反刍动物专用丁酸梭菌制剂及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及动物饲料添加剂领域，具体涉及反刍动物专用丁酸梭菌制剂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.反刍动物依靠功能强大的瘤胃将人类不能消化的纤维性植物资源转化为高品质的肉和奶。目前饲料中禁止使用促生长类抗生素。面对反刍养殖业发展的困境和养殖生产安全性的问题，选择绿色、安全、无污染和无残留的饲料添加剂变得尤为重要。酶制剂和益生菌产品被认为是安全绿色可靠的饲料添加剂，大量地研究表明它们在对饲料消化率和养殖生产效率的提高效果显著。
3.丁酸梭菌是芽孢杆菌科、梭菌属的一种产丁酸的革兰氏阳性厌氧细菌，是动物正常的肠道菌，广泛存在于动物粪便、土壤中。丁酸梭菌生长代谢产物包括氨基酸、短链脂肪酸和各种促消化酶，能促进乳酸杆菌、双歧杆菌等有益菌的生长，调节肠道微生态平衡，促进营养物质吸收。丁酸梭菌在生长后期会形成芽孢，能够耐受饲料加工过程中的高温、高压、机械摩擦、酸碱等不良环境，受胃肠液和胆盐的影响较小。
4.丁酸梭菌主要通过如下四个方面发挥其功能：第一，维持动物肠道微生态平衡，促进有益菌(双歧杆菌、乳酸杆菌)的增殖，抑制有害菌(沙门氏菌、大肠杆菌)的生长；第二，产生多种对动物有用的酶、维生素等，提高动物的消化吸收能力；第三，产丁酸，促进动物小肠上皮细胞组织再生和修复，维持肠道健康；增强动物的非特异性免疫，抵御感染，减少疾病的发生；第四，降低动物的腹泻率，提高生长性能。
5.目前关于丁酸梭菌的应用研究主要集中在单胃动物上，且对动物的生产性能有显著的提高作用，但在反刍动物上的研究较少，作用效果还不清楚；同时反刍动物瘤胃内存在大量的细菌和真菌，内环境复杂，通常的益生菌很难在瘤胃中生长和代谢，也就无法发挥作用，因此筛选出能适应反刍动物胃肠道的丁酸梭菌菌种显得尤为重要。


技术实现要素：

6.本发明为克服现有技术的不足之处，提供一种筛选自反刍动物瘤胃的丁酸梭菌菌种和一种绿色、安全的添加剂产品；同时通过多批次多种剂量的动物试验证明了本发明所提供的丁酸梭菌制剂产品有效改善了犊牛腹泻和瘤胃健康水平，提高反刍动物日粮消化率和生产性能。
7.本发明的目的是提供一种反刍动物专用丁酸梭菌制剂。
8.本发明的再一目的是提供反刍动物专用丁酸梭菌制剂的制备方法。
9.根据本发明的反刍动物专用丁酸梭菌制剂，包括丁酸梭菌vtsj
‑
2，筛选自瘤胃内容物，采用亨盖特厌氧滚管技术进行丁酸梭菌的分离纯化，保藏编号为gdmcc no.61311。丁酸梭菌vtsj
‑
2具有产酸、产氢气和芽孢结构的生物学特性，能很好地适应动物的胃肠道环境，通过生长和代谢发挥其生理功能；同时通过大量的体外试验和动物试验，证明了丁酸梭
菌可显著改善犊牛腹泻和瘤胃健康水平，提高饲料消化率和动物的生产性能。
10.根据本发明的反刍动物专用丁酸梭菌制剂，通过以下方法制备而得：
11.将丁酸梭菌液体发酵；处理干燥制粒。
12.根据本发明的具体实施方式，反刍动物专用丁酸梭菌制剂通过以下方法制备而得：将活化后的种子液接种到生产罐进行42h的液体发酵，将发酵液添加载体和其他成分后进行沸腾干燥，包括混匀、挤条、滚圆和制粒等过程。
13.优选地，根据本发明的反刍动物专用丁酸梭菌制剂，其中，所述载体选自玉米淀粉、麦芽糖糊精或二氧化硅；所述粘合剂选自微晶纤维素或乙基纤维素。
14.本发明的产品适用于反刍动物，包括：奶牛、肉牛和羊。
15.本发明的产品可直接添加到动物日粮中混匀饲喂，推荐用量为奶牛10～20g/d.头，肉牛5～10g/d.头，羊2～4g/d.头。
16.本发明的优点在于：与现有技术和产品相比，本发明的反刍动物专用丁酸梭菌制剂由丁酸梭菌添加载体和粘合剂及其他成分混合制粒而成，丁酸梭菌菌种筛选自反刍动物瘤胃内容物，能很好地适应反刍动物胃肠道环境。应用研究表明，丁酸梭菌制剂不仅能促进反刍动物的生长，调节动物肠道的微生态平衡，保护肠道上皮组织，产生多种有益物质，还可减少饲料中抗生素类产品的使用。
17.本发明的反刍动物专用丁酸梭菌制剂可有效提高饲料消化率，动物生产性能和机体健康，降低反刍动物养殖成本，增加经济效益，且本产品为绿色、安全、无污染和无残留的饲料添加剂产品。
附图说明
18.图1显示丁酸梭菌对瘤胃ph的影响；
19.图2显示丁酸梭菌在瘤胃液中的生长曲线；
20.图3显示本发明的产品对1
‑
2月龄犊牛日增重的影响；
21.图4显示本发明的产品对2
‑
3月龄犊牛日增重的影响；
22.图5显示本发明的产品对5
‑
7月龄公犊牛日增重的影响；
23.图6显示本发明的产品对5
‑
7月龄母犊牛日增重的影响；
24.图7显示本发明的产品对育肥牛日增重的影响；
25.图8显示本发明的产品对牛粪便中丁酸梭菌活菌数的影响。
26.丁酸梭菌(clostridiumbutyricum)菌株vtsj
‑
2的保藏编号为gdmcc no：61311，于2020年11月25日保藏与广东省微生物菌种保藏中心(地址，广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，邮政编码510070)。
具体实施方式
27.下面通过具体实施例对本发明做进一步地详细说明。
28.实施例1新型反刍动物专用丁酸梭菌制剂产品的制备
29.丁酸梭菌的具体的筛选过程：
30.1、将采集的瘤胃内容物充分混合后，用无菌注射器取1ml接种；
31.2、将样品注入到含90ml去氧无菌水的厌氧瓶中，置80℃水浴10min，此作用为灭除
营养体并激活芽孢萌发，转接到液体梭菌增殖培养基中扩大培养，37℃静置培养48h；
32.3、用无菌无氧注射器(充满氮气)将上述培养液置80℃水浴10min，并转接到液体梭菌选择性培养基中，37℃静置培养48h。4、按三平行9梯度稀释培养液迅速注入到固体梭菌选择性培养基中，冰上滚管至培养基凝固并均匀分布于管壁垂直放置于37℃静置培养24h，至形成明显的单一菌落；
33.5、挑选单菌落数目适中、多样性好、且分布均匀的滚管进行单菌落挑取，通过菌落形态特征观察，确定欲挑取的目标单菌落并迅速挑至液体贮藏培养基中，37℃静置培养48h；
34.6、将初筛所得菌株经过多次滚管、挑菌后最终获得纯菌。
35.本发明产品反刍动物专用丁酸梭菌制剂产品，主要通过丁酸梭菌液体发酵技术、后处理干燥造粒工艺生产，具体的生产过程：将发酵液添加微晶纤维素、麦芽糖糊精、玉米淀粉等载体粘合剂及其他成分混合制粒而成，玉米淀粉、微晶纤维素、麦芽糖糊精按40:5:8的比例组合与发酵液混匀，然后经过挤条、滚圆和烘干制成，丁酸梭菌产品粒径为2～5mm。
36.丁酸梭菌液体发酵培养基的组分和比例为豆粕粉2％(w/v)、酵母粉1％(w/v)、玉米浆1.6％(w/v)、柠檬酸三钠0.32％(w/v)、磷酸二氢钾0.04％(w/v)、氯化钠0.03％(w/v)、硫酸锰0.06％(w/v)、氯化钙0.06％(w/v)、硫酸镁0.04％(w/v)。
37.发酵液和产品中丁酸梭菌的测定采用平板计数法，主要包括下述步骤：样品稀释液的制备、接种、培养和计数。具体的实施过程包括：
38.(1)以无菌操作称取25g(或ml)样品，置于盛有225ml无菌生理盐水的三角瓶中(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)，置漩涡振荡器上振荡30min，充分混匀，制成1:10的样品匀液。用无菌移液管吸取上述1:10样品匀液0.5ml，加入盛有4.5ml无菌生理盐水的无菌试管中，混匀，制成1：102的样品匀液，这样依次稀释，分别得到1:103～1:109等浓度(每个稀释度必须更换无菌移液管)的样品匀液。
39.(2)采用无菌操作，用1ml无菌移液管分别吸取1ml不同稀释度菌悬液加入已灭菌的培养皿中，将已融化好的丁酸梭菌培养基(凉至50℃)分别倒入上述培养皿中，每个约15～20ml，旋转混匀，静置凝固。每个样品取2～3个连续适宜稀释度，每一稀释度重复接种2～3个平皿，同时加无菌蒸馏水做2～3个平皿的空白对照。
40.(3)将接种好的培养皿倒置，于37℃
±
1℃恒温厌氧条件培养18～24小时。
41.(4)培养后进行计数，若所有的稀释度放入平板菌落数均不在30cfu～300cfu之间，其中一部分小于30cfu或大于300cfu时，则以最接近30cfu或300cfu的平均菌落数乘以稀释倍数计算。菌落数大于或等于100cfu时,第3位数字采用“四舍五入”原则修约后,取前2位数字,后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示,按“四舍五入”原则修约后,采用两位有效数字。
42.测得的发酵液丁酸梭菌活菌数为2.1
×
109cfu/ml，干燥制粒后的活菌数为2
×
108～200
×
108cfu/g。
43.实施例2产品体外试验效果
44.1、材料与方法
45.运用口腔取样器，分别采集2头以上的瘤胃内容物，等体积混合后，四层纱布过滤，并迅速加入装有经co2饱和并预热(39℃)的缓冲液的玻璃瓶中，配制成混合培养液(瘤胃液
与缓冲液配比为1:1)。试验组玻璃管中加入混合液70ml，菌粉2g(实测活菌数4.3亿cfu/g)，理论上初始菌含量为12.3x106cfu/ml。
46.2、试验结果
47.丁酸梭菌产品对瘤胃ph的影响随时间的变化规律结果列于图1。由图1可知，与对照组相比，丁酸梭菌在各取样时间点均降低了瘤胃ph值，最后稳定在ph值6.0左右。丁酸梭菌在瘤胃液中的生长情况列于图2。由图2可知，与对照组相比，丁酸梭菌组在各取样时间点的菌体浓度均高于对照组，且呈现先增加然后平稳的趋势，表明产品中丁酸梭菌能在瘤胃环境中复苏并增值，且能够降低瘤胃液的ph值，降低有害菌的增值
48.丁酸梭菌产品对饲料消化率的影响列于表1。由表1可知与对照组相比，丁酸梭菌产品显著提高干物质(dm)消化率、中性洗涤纤维(ndff和酸性洗涤纤维(adf)的消化率，分别提高了1.7％、1.54％、0.48％，表明丁酸梭菌产品可有效提高饲料在瘤胃中的降解率。
49.表1丁酸梭菌产品对饲料消化率的影响
[0050][0051]
实施例3产品在1～3月龄肉牛上的应用效果
[0052]
1、材料与方法
[0053]
试验选用45头体重为54kg左右的胭脂和牛，随机平均分为三个处理组：对照组饲喂基础日粮，4g试验组在基础日粮上添加益生菌产品4g/d
·
头，8g试验组在基础日粮上添加益生菌产品8g/d
·
头，产品活菌数为5x 108cfu/g。试验在山东菏泽某牧场进行，试验期共64天。
[0054]
2、试验结果
[0055]
产品对犊牛日增重的影响列于图3和图4。由图3可知，与对照组相比，本发明产品4g添加量组(c4试验组)可提高1
‑
2月龄犊牛日增重90g，8g添加量组(c8试验组)提高1
‑
2月龄犊牛日增重120g。由图4可知，与对照组相比，本发明产品4g添加量组(c4试验组)可提高2
‑
3月龄犊牛日增重量高于对照组40g，8g添加量组(c8试验组)提高2
‑
3月龄犊牛日增重量高于对照组60g。
[0056]
实施例4产品在5～7月龄肉牛上的应用效果
[0057]
1、材料与方法
[0058]
试验选用56头体重为200kg左右的牛，公犊牛28头，母犊牛28头，分为四组。公犊牛、和母犊牛对照组饲喂基础日粮，公犊牛和母犊牛试验组在基础日粮上添加丁酸梭菌制剂10g/d
·
头，产品活菌数为5x 108cfu/g。试验在山东某牧场进行，试验期共67天。
[0059]
2、试验结果
[0060]
产品对5～7月龄肉牛日增重的作用效果列于图5和图6。由图5和图6可知，与对照组相比，本发明产品每头牛每天添加10g可提高5
‑
7月龄公犊牛日增重量高于对照组170g，提高母犊牛日增重量高于对照组140g。
[0061]
实施例5产品在育肥牛上的应用效果
[0062]
1、材料与方法
[0063]
试验选用12头体重为520kg左右的西门塔尔杂交牛，随机平均分为两个处理组：对照组饲喂基础日粮，试验组在基础日粮上添加本发明产品20g/d
·
头。试验在溢多利产学研反刍试验基地进行，试验期共36d，试验第一天和最后一天分别对头牛进行称重。
[0064]
2、试验结果
[0065]
产品对育肥牛日增重及粪便中丁酸梭菌活菌数的影响列于图7和图8。由图7可知，与对照组相比，本发明产品每头牛每天添加20g提高肉牛日增重量高于对照组170g。由图8可知，试验组肉牛粪便中丁酸梭菌活菌数是对照组的7.2倍，达到15.9x10
4 cfu/g。
[0066]
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明产品所作的详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。