硫酸软骨素合成促进用组合物的制作方法

1.本发明涉及一种硫酸软骨素合成促进用组合物。此外，本发明还涉及促进硫酸软骨素合成的方法等。


背景技术：

2.硫酸软骨素为酸性粘多糖的一种，在动物体内，以与通常称作核心蛋白质的作为核的蛋白质共价键合的蛋白多糖的形式存在。硫酸软骨素存在于动物的软骨、皮肤等结缔组织、脑组织等多种组织中，尤其多存在于软骨的细胞外基质中。
3.软骨为软骨细胞以及包围其的基质构成的结缔组织，在人类等动物中，形成关节、骨骼等。例如关节软骨薄薄地覆盖关节骨的表面，起到使关节的活动流畅的作用。因年龄增加等而关节软骨减少时，则会产生关节痛等问题。专利文献1中记载有一种用于防止或治疗软骨损坏的组合物，其特征在于，含有橄榄苦苷及/或羟基酪醇，进一步含有槲皮素。
4.专利文献
5.专利文献1：日本特表2016-520603号公报


技术实现要素：

6.专利文献1所述的组合物为用于防止或治疗(用于抑制或减少)软骨损坏的物质。然而，因年龄增加等一旦软骨减少，则防止软骨损坏并无法使减少的软骨增加。专利文献1中并未探讨对于软骨的合成促进有效的物质。例如，可促进作为软骨基质的成分的硫酸软骨素等的合成的成分，有助于促进软骨合成，对于增加软骨有用。
7.本发明的目的在于提供一种促进硫酸软骨素合成的硫酸软骨素合成促进用组合物。此外，本发明的目的还在于提供一种促进硫酸软骨素合成的方法。
8.本发明者等，为了解决上述课题进行深入研究，结果发现槲皮素或其糖苷具有促进与硫酸软骨素的合成相关的糖基转移酶表达的作用，对于硫酸软骨素量增加及软骨功能维持等有用。
9.即，虽不限定于此，但本发明涉及以下硫酸软骨素合成促进用组合物、促进硫酸软骨素合成的方法等。
10.[1]一种硫酸软骨素合成促进用组合物，其特征在于，含有槲皮素或其糖苷作为有效成分。
[0011]
[2]根据上述[1]所述的硫酸软骨素合成促进用组合物，其特征在于，促进与硫酸软骨素的合成相关的糖基转移酶的表达。
[0012]
[3]根据上述[2]所述的硫酸软骨素合成促进用组合物，其特征在于，与硫酸软骨素的合成相关的糖基转移酶为选自硫酸软骨素n-乙酰氨基半乳糖基转移酶1、硫酸软骨素n-乙酰氨基半乳糖基转移酶2、木糖基转移酶2、β-1，3-半乳糖基转移酶1、硫酸软骨素合成酶1及软骨素聚合因子2中的1种以上。
[0013]
[4]根据上述[2]或[3]所述的硫酸软骨素合成促进用组合物，其特征在于，与硫酸
软骨素的合成相关的糖基转移酶为硫酸软骨素n-乙酰氨基半乳糖基转移酶1及/或硫酸软骨素n-乙酰氨基半乳糖基转移酶2。
[0014]
[5]根据上述[1]～[4]中任一项所述的硫酸软骨素合成促进用组合物，其特征在于，为饮食品、化妆料或医药部外品。
[0015]
[6]一种促进硫酸软骨素合成的方法，其特征在于，投用槲皮素或其糖苷。
[0016]
[7]根据上述[6]所述的方法，其特征在于，通过促进与硫酸软骨素的合成相关的糖基转移酶的表达，来促进硫酸软骨素的合成。
[0017]
[8]一种应用，其特征在于，将槲皮素或其糖苷用于促进硫酸软骨素的合成。
[0018]
[9]根据上述[8]所述的应用，其特征在于，通过促进与硫酸软骨素的合成相关的糖基转移酶的表达，来促进硫酸软骨素的合成。
[0019]
根据本发明，提供一种促进硫酸软骨素合成的硫酸软骨素合成促进用组合物。根据本发明，提供一种促进硫酸软骨素合成的方法。
附图说明
[0020]
图1为表示添加有5μm槲皮素的hch细胞的硫酸软骨素量的图表。
[0021]
图2为表示投用槲皮素糖苷(qg)的小鼠的膝关节软骨部区域的与硫酸软骨素的合成相关的糖基转移酶基因及ext1基因的表达量的图表(p：csgalnact1基因、q：csgalnact2基因、r：chpf基因、s：xylt2基因、t：ext1基因)。
[0022]
图3为表示投用qg的小鼠的大腿骨关节部的硫酸软骨素量的图表。
[0023]
图4为表示投用qg的小鼠的膝关节部的软骨部的面积的图表。图4中所示相对面积，为以对照组的膝关节部的软骨部的面积为1时的qg投用组的该面积的相对值。
[0024]
图5a为表示添加槲皮素的细胞中的csgalnact1基因的表达量的图表。图5b为表示添加槲皮素的细胞中的csgalnact2基因的表达量的图表。图5c为表示添加槲皮素的细胞中的xylt2基因的表达量的图表。图5d为表示添加槲皮素的细胞中的b3galt1基因的表达量的图表。
[0025]
图6a为表示添加槲皮素的细胞中的chsy1基因的表达量的图表。图6b为表示添加槲皮素的细胞中的chpf2基因的表达量的图表。图6c为表示添加槲皮素的细胞中的ext1基因的表达量的图表。图6d为表示添加槲皮素的细胞中的ext2基因的表达量的图表。
[0026]
图7为表示添加5μm槲皮素的oscv2细胞中的硫酸软骨素量的图表。
[0027]
图8为表示与硫酸软骨素(cs)及硫酸乙酰肝素(hs)的合成路径相关的酶的名称的图。
具体实施方式
[0028]
本发明的硫酸软骨素合成促进用组合物含有槲皮素或其糖苷作为有效成分。以下，也仅将本发明的硫酸软骨素合成促进用组合物称作本发明的组合物。
[0029]
本说明书中，所谓“槲皮素”是指作为属于多酚的一种的黄酮醇的化合物的槲皮素。本发明中，“槲皮素糖苷”是指上述槲皮素的糖苷，具体而言，为在槲皮素的3位的羟基上1个以上的糖进行糖苷键合的一系列化合物的总称。槲皮素糖苷为下述通式所示的化合物。下述通式中的(x)n表示糖链。x表示糖(单糖)，n为1以上的整数。槲皮素糖苷可为1种化合
物，也可为2种以上的化合物。
[0030]
[化学式1]
[0031][0032]
与槲皮素进行糖苷键合的以x表示的构成糖链的糖，例如为葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、糖醛酸等，优选为葡萄糖、鼠李糖。此外，n为1以上即可，并无特别限制，优选为1～16，更优选为1～8。n为2以上时，x部分可由1种糖构成，也可由多种糖构成。换言之，n为2以上时，(x)n可为由1种糖构成的糖链，也可为由多种糖构成的糖链。本发明中的槲皮素糖苷，包括对已存的槲皮素糖苷通过酶等进行处理而使糖转移而得的物质。本发明中的槲皮素糖苷，具体而言包括芸香苷、酶处理芸香苷、槲皮苷、异槲皮素等。本发明中，作为槲皮素糖苷，特别优选使用芸香苷的酶处理物。作为芸香苷的酶处理物的优选例，可列举对芸香苷进行酶处理而去除鼠李糖糖链部分而得的异槲皮素，通过糖基转移酶对异槲皮素进行处理而得的在异槲皮素上键合有由1～7个葡萄糖构成的糖链的物质，及以它们的混合物为主成分的物质。在一种方式中，作为槲皮素糖苷，优选在槲皮素的3位的羟基上1～8个葡萄糖进行糖苷键合的化合物(例如，异槲皮素、异槲皮素上1～7个葡萄糖键合的糖苷)等。
[0033]
被摄取的槲皮素糖苷在肠道内糖被切断形成糖苷配基(槲皮素)而被吸收至体内。
[0034]
本发明中，关于用于获得槲皮素或其糖苷的来源、制法并无特别限制。例如，作为富含槲皮素或其糖苷的植物，已知有荞麦、槐、续随子、苹果、茶、洋葱、葡萄、西蓝花、长蒴黄麻(
モロヘイヤ
)、覆盆子、越橘、蔓越莓、仙人掌属、叶菜类、柑橘类等，由这些植物可获得槲皮素或其糖苷。
[0035]
槲皮素或其糖苷可使用化学合成品。本发明中，只要发挥本发明的效果，也可使组合物含有：含有槲皮素或其糖苷的植物的提取物等植物来源原料等。也可使用精制或分离的槲皮素或其糖苷。
[0036]
槲皮素或其糖苷含于天然物或饮食品中，是具有食用经验的化合物。因此从安全性的观点出发，认为槲皮素或其糖苷例如即使每天摄取也少有问题。从而，根据本发明，可提供一种含有安全性高的物质作为有效成分的硫酸软骨素合成促进用组合物。
[0037]
硫酸软骨素具有以下结构，即在具有d-糖醛酸与n-乙酰-d-半乳糖胺键合的二糖单元的重复结构的糖链上键合有硫酸的结构。硫酸软骨素的糖链部分通过糖基转移酶合成。
[0038]
图8示出与硫酸软骨素(cs)及硫酸乙酰肝素(hs)的合成路径相关的酶的名称(参考文献：生物化学87(6)：744-748(2015))。
[0039]
在软骨等中，蛋白多糖的向核心蛋白质上的硫酸软骨素(cs)链的附加，首先在核心蛋白质内的硫酸软骨素键合序列内的丝氨酸残基(ser)上木糖(xyl)、2分子的半乳糖(gal)、d-糖醛酸(glca)依次转移合成xyl-gal-gal-glca的糖链。xyl向丝氨酸残基上的转移通过木糖基转移酶(xylt)，gal向xyl上的转移通过β-1，4-半乳糖基转移酶(b4galt)，第二gal向第一gal上的转移通过β-1，3-半乳糖基转移酶(b3galt)，glca向gal上的转移通过
β-1，3-葡糖酸内酯转移酶(b3gat)来进行。接着，n-乙酰-d-半乳糖胺(galnac)转移至非还原末端(伸长侧)的glca。该galnac的转移通过硫酸软骨素n-乙酰氨基半乳糖基转移酶1(csgalnact1)或硫酸软骨素n-乙酰氨基半乳糖基转移酶2(csgalnact2)来进行。然后，glca、galnac依次交替转移至非还原末端的galnac上，从而糖链伸长。该糖链伸长过程，通过csgalnact1、csgalnact2、软骨素聚合因子(chondroitin polymerizing factor)2(chpf2)、硫酸软骨素合成酶1、2及3(chsy1、chsy2及chsy3)来进行。csgalnact1及csgalnact2具有使galnac向glca转移的转移活性。chpf2具有使glca向galnac转移的糖转移活性。chsy1、chsy2及chsy3表现使galnac向glca转移的糖转移活性，及使glca向galnac转移的糖转移活性。促进与硫酸软骨素的合成相关的糖基转移酶的表达时，可促进硫酸软骨素的合成。
[0040]
如图8所示，在硫酸乙酰肝素(hs)链的附加中，上述核心蛋白质的丝氨酸残基上附加的xyl-gal-gal-glca的糖链的非还原末端上，galnac通过exostosin 1(ext1)、exostosin 2(ext2)、ext-like1(extl1)、ext-like2(extl2)、ext-like3(extl3)进行转移。然后，glca、galnac依次交替转移至非还原末端的galnac上，糖链伸长。
[0041]
如后述实施例所示，在槲皮素的存在下对细胞进行培养时，与槲皮素不存在时相比对csgalnact1进行编码的基因(csgalnact1)、对csgalnact2进行编码的基因(csgalnact2)等，对与硫酸软骨素的合成相关的糖基转移酶进行编码的基因(糖基转移酶基因)的表达量增加。此外，在槲皮素的存在下对软骨细胞等细胞进行培养时，与对照相比观察到硫酸软骨素量显著增加。此外使动物摄取槲皮素糖苷时，在膝关节中，对csgalnact1、csgalnact2等与硫酸软骨素的合成相关的糖基转移酶进行编码的基因的表达量显著增加，且关节中的硫酸软骨素量显著增加。进一步，在摄取槲皮素糖苷的动物中，关节软骨的面积增加。
[0042]
从而槲皮素或其糖苷具有促进硫酸软骨素合成的作用及促进与硫酸软骨素的合成相关的糖基转移酶表达的作用。槲皮素或其糖苷可作为用于促进硫酸软骨素合成，用于促进与硫酸软骨素的合成相关的糖基转移酶表达的有效成分使用。本发明中，硫酸软骨素的合成促进、与硫酸软骨素的合成相关的糖基转移酶的表达促进，优选为对象体内的硫酸软骨素的合成促进、对象体内的该糖基转移酶的表达促进。
[0043]
作为与硫酸软骨素的合成相关的糖基转移酶，可列举硫酸软骨素n-乙酰氨基半乳糖基转移酶1(csgalnact1)、硫酸软骨素n-乙酰氨基半乳糖基转移酶2(csgalnact2)、木糖基转移酶(xylt)、β-1，3-半乳糖基转移酶(b3galt)、β-1，4-半乳糖基转移酶(b4galt)、硫酸软骨素合成酶1～3(chsy1～3)、软骨素聚合因子(chondroitin polymerizing factor)2(chpf2)等。与硫酸乙酰肝素链的合成相关的5种糖基转移酶(ext1、ext2、extl1(extl1)、extl2(extl2)、extl3(extl3))不包含在本发明的与硫酸软骨素的合成相关的糖基转移酶中。
[0044]
本发明的硫酸软骨素合成促进用组合物可促进与硫酸软骨素的合成相关的糖基转移酶的表达。在一种方式中，本发明的组合物可用于通过促进与硫酸软骨素的合成相关的糖基转移酶的表达来促进硫酸软骨素的合成。与硫酸软骨素的合成相关的糖基转移酶优选为选自硫酸软骨素n-乙酰氨基半乳糖基转移酶1、硫酸软骨素n-乙酰氨基半乳糖基转移酶2、木糖基转移酶2、β-1，3-半乳糖基转移酶1(bgalt1)、硫酸软骨素合成酶1及软骨素聚合
因子2中的1种以上。优选本发明的组合物可促进这些中的1种或2种以上的糖基转移酶的表达。在优选方式中，本发明的组合物可促进硫酸软骨素n-乙酰氨基半乳糖基转移酶1及/或硫酸软骨素n-乙酰氨基半乳糖基转移酶2的表达，可用于这样的目的。csgalnact1、csgalnact2被认为是硫酸软骨素合成的起点上重要的酶。更优选本发明的组合物可促进硫酸软骨素n-乙酰氨基半乳糖基转移酶1、硫酸软骨素n-乙酰氨基半乳糖基转移酶2、木糖基转移酶2及软骨素聚合因子2的表达。
[0045]
上述糖基转移酶的表达促进，包括促进编码糖基转移酶的基因的表达及促进该酶的蛋白质水平上的表达，为任一者或两者均可。作为上述基因的表达促进，可列举mrna的表达促进，优选为向mrna的转录促进。糖基转移酶的蛋白质水平上的表达促进包括翻译时的促进。
[0046]
在一种方式中，本发明的组合物可优选用于在软骨细胞中促进与硫酸软骨素的合成相关的糖基转移酶的表达，或在软骨细胞中促进硫酸软骨素的合成等。在软骨中通过促进硫酸软骨素的合成，可促进软骨的合成。在一种方式中，本发明的组合物可用于促进软骨的合成。通过促进软骨合成，可使软骨增加。促进软骨合成，例如，对于预防软骨减少有用。
[0047]
报告称在脑中，促进硫酸软骨素的合成时，海马体中的神经细胞的新生得到促进。此外，在成骨细胞中，促进硫酸软骨素的合成时，可促进骨形成。
[0048]
槲皮素或其糖苷具有在神经细胞或成骨细胞中促进与硫酸软骨素的合成相关的糖基转移酶表达的作用，可促进硫酸软骨素的合成。槲皮素或其糖苷对于在神经细胞(优选海马体的神经细胞)中促进硫酸软骨素的合成，保护神经有用。通过保护神经可期待认知功能改善效果等。槲皮素或其糖苷对于在成骨细胞中促进硫酸软骨素的合成，促进骨形成有用。在一种方式中，本发明的组合物可用于保护神经，或促进骨形成。
[0049]
本发明的组合物适用于治疗性用途(医疗用途)或非治疗性用途(非医疗用途)任一种均可。所谓非治疗性，为不包括医疗行为，即人类的手术、治疗或诊断的概念。
[0050]
本发明的组合物，例如可以饮食品、化妆料、医药品、医药部外品、饲料等方式提供。本发明的组合物其可为自身用于促进硫酸软骨素合成的饮食品、化妆料、医药品、医药部外品、饲料等，也可为调配在这些中使用的原料或制剂等。
[0051]
本发明的硫酸软骨素合成促进用组合物，作为例子之一，可以制剂的方式提供，但并不限定于本方式。可将该制剂直接作为组合物提供，或作为含有该制剂的组合物提供。在一种方式中，本发明的硫酸软骨素合成促进用组合物也可称作硫酸软骨素合成促进剂。
[0052]
本发明的组合物为口服用组合物、非口服用组合物均可，优选为口服用组合物。通过使对象口服摄取或对其投用本发明的组合物，或通过非口服投用，可在对象中促进硫酸软骨素的合成。作为口服用组合物，可列举饮食品、口服用医药品、医药部外品、饲料，优选为饮食品或口服用医药品，更优选为饮食品。作为非口服用组合物，可列举化妆料、非口服用医药品、非口服用医药部外品。
[0053]
本发明的组合物，只要不损害本发明的效果，除槲皮素或其糖苷以外，可含有任意的添加剂、任意的成分。这些添加剂及成分可根据组合物的方式等进行选择，可使用通常可用于饮食品、化妆料、医药品、医药部外品、饲料等中的物质。将本发明的组合物制成饮食品、医药品、医药部外品、饲料等时，其制造方法并无特别限定，可通过一般的方法来制造。
[0054]
例如，将本发明的组合物制成饮食品时，可向槲皮素或其糖苷中调配饮食品中可
使用的成分(例如，食品材料，根据需要使用的食品添加物等)制成各种饮食品。饮食品并无特别限定，例如可列举一般性的饮食品、健康食品、健康饮料、功能性标示食品、特定保健用食品、健康辅助食品、患者用饮食品等。上述健康食品、功能性标示食品、特定保健用食品、健康辅助食品等可制成例如细粒剂、片剂、颗粒剂、粉剂、胶囊剂、咀嚼剂、干糖浆剂、糖浆剂、液剂、饮料、流食等的各种制剂形态使用。
[0055]
将本发明的组合物制成化妆料时，可向槲皮素或其糖苷中调配化妆料允许的载体、添加剂等。化妆料的制品形态并无特别限定。
[0056]
将本发明的组合物制成医药品或医药部外品时，例如，可向槲皮素或其糖苷中调配药理学上允许的载体，根据需要而添加的添加剂等，制备各种剂型的医药品或医药部外品。这样的载体、添加剂等，为可用于医药品或医药部外品的药理学上允许的物质即可，例如，可列举赋形剂、结合剂、崩解剂、润滑剂、抗氧化剂、着色剂等的1种或2种以上。作为医药品或医药部外品的投用(摄取)方式，可列举口服或非口服(经皮、经黏膜、经肠、注射等)投用的方式。将本发明的组合物制成医药品或医药部外品时，优选制成口服用医药品或医药部外品。作为用于口服投用的剂型，可列举液剂、片剂、粉剂、细粒剂、颗粒剂、糖衣片剂、胶囊剂、悬浊液、乳剂、咀嚼剂等。作为用于非口服投用的剂型，可列举注射剂、点滴剂、皮肤外用剂(膏药剂、霜剂、软膏等)等。医药品也可为非人类动物用医药。
[0057]
将本发明的组合物制成饲料时，将槲皮素或其糖苷调配于饲料中即可。饲料也包括饲料添加剂。作为饲料，例如可列举用于牛、猪、鸡、羊、马等的家畜用饲料；用于兔子、大鼠、小鼠等的小动物用饲料；用于狗、猫、小鸟等的宠物食品等。
[0058]
本发明的组合物中所含的槲皮素或其糖苷的含量并无特别限定，可根据其形态等设定。本发明的组合物中的槲皮素或其糖苷的含量，例如，作为槲皮素换算值，在该组合物中优选0.01重量％以上，更优选0.1重量％以上，此外，优选80重量％以下，更优选50重量％以下。在一种方式中，槲皮素或其糖苷的含量，作为槲皮素换算值，本发明的组合物中优选0.01～80重量％，更优选0.1～50重量％。
[0059]
槲皮素或其糖苷的含量可依照公知的方法测定，例如，可使用hplc法等。
[0060]
本发明的组合物通常使对象摄取或对其投用。本发明的组合物的投用路径并无特别限定，可根据其形态以适当的方法来摄取或投用。在一种方式中，本发明的组合物优选以口服来摄取(口服投用)。本发明的组合物的投用量(也称作摄取量)并无特别限定，只要为可获得硫酸软骨素合成促进效果、与硫酸软骨素的合成相关的糖基转移酶的表达促进效果的量即可，根据投用方式、投用方法等适当设定即可。
[0061]
在一种方式中，使人类(成人)摄取本发明的组合物或对其投用时，槲皮素或其糖苷的投用量，作为槲皮素换算值，每1天，体重每60kg，优选为0.3mg以上，更优选为1.0mg以上，进一步优选为10mg以上，此外，优选为4000mg以下，更优选为2000mg以下，进一步优选为1000mg以下。在一种方式中，槲皮素或其糖苷的投用量，作为槲皮素换算值，为人类(成人)时，每1天，体重每60kg，优选为0.3～4000mg，更优选为1.0～2000mg，进一步优选为1.0～1000mg，特别优选为10～1000mg。优选将上述量分为1天1次以上，例如1天1次～多次(例如2～3次)来摄取或投用。在一种方式中，优选使人类口服摄取或投用上述量的槲皮素或其糖苷。在本发明的一种方式中，本发明的组合物可用于使人类每体重60kg，每1天摄取或投用上述量的槲皮素或其糖苷。
[0062]
本发明的组合物优选持续摄取或投用。通过持续摄取或投用槲皮素或其糖苷，期待硫酸软骨素合成促进效果提高。在一种方式中，本发明的组合物优选持续摄取或投用1周以上，更优选持续摄取或投用4周以上，进一步优选持续摄取或投用8周以上。
[0063]
本发明的组合物可用于通过促进硫酸软骨素合成而可期待预防或改善的状态或疾病的预防或改善。作为这样的状态或疾病，可列举因硫酸软骨素量的减少而引起的状态或疾病，例如可列举变形性膝关节症、变形性股关节症、脊椎管狭窄症、骨质疏松症等。在一种方式中，本发明的组合物可用于认知功能降低的预防或改善，用于认知症的预防或改善。本说明书中，状态或疾病的预防包含：防止发症，延迟发症，降低发症率，减轻发症的风险等。状态或疾病的改善包含：使对象从状态或疾病中恢复，减轻状态或疾病的症状，使状态或疾病的症状好转，延迟或防止状态或疾病的发展等。
[0064]
摄取或投用本发明的组合物的对象(也可称作投用对象)，并无特别限定。对象优选为人类或非人类哺乳动物，更优选为人类。
[0065]
在一种方式中，作为投用对象，可列举需要或希望促进硫酸软骨素合成的对象及需要或希望因硫酸软骨素量的减少而导致的状态或疾病的预防或改善的对象等。硫酸软骨素量的减少，可为因年龄增加而导致的硫酸软骨素量的减少，也可为中老年者中因年龄增加而导致的硫酸软骨素量的减少。
[0066]
在一种方式中，作为本发明的投用对象可列举中老年者。中老年者包括高龄者。中老年者中，作为对象优选高龄者。本发明中，中老年者例如可为40岁以上的人类。高龄者例如可为60岁以上或65岁以上的人类。在一种方式中，本发明的组合物适合作为中老年者用的硫酸软骨素合成促进用组合物使用。
[0067]
本发明的组合物，例如，也可以通过促进硫酸软骨素合成而可期待预防或改善的状态或疾病的预防等为目的，对健康者使用。
[0068]
本发明的组合物也可附有通过硫酸软骨素合成促进而发挥的功能的标示。本发明的硫酸软骨素合成促进用组合物上，例如也可附有“维持软骨量”、“抑制软骨磨耗”、“抑制软骨变性”、“减轻膝关节不适”、“维持膝关节功能”、“改善移动时膝关节的痛苦”、“缓和膝关节的不协调感”、“改善伴随膝盖的屈伸的动作”、“维持因年龄增加而衰减的膝关节功能”、“通过保护膝关节的软骨的作用，使感觉到行、立、坐等移动功能降低者的膝盖的屈伸顺利，并有助于提高步行能力”等的1种或2种以上的功能的标示。上述功能的标示中，上述功能也可记载为通过促进硫酸软骨素的合成而得的功能。
[0069]
在一种方式中，本发明的组合物优选为附有上述标示的饮食品。此外，上述标示可为为了获得上述功能而使用的含义的标示。该标示可附于组合物自身，也可附于组合物的容器或包装上。
[0070]
本发明还包含以下方法及应用。
[0071]
一种促进硫酸软骨素合成的方法，其特征在于，投用槲皮素或其糖苷。
[0072]
一种应用，其特征在于，将槲皮素或其糖苷用于促进硫酸软骨素的合成。
[0073]
上述方法及应用，可为治疗性的方法或应用，也可为非治疗性的方法或应用。投用(摄取)槲皮素或其糖苷时，可使与硫酸软骨素的合成相关的糖基转移酶的表达量增加。投用槲皮素或其糖苷时，可促进硫酸软骨素的合成。上述方法，可为通过促进与硫酸软骨素的合成相关的糖基转移酶的表达来促进硫酸软骨素的合成的方法。上述应用，可为用于通过
scientific公司)由分离的rna合成cdna。在quantstudio real time pcr system(thermo fisher)中，使用taqman fast universal pcr mastermix(thermo fisher scientific公司)实施定量的pcr，对编码与硫酸软骨素或硫酸乙酰肝素的合成相关的糖基转移酶的基因(糖基转移酶基因)的表达量进行定量。各组的平均值的差使用dunnett’s t test检验进行检验，以5％以下作为显著(＊：p＜0.05vs槲皮素0μm)。实施例2及3中定量的基因的种类，该基因编码的蛋白质以及用于测定的pcr引物及探针示于表1。此外，实施基因解析的各酶在糖胺聚糖合成路径中的位置示于图8。
[0088]
[表1]
[0089][0090]
＜实施例2：基于槲皮素糖苷的硫酸软骨素合成促进效果(in vivo)＞
[0091]
(1)槲皮素糖苷向小鼠的投用
[0092]
将36周龄的c57bl/6j的野生型(wt)小鼠及csgalnact1基因敲除(t1-ko)小鼠，以体重均等的方式，分成饮用蒸馏水组(对照组)或饮用含有4.5g/l槲皮素糖苷(qg)的蒸馏水组(qg投用组)。对于qg投用组的wt小鼠(wt-qg)及t1-ko小鼠(ko-qg)，使其摄取上述含有槲皮素糖苷的蒸馏水18周。每1天每单位体重的槲皮素糖苷的摄取量，以槲皮素换算为117mg/kg。对于对照组的wt小鼠(wt-对照)及t1-ko小鼠(ko-对照)，使其摄取蒸馏水18周。笼子均采用单独饲养，笼子内为了增加运动负荷放置可测量托盘型转轮自发行走的机器(室町机械株式会社)促进一定量的自发运动。开始饮水投用18周后，采集膝关节部组织。使用采集的膝关节部组织，测定基因表达量、硫酸软骨素量及关节软骨量。实施例2中，槲皮素糖苷使用通过糖基转移酶对异槲皮素进行处理而得的在异槲皮素上键合有由1～7个葡萄糖构成的糖链的酶处理异槲皮素。
[0093]
(2)使用小鼠组织的基因表达量的定量
[0094]
使用rneazy mini kit(qiagen公司)从采集的膝关节部中分离rna。使用分离的rna，以上述基因表达量的定量方法中所述的方法，实施cdna合成，并通过定量rt-pcr，对与硫酸软骨素或硫酸乙酰肝素的合成相关的糖基转移酶基因的表达量进行定量(n＝12)。定量的基因为表1所述的csgalnact1、csgalnact2、chpf2、xylt2及ext1。各组的平均值的差使用student’s t test检验进行检验，以5％以下作为显著(＊：p＜0.05vs对照)。
[0095]
结果示于图2(＊：p＜0.05vs对照)。图2为表示投用槲皮素糖苷(qg)的小鼠的膝关节部组织中的与硫酸软骨素的合成相关的糖基转移酶基因(csgalnact1、csgalnact2、chpf2及xylt2)及ext1的表达量的图表(n＝12的平均
±
标准偏差)。图2中p表示csgalnact1，q表示csgalnact2，r表示chpf2，s表示xylt2，t表示ext1。图2中，纵轴的相对mrna水平为将wt小鼠的对照组(wt-对照)的基因的mrna量作为1时，各组的基因的mrna量的相对值。
[0096]
wt小鼠中，与对照组(wt-对照)相比，qg投用组(wt-qg)中确认csgalnact1、csgalnact2、chpf2及xylt2的基因表达量的显著增加。另一方面，未确认ext1的基因表达量的变化。此外，在t1-ko小鼠中，与对照组(ko-对照)相比，qg投用组(ko-qg)中确认csgalnact2、chpf2及xylt2的基因表达量的显著增加。另一方面，未确认ext1的基因表达量的变化。
[0097]
(3)使用小鼠组织的硫酸软骨素量的定量
[0098]
通过三氯乙酸沉淀从采集的膝关节部组织中去除蛋白质成分，通过乙醇沉淀对糖胺聚糖组分进行浓缩。除盐后，通过软骨素酶分解糖胺聚糖，在下述条件下，通过高效液相色谱法(岛津制作所株式会社)对以2-氨基苯甲酰胺进行荧光标记的2糖单元的硫酸软骨素进行定量(n＝6)。
[0099]
＜hplc条件＞
[0100]
管柱：docosil sp100 5.0μm 4.6
×
100mm(株式会社senshu科学)
[0101]
保护柱：myghtysil rp-18gp 5.0μm，4.6
×
10mm(关东化学株式会社)
[0102]
洗脱液：
[0103]
a.蒸馏水
[0104]
b.0.2m nacl
[0105]
c.10mm tetrabutyl ammonium hydrogen sulfate
[0106]
d.50％acetonitril
[0107]
梯度条件：
[0108]
0-10min：a(70％)、b(1％)、c+d(29％)(c(12％)、d(17％))
[0109]
10-11min：a(67％)、b(4％)、c+d(29％)(c(12％)、d(17％))
[0110]
11-20min：a(61％)、b(10％)、c+d(29％)(c(12％)、d(17％))
[0111]
20-26min：a(53％)、b(18％)、c+d(29％)(c(12％)、d(17％))
[0112]
26-28min：a(35％)、b(36％)、c+d(29％)(c(12％)、d(17％))
[0113]
28-37min：a(18％)、b(53％)、c+d(29％)(c(12％)、d(17％))
[0114]
37-57min：a(70％)、b(1％)、c+d(29％)(c(12％)、d(17％))
[0115]
流速(洗脱液)：1.1ml/min
[0116]
反应液：
[0117]
a.0.5％2-cyanoacetate solution
[0118]
b.0.25m naoh
[0119]
流速(反应液)：0.7ml/min
[0120]
注入量：50μl
[0121]
荧光显示器：ex 346nm，em 410nm，at 64，gain
×
100
[0122]
积分器：end time 40min，speed 2min/min，at 512
[0123]
各组的平均值的差使用student’s t test检验进行检验，以5％以下作为显著(＊：p＜0.05vs对照)。
[0124]
结果示于图3(＊：p＜0.05vs对照)。图3为表示投用槲皮素糖苷(qg)的小鼠的膝关节部的硫酸软骨素量的图表。(n＝6的平均
±
标准偏差)。图3中，纵轴的相对cs水平为将wt小鼠的对照组的硫酸软骨素(cs)量作为1时，各组的cs量的相对值。wt及t1-ko小鼠中，与对照组(wt-对照及ko-对照)相比，在qg投用组(wt-qg及ko-qg)中确认硫酸软骨素量显著增加。通过摄取槲皮素糖苷，膝关节部的硫酸软骨素量增加。
[0125]
(4)使用小鼠组织的关节软骨量的定量
[0126]
对采集的膝关节部组织进行福尔马林固定，作为连续石蜡切片制作样本。使关节部中区域最广的中心部露出，同时每1个组织由此选择20片100微米的切片，通过he染色以各面积变动幅度达到一致的方式来测量。通过图像分析软件image j对关节软骨部的面积进行定量(n＝18)。各组的平均值的差使用student’s t test检验进行检验，以5％以下作为显著(＊：p＜0.05vs对照)。
[0127]
结果示于图4(＊：p＜0.05vs对照)。图4为表示投用槲皮素糖苷的小鼠的膝关节部的软骨部的面积的图表。图4所示的相对面积为将wt小鼠的对照组的软骨部的面积作为1时，各组的软骨部的面积的相对值。
[0128]
wt小鼠中，与对照组(wt-对照)相比，qg投用组(wt-qg)中，确认关节软骨部面积的显著增加。另一方面，t1-ko小鼠中，与对照组(ko-对照)相比，qg投用组(ko-qg)中有增加倾向，但未确认显著变化。
[0129]
＜实施例3：基于槲皮素的硫酸软骨素合成促进效果2(in vitro)＞
[0130]
(1)各种细胞的培养
[0131]
在含有10％牛胎儿血清的dulbecco’s modified eagle medium(sigma-aldrich公司)中培养c6细胞(神经胶质系细胞)、skov3细胞(卵巢腺癌细胞)、c1300细胞(成神经细胞)、kings1细胞(神经胶质系细胞)、nm-cg1细胞(神经胶质系细胞)、mc3t3-e1细胞(成骨细胞)、oscv2细胞(破骨细胞)至100％汇合为止。
[0132]
(2)使用细胞的基因表达量的定量
[0133]
向各种细胞(c6细胞、skov3细胞、c1300细胞、kings1细胞、nm-cg1细胞、mc3t3-e1细胞)中添加dmso或0.5μm、1μm或5μm的槲皮素。使用rneazy mini kit(qiagen公司)从添加2小时后的细胞中分离rna。使用分离的rna，以上述基因表达量的定量方法中所述的方法，实施cdna合成及定量的pcr，对与硫酸软骨素或硫酸乙酰肝素的合成相关的糖基转移酶基因的表达量进行定量。各组的平均值的差使用dunnett’s t test检验进行检验，以5％以下作为显著(＊：p＜0.05vs槲皮素0μm)。定量的基因为表1所述的csgalnact1、csgalnact2、xylt2、b3galt1、chsy1、chpf2、ext1及ext2。
[0134]
结果示于图5a、图5b、图5c、图5d、图6a、图6b、图6c及图6d(＊：p＜0.05，vs槲皮素0μm)。图5a为表示添加槲皮素的细胞中的csgalnact1基因的表达量的图表。图5b为表示添加槲皮素的细胞中的csgalnact2基因的表达量的图表。图5c为表示添加槲皮素的细胞中的xylt2基因的表达量的图表。图5d为表示添加槲皮素的细胞中的b3galt1基因的表达量的图表。图6a为表示添加槲皮素的细胞中的chsy1基因的表达量的图表。图6b为表示添加槲皮素的细胞中的chpf2基因的表达量的图表。图6c为表示添加槲皮素的细胞中的ext1基因的表达量的图表。图6d为表示添加槲皮素的细胞中的ext2基因的表达量的图表。
[0135]
图5a～图5d及图6a～图6d中，a表示c6细胞，b表示skov3细胞，c表示c1300细胞，d表示kings1细胞，e表示nm-cg1细胞，f表示mc3t3-e1sk细胞。图5a～图5d及图6a～图6d中，基因的表达量以相对mrna水平表示。相对mrna水平为作为对照将添加dmso的细胞(槲皮素浓度0μm)中的各基因的mrna量作为1时，添加槲皮素的细胞(槲皮素浓度0.5μm、1μm或5μm)中的mrna量的相对值(n＝8的平均
±
标准偏差)。
[0136]
通过添加5μm槲皮素，csgalnact1及csgalnact2在任一种细胞中均确认到基因表达量的显著增加(图5a及图5b)。xylt2在c6细胞、c1300细胞、kings1细胞、nm-cg1细胞及mc3t3-e1细胞中(图5c)，b3galt1在skov3细胞、kings1细胞及mc3t3-e1细胞中(图5d)，chsy1在skov3细胞、c1300细胞、kings1细胞、nm-cg1细胞及mc3t3-e1细胞中(图6a)，chpf2在skov3细胞、c1300细胞、kings1细胞及mc3t3-e1细胞中(图6b)，确认到因添加5μm槲皮素而带来的基因表达量的显著增加。另一方面，与硫酸乙酰肝素的合成相关的ext1及ext2在任一种细胞中均未确认基因表达量的显著变动(图6c及图6d)。
[0137]
(3)使用细胞的硫酸软骨素量的定量
[0138]
向oscv2细胞的培养基中添加5μm的槲皮素进行培养。通过基于抗硫酸软骨素抗体(cs-56)的cell elisa系统对添加4天后的培养细胞的硫酸软骨素量进行定量。对照细胞除添加dmso以外以相同方法进行培养，对硫酸软骨素进行定量。各组的平均值的差使用student’s t test检验进行检验，以5％以下作为显著(＊：p＜0.05vs对照)。
[0139]
结果示于图7(＊：p＜0.05vs对照)。图7为表示添加5μm槲皮素的oscv2细胞中的硫酸软骨素量的图表。图7中，纵轴的相对cs水平为作为对照将添加dmso的细胞中的硫酸软骨素(cs)量作为1时，添加槲皮素的细胞中的cs量的相对值(均为n＝4的平均
±
标准偏差)。图
7中，“槲皮素”为在添加槲皮素的培养基中培养的细胞。通过添加5μm槲皮素，确认硫酸软骨素量显著增加。
[0140]
由以上的结果，可知槲皮素或其糖苷具有促进与硫酸软骨素的合成相关的糖基转移酶表达的作用，具有促进硫酸软骨素合成的作用。槲皮素或其糖苷具有使关节软骨量增加的作用。