫克的稀释野樱莓汁液的溶液。[0071]空白控制组：添加0.625μl的培养基至每孔中，使其于37℃下反应1小时。[0072]对照组：添加0.625μl的培养基至每孔中，使其于37℃下反应1小时。[0073]5.添加浓度5μg/ml的dcfh-da溶液2μl于每孔中，使其处理细胞15分钟。[0074]6.实验组：将dcfh-da溶液处理步骤的6孔培养盘移至蓝光箱中，使其在室温(25±5℃)下接受蓝光照射15分钟。[0075]空白控制组：将dcfh-da溶液处理步骤的6孔培养盘置于暗处，于室温下静置15分钟。[0076]对照组：将dcfh-da溶液处理步骤的6孔培养盘移至蓝光箱中，使其在室温下接受蓝光照射15分钟。[0077]7.反应后，每孔以1mlpbs溶液清洗细胞2次。[0078]8.将200μl胰蛋白酶(trypsin-edta(10x)，购自gibco；产品编号15400-054)加至每孔中并在暗处反应5分钟。反应后，添加6ml培养基溶液终止反应。[0079]9.将各孔中的细胞与培养基个别收集至对应的15ml离心试管内，并将含有细胞与培养基的离心试管以400xg离心10分钟。[0080]10.离心后，移除上清液，加入1mlpbs溶液与沉淀物混合。[0081]11.再以400xg离心10分钟。[0082]12.离心后，移除上清液，以1mlpbs溶液于暗处再次悬浮细胞。[0083]13.使用流式细胞仪检测dcfh-da的荧光信号。进行荧光检测的激发波长为450-490nm，放射波长为510-550nm。由于dcfh-da进入细胞后会先被水解为dcfh(二氯二氢荧光素)，再被活性氧物质氧化为可发出绿色荧光的dcf(二氯荧光素)，经dcfh-da处理的细胞的荧光强度可反映细胞内活性氧物质含量，并由此得知细胞内活性氧物质高度表现的细胞数占原细胞数的比例。因实验进行二重复，故将二重复实验的结果平均后，显示于图1。[0084]实验结果[0085]如图1所示，由空白控制组、对照组的结果可知，在经过蓝光照射后，具有高ros表现(高荧光表现)的细胞比例将大幅增加，显示蓝光照射确实会导致细胞内产生活性氧物质，进而对纤维母细胞产生后续伤害。另一方面，根据对照组以及实验组的结果可知，当细胞经过野樱莓汁液处理后，具有高ros表现的细胞比例相较于对照组即明显减少约93％，甚至低于空白控制组。显示野樱莓汁液可有效减少活性氧物质在细胞内的产生或累积，可作为一种活性氧物质清除剂。亦即，野樱莓汁液可透过降低细胞内活性氧物质含量，减少细胞受到蓝光、紫外线等所导致的氧化伤害。[0086][例2]细胞实验-野樱莓汁液降低黑色素生成[0087]于此，以elisa读盘机(enzyme-linkedimmunosorbentassayreader)测定黑色素瘤细胞株b16f10经野樱莓汁液处理后，其黑色素含量的变化。[0088]材料与仪器[0089]1.细胞株：小鼠黑色素瘤细胞株b16f10(atcccrl-6475)，购自美国典型培养物保存中心(americantypeculturecollection，atcc)。[0090]2.培养基：将dulbecco'smodifiedminimalessentialmedium(dmem，购自gibco)添加额外成分使其含有1vol％的抗生素溶液(antibioticantimycoticsolution，购自gibco，15240-062)、10vol％的fbs(fetalbovineserum，购自gibco，10437-028)。[0091]3.磷酸缓冲盐溶液(pbs溶液)：购自gibco，产品编号10437-028。[0092]4.以二次蒸馏水配制1nnaoh(购自sigma，产品编号221465)溶液。[0093]5.elisareader(biotek，flx800)[0094]6.蓝光箱(波长400nm-500nm)[0095]7.野樱莓汁液：此实验中所使用的野樱莓汁液是野樱莓果实的榨取汁液，购自中国台湾地区绿源股份有限公司，其野樱莓汁液的糖度为65-ꢀ68°bx。[0096]实验步骤[0097]实验将会分为实验组、空白控制组(未添加野樱莓汁液、亦无经过蓝光照射的组别)、以及对照组(未添加野樱莓汁液，但经蓝光照射的组别)三组进行，各组分别进行三重复试验：[0098]1.将b16f10细胞以每孔1.5×105个的方式，接种于每孔含3ml培养基的6孔培养盘中。[0099]2.将培养盘置于5％co2、37℃环境下，培养24小时。[0100]3.而后，在不干扰附着细胞的情况下，移除每孔的培养基。[0101]4.实验组：于每孔中加入野樱莓汁液样品2ml后，于37℃下培养24小时。其中，野樱莓汁液样品是将购得的野樱莓汁液以水稀释至糖度为20°bx的稀释野樱莓汁液后，再以培养基与前述的稀释野樱莓汁液，配制成每毫升含0.0625毫克的稀释野樱莓汁液的溶液。[0102]空白控制组：在37℃下，添加2ml的培养基至每孔中，使其于37℃下培养24小时。[0103]对照组：在37℃下，添加2ml的培养基至每孔中，使其于37℃下培养24小时。[0104]5.实验组：将经过野樱莓培养基溶液处理步骤的6孔培养盘移至蓝光箱中，使其在室温(25±5℃)下接受蓝光照射3小时。[0105]空白控制组：将6孔培养盘移至暗室中，使其在室温下静置3小时。[0106]对照组：将6孔培养盘移至蓝光箱中，使其在室温下接受蓝光照射3小时。[0107]6.反应后，将细胞于37℃下培养48小时。[0108]7.而后，移除培养基，并以pbs溶液清洗细胞2次。[0109]8.将200μl胰蛋白酶(trypsin-edta(10x)，购自gibco；产品编号15400-054)加至每孔中反应3分钟。反应后，添加6ml培养基溶液终止反应。而后收集各孔中的悬浮细胞与培养基至对应的15ml离心试管内，将各离心试管以400xg离心5分钟使细胞沉淀。[0110]9.以pbs溶液清洗沉淀细胞二次后，再以200μlpbs溶液重新悬浮细胞。[0111]10.将细胞悬浮液以液态氮冷冻10分钟，再置于室温约30分钟至完全解冻。[0112]11.完全解冻后，将试管以12,000g离心3分钟。[0113]12.移除上清液，再以120μl1n氢氧化钠溶液重新悬浮细胞沉淀后，使试管于60℃干浴1小时，以获得待检测样本。[0114]13.将100μl待检测样本移入一96孔盘，使用elisa读盘机测量细胞溶液在450nm的光密度值(opticaldensity，od450)，作为吸亮度。[0115]实验结果[0116]实验组、空白控制组、以及对照组的黑色素相对表现量依下列公式计算：黑色素相对表现量(％)＝(各组od450值/空白控制组od450值)ꢀ×100％。因实验进行三重复，故将三重复实验结果平均后，显示于图2。[0117]如图2所示，由空白控制组、对照组的结果可知，在经过蓝光照射后，细胞中的黑色素表现量将明显增加，显示蓝光照射确实会促使黑色素瘤细胞产生黑色素，而这将使得肌肤产生斑点、或使肌肤整体较为暗沉。而另一方面，根据对照组以及实验组的结果可知，当细胞经过野樱莓汁液处理后，其在蓝光下的黑色素表现量将低于未经过野樱莓汁液处理的对照组(降低约16％)，显示野樱莓汁液可有效减少黑色素细胞因蓝光所生成的黑色素。[0118][例3]细胞实验-野樱莓汁液促进皮肤纤维母细胞增生[0119]借由click-ittmedu方式(借由edu处理细胞、固定并透化细胞、使用与edu结合荧光染剂检测)来检测细胞数目，由此检验野樱莓汁液对于纤维母细胞是否具有促进增生作用。[0120]材料与仪器[0121]1.细胞株：人类纤维母细胞(humanskinfibroblast)ccd-966sk，购自美国典型培养物保存中心(americantypeculturecollection，atcc)。[0122]2.培养基：将eagle’s最低限度基本培养基(minimumessentialmedium，mem，购自gibco，15188-319)添加额外成分使其含有10vol％fbs(fetalbovineserum，购自gibco，10437-028)、90vol％1mm丙酮酸钠(sodiumpyruvate，购自gibco，11360-070)、1.5g/l碳酸氢钠(购自sigma)、0.1mm非必需胺基酸(non-essentialaminoacidsolution，购自gibco，11140-050)。[0123]3.细胞增殖检测试剂盒(cellproliferationassaykits，click-ittmplusedualexafluortm488flowcytometryassaykit)，购自invitrogen，型号c10632，50tests)[0124]试剂盒中所含药品：[0125](a)5-乙炔-2’-脱氧尿苷(5-ethynyl-2'-deoxyuridine，edu)10mg(成分a)[0126](b)alexafluortm488picolylazide的dmso溶液130μl(成分b)[0127](c)dimethylsulfoxide(dmso)4.5ml(成分c)[0128](d)click-ittm固定剂(fixative)(4％paraformaldehydeinpbs)5ml(成分d)[0129](e)click-ittm渗透及清洗试剂(fixativesaponin-basedpermeabilizationandwashreagent)，10x50ml(成分e)[0130](f)浓度为100mm的铜保护剂(copperprotectant)水溶液0.5ml(成分f)[0131](g)click-ittmedu缓冲添加剂(edubufferadditive)400mg(成分g)[0132]4.含有1vol％bsa(bovineserumalbumin，牛血清白蛋白，购自sigma；商品编号a9647)的pbs溶液，后方将略称为1％bsa/pbs溶液。[0133]5.10mm的edu溶液：将试剂盒中的成分c取4ml，加入至成分a中，并保存于-20℃。[0134]6.1xclick-ittm渗透及清洗试剂：将试剂盒中的成分e以1％bsa/pbs溶液稀释10倍。[0135]7.10xclick-ittmedu缓冲添加剂溶液：将2ml的二次蒸馏水加入至试剂盒中的成分g，并保存于-20℃。[0136]8.磷酸缓冲盐溶液(pbs溶液)：购自gibco，产品编号10437-028。[0137]9.流式细胞仪(flowcytometry)，beckman，catalogno.660519[0138]10.野樱莓汁液：此实验中所使用的野樱莓汁液是野樱莓果实的榨取汁液，购自中国台湾地区绿源股份有限公司，其野樱莓汁液的糖度为65-ꢀ68°bx。[0139]实验步骤[0140]实验将会分为实验组以及空白控制组(未添加野樱莓汁液)两组进行：[0141]1.将ccd-966sk以每孔1×105个的方式，接种于每孔含2ml培养基的6孔培养盘中，并于5％co2、37℃环境下，培养24小时。[0142]2.实验组：于室温下，在每孔中加入2ml野樱莓汁液样品，培养24小时。其中，野樱莓汁液样品是将购得的野樱莓汁液以水稀释至糖度为20°bx的稀释野樱莓汁液后，再以培养基与前述的稀释野樱莓汁液，配制成每毫升含0.0625毫克的稀释野樱莓汁液的溶液。[0143]空白控制组：于室温下，在每孔中加入2ml的培养基，培养24小时。[0144]3.将前述10mm的edu溶液以培养基稀释为10μm后，于每孔中加入2ml10μm的edu溶液并培养2小时。[0145]4.收集细胞。[0146]5.以1％bsa/pbs溶液清洗细胞一次，并移除上清液。[0147]6.添加试剂盒中的click-ittm固定剂(成分d)100μl至每孔中与细胞混合，在暗处中于室温培养15分钟。[0148]7.以1％bsa/pbs溶液清洗细胞一次，并移除上清液。[0149]8.添加1xclick-ittm渗透及清洗试剂100μl至每孔中，在暗处中于室温培养15分钟。[0150]9.以1％bsa/pbs溶液清洗细胞一次，并移除上清液。[0151]10.以100μl1xclick-ittm渗透及清洗试剂，重新悬浮细胞。[0152]11.进行click-ittm反应。[0153]i.准备1xclick-ittmedu缓冲添加剂溶液：将10xclick-ittmedu缓冲添加剂溶液，以二次蒸馏水稀释为1xclick-ittmedu缓冲添加剂溶液。[0154]ii.准备click-ittmplusreaction混合试剂(需于配制后15分钟内进行使用)[0155](多孔盘的每一格使用500μl的click-ittmplusreaction混合试剂，该500μl的混合试剂以10μl的铜保护剂(成分f)、2.5μlpicolylazide的dmso溶液(成分b)、50μl1xclick-ittmedu缓冲添加剂溶液、以及438μl的pbs溶液配制而成。)[0156]iii.于每格中加入500μl的click-ittmplusreaction混合试剂。[0157]iv.于暗处室温下，培养30分钟。[0158]v.以1xclick-ittm渗透及清洗试剂清洗细胞一次，并移除上清液。[0159]vi.以500μl1xclick-ittm渗透及清洗试剂，重新悬浮细胞。[0160]12.以流式细胞仪对细胞进行分析[0161]由于染料(成分b)将会与细胞中的核酸异性结合并产生绿色荧光，而荧光的强度将与细胞的数量成正比，故可透过测量荧光来量化细胞数目(激发波长：488nm；发射波长：530/30(515-545nm))。[0162]将空白控制组的细胞增生率作为基准值(设为1.0)、以及实验组的相对细胞增生率，绘示于图3。由图3中可知，经过野樱莓汁液处理过的纤维母细胞，可具有较高的增生量。而由于纤维母细胞可产生胶原蛋白，因此野樱莓汁液亦可间接提升肌肤中胶原蛋白的生成量，使肌肤更为紧致有弹性。[0163]由细胞实验可知，野樱莓汁液确实可降低皮肤纤维母细胞的自由基(ros)生成，防止肌肤因蓝光、紫外线而产生的伤害，抑制胶原蛋白的流失，减缓因蓝光、紫外线产生的老化及皱纹生成。且野樱莓汁液可抑制蓝光造成的黑色素生成，减少皮肤黑斑，维持白净肌肤。野樱莓汁液另可促进皮肤纤维母细胞生成，使肌肤状态更为健康，最终达到使肌肤抗老化的功效。[0164]而为证实野樱莓汁液对于人体的功效，亦进行相关人体实验如下。[0165][例4]人体实验-以外用方式使用野樱莓汁液[0166]使用样品：含野樱莓汁液面膜(以面膜布浸泡于含有野樱莓汁液的精华液中，使其充分吸收后制得)以及安慰剂面膜(以相同型号的面膜布浸泡于与前述精华液中，但其中的野樱莓汁液替换成等重的水)，再使其充分吸收后制得。于此实施例中，各面膜含20ml的对应精华液。[0167]含有野樱莓汁液的精华液成分：三仙胶0.2wt％、馨鲜酮0.6wt％、1,3-ꢀ丁二醇5wt％、三乙醇胺0.1wt％、己二醇0.6wt％、野樱莓汁液0.5wt％，其余为水。其中，此野樱莓汁液是指野樱莓果实的榨取汁液，购自中国台湾地区绿源股份有限公司，其野樱莓汁液的糖度为65-68°bx。[0168]受试者人数：7位30-55岁的受试者。[0169]实验方式：受试者将全脸清洁后，依据不同检测项目，使用对应的仪器及测量方式，纪录左右半脸于使用面膜前的数值、或拍摄使用前的照片。而后，分别将野樱莓汁液面膜以及安慰剂面膜贴敷于受试者的右半脸及左半脸上，经15分钟后取下，再以指腹稍加按摩左半脸与右半脸。待面膜移除约5分钟后，再以对应的仪器及测量方式，进行测量或拍摄照片，再与自身原左半脸、或右半脸的数值进行对照(使用前与使用后欲进行检测时，受试者所在的测试区域的温度与湿度为一致，以减少外界的温湿度等因素会对皮肤所造成的影响)。[0170]检测项目：将分别对肌肤进行1.肌肤弹力测试、2.肌肤含水量测试、3.肌肤毛孔状态、以及4.肌肤皱纹状态的测试。[0171]1.肌肤弹力测试[0172]使用购自德国courage+khazakaelectronic公司的多功能皮肤测试仪(c+kmultiprobeadaptersystem)，并装配有mpa580探头。在本测试过程中，连接至皮肤测试仪的探头将与受试者的皮肤待测区域接触，借由在皮肤表面形成负压而将该待测区域吸入，并测量该待测区域被吸入的深度随时间的变化以及回弹至原位的能力。该测试结果经过皮肤弹性测量仪所附软件分析，可得到该待测区域的皮肤弹性指数。[0173]由图4可知，相较于使用安慰剂面膜的组别，在使用含野樱莓汁液面膜后，肌肤弹力可显著地提升约20.8％。基此可知，野樱莓汁液以外用方式涂敷于肌肤上确实可提升肌肤的弹性。[0174]2.肌肤含水量测试[0175]肌肤含水量同样使用购自德国courage+khazakaelectronic公司的多功能皮肤测试仪，搭配cm825探头。在测试过程中，使测量仪的探头与受试者的皮肤待测区域接触，并测量该待测区域的表皮层含水量。此方法采用电容法测试人体皮肤的水分含量，它的原理是基于水和其他物质的介电常数差异显著，按照皮肤含水量不同，测得皮肤的电容值不同，其观测数值可代表皮肤水分值。[0176]由图5可知，相较于使用安慰剂面膜的组别，使用含野樱莓汁液面膜后，肌肤含水量可显著增加约25.7％。基此可知，野樱莓汁液以外用方式涂敷于肌肤上确实可提升肌肤的保水度。[0177]3.肌肤毛孔状态[0178]使用美国canfield所贩卖的visia高阶数字肤质检测仪进行检测，透过高分辨率的相机镜头对面膜使用前、面膜使用后的面部肌肤进行拍摄。借由标准白光照射，造成毛孔凹陷处产生阴影，毛孔会比周围的肤色更黑，故可以此检测毛孔，然后利用软件根据毛孔数目、面积分析得到一数值，而数值越高则显示其毛孔数量、面积较多。并且将使用含野樱莓汁液面膜前、后的右半脸的实拍照片以软件标记其中的毛孔部分。[0179]由图6可知，相较于使用含野樱莓汁液的面膜前，在使用含野樱莓汁液的面膜后，肌肤的毛孔情况显著改善约14.9％，且毛孔情况改善人数比率达100％。由图7与图8明确显示相较于使用含野樱莓汁液的面膜前，使用含野樱莓汁液的面膜后，使可被检测的毛孔数量确实减少。基此可知，野樱莓汁液以外用方式涂敷于肌肤上，确实可改善肌肤的毛孔情况，使毛孔缩小或减少。[0180]4.肌肤皱纹状态测试[0181]同样使用visia高阶数字肤质检测仪进行检测，透过高分辨率的相机镜头对面膜使用前、面膜使用后的面部肌肤进行拍摄，借由标准白光照射、检测皮肤阴影的变化，即可检测纹理位置并得到一数值，可代表皮肤的平滑程度。并且，将使用含野樱莓汁液面膜前、后的右半脸的实拍照片以软件标记其中的皱纹部。[0182]由图9可知，相较于使用含野樱莓汁液的面膜前，在使用含野樱莓汁液的面膜后，肌肤的皱纹情况显著改善约9.1％，且肌肤的皱纹情况改善人数比率达100％。而由图10与图11则可明确显示，相较于使用含野樱莓汁液的面膜前，使用含野樱莓汁液的面膜后，可使肌肤的纹理数量确实减少。基此可知，野樱莓汁液以外用方式涂敷于肌肤上，确实可使肌肤纹理减少，并提升肌肤的平滑度。[0183][例5]人体实验-以内服方式使用野樱莓汁液[0184]使用样品：含野樱莓汁液的饮品50g/瓶(以水以及野樱莓汁液配制成每50g的饮品中含有1g的野樱莓汁液，即占2wt％)。在另一些其他的实施例中，每人一日可摄取野樱莓汁液至多5g。其中，此野樱莓汁液是野樱莓果实的榨取汁液，购自中国台湾地区绿源股份有限公司，其野樱莓汁液的糖度为65-68°bx。[0185]受试者人数：8位20-60岁的受试者。[0186]实验方式：受试者每日饮用一瓶含野樱莓汁液的饮品(每瓶含有1g野樱莓汁液)，共饮用42日(即6周)。并于开始饮用前(脸部已清洁，第0周)以及饮用42日后，依据不同检测项目，使用对应的仪器及测量方式，纪录脸部肌肤的数值、并拍摄饮用前、后的照片。(于饮用前、后进行检测时，受试者所在的测试区域的温度与湿度为一致，以减少外界的温湿度等因素会对皮肤所造成的影响)。[0187]检测项目：将分别对肌肤进行1.肌肤皱纹状态、2.肌肤毛孔状态、以及3.肌肤光泽。[0188]1.肌肤皱纹状态[0189]使用美国canfield所贩卖的visia高阶数字肤质检测仪进行检测，透过高分辨率的相机镜头对饮用前、饮用后的面部肌肤进行拍摄，借由标准白光照射、侦测皮肤阴影的变化，即可检测纹理位置并得到一数值，可代表皮肤的平滑程度。其检测结果显示于图12；饮用含野樱莓汁液的饮品前(第0周)、饮用后(第6周)的脸部实拍照片，显示于图13与图14(皱纹部分经由软件进行标记)。[0190]由图12可知，当连续饮用含野樱莓汁液的饮品6周后，相较于饮用前，面部肌肤的皱纹数值明显下降约8.2％，且改善人数达75％。而由图13与图14则可明确显示饮用含野樱莓汁液的饮品后，可使肌肤的纹理数量确实减少、抑止皱纹生成。显示野樱莓汁液以内服方式，亦可使肌肤纹理减少，提升肌肤的平滑度。[0191]2.肌肤毛孔状态[0192]同样使用美国canfield所贩卖的visia高阶数字肤质检测仪进行检测，透过高分辨率的相机镜头对饮用前、饮用后的面部肌肤进行拍摄。借由标准白光照射，造成毛孔凹陷处产生阴影，毛孔会比周围的肤色更黑，故可以此检测毛孔，然后利用软件根据毛孔数目、面积分析得到一数值，而数值越高则显示其毛孔数量、面积较多。而其检测结果显示于图15；饮用前(第0周)、饮用后(第6周)的脸部实拍照片，显示于图16与图17(毛孔部分经由软件进行标记)。[0193]由图15可知，在饮用含野樱莓汁液的饮品连续6周后，相较于饮用前，肌肤的毛孔情况显著改善约12.9％，且毛孔情况改善人数比率达75％。而由图16与图17则明确显示饮用含野樱莓汁液的饮品后，使可被检测的毛孔数量确实减少。显示野樱莓汁液以内服的方式，亦可改善肌肤的毛孔情况，使毛孔缩小或减少。[0194]3.肌肤光泽[0195]使用购自德国courage+khazakaelectronic公司的肌肤光泽仪gl200进行检测，透过高分辨率的相机镜头对饮用前、饮用后的面部肌肤进行拍摄。借由标准白光照射，测量肌肤的反射光和散射光，从而精确地测试皮肤的光泽度。其检测结果显示于图18；而使用含野樱莓汁液饮品前、后的脸部实拍照片，显示于图19与图20。[0196]由图18可知，在连续饮用含野樱莓汁液的饮品6周后，相较于饮用前，肌肤的光泽提升约6％，且改善人数比率达75％。而由图19与图20则显示饮用含野樱莓汁液的饮品后，可增加肌肤的光泽。显示野樱莓汁液以内服的方式，确实可改善肌肤的暗沉，提升肌肤的光泽度。[0197]综合前述，本案除证实野樱莓汁液可抑制自由基产生、抑制黑色素生成，故野樱莓汁液可有效防止由紫外线或蓝光所产生的多种肌肤老化现象，提供肌肤对于紫外线以及蓝光的防护外，本案另亦证实野樱莓汁液可促进纤维母细胞的生长，而由于纤维母细胞可产生胶原蛋白，故野樱莓汁液可间接提升胶原蛋白的生成量。据此，野樱莓汁液可以内服或外用方式，使肌肤整体减少老化特征，并防止肌肤受到蓝光或紫外线的伤害，抑止肌肤老化。[0198]当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明权利要求的保护范围。当前第1页1 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