日粮配制品的制作方法

日粮配制品
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2019年12月19日提交的美国临时专利申请号62/950,747和2020年9月9日提交的美国临时专利申请号63/075,972的优先权，以上每一项的公开通过援引以其全文并入。
3.通过援引并入
4.于2019年12月17日创建并同时提交的、以大小为130kb、名称为“20191217_nb41781-us-psp_sequence listing_st25”的文件形式提供的序列表通过援引以其全文并入本文。
技术领域
5.本领域涉及不含或基本上不含或含有减少的无机磷酸盐和/或不含肉骨粉以及含有工程化的植酸酶多肽的家禽日粮及其用于增强动物性能的用途。


背景技术：

6.植酸酶是单胃动物饲料中最常用的外源酶。植酸酶可降低植酸盐的抗营养作用，并提高磷、钙、氨基酸和能量的消化率，以及减少无机磷排泄对环境的负面影响。
7.植酸盐是谷类和豆类中磷的主要存储形式。然而，单胃动物诸如猪、家禽和鱼不能有效地代谢或吸收其日粮中的植酸盐(或植酸)，因此将其排泄，从而导致畜牧生产密集地区的磷污染。此外，植酸还通过螯合金属剂诸如钙、铜和锌，并与消化道各个区段中的蛋白质和氨基酸形成不溶性复合物，从而在单胃动物中充当抗营养剂。
8.通过外源植酸酶的作用，植酸盐通常被水解以产生较低级的肌醇磷酸盐和无机磷酸盐。植酸酶用作动物饲料的添加剂，其中它们改善有机磷对于动物的可用性并降低环境的磷酸盐污染(wodzinski r j,ullah a h.adv appl microbiol.[应用微生物学进展]42,263-302(1996))。然而，尽管所提供的植酸酶在动物饲料中的作用，但是为了为这些动物的生长和健康提供足够的磷酸盐，仍然必须向它们的日粮中添加无机磷，特别是在0-10日龄的幼肉鸡中。此类添加可能是昂贵的，并且进一步增加了污染问题。
[0009]
因此，需要开发动物日粮，特别是用于家禽的动物日粮，其基本上或完全不含无机磷酸盐，同时与补充有无机磷酸盐来源(诸如磷酸一钙和/或肉和骨粉)的含植酸酶的日粮相比，仍确保在所有生长阶段中的正常生长特性。


技术实现要素：

[0010]
本文尤其提供了含有植酸酶的动物日粮，该动物日粮不含或基本上不含外源添加的无机磷酸盐或含有显著减少的外源添加的无机磷酸盐。当饲喂给家禽时，与含有无机磷酸盐补充的日粮相比，这些日粮确保在所有发育阶段的正常生长。
[0011]
因此，在一个方面，本文提供了一种家禽日粮，其包含(i)工程化的植酸酶多肽或其含有植酸酶活性的片段；以及(ii)不含或基本上不含无机磷。在一些实施例中，所述植酸
酶多肽或其含有植酸酶活性的片段与seq id no:1所示的氨基酸序列具有至少82％的序列同一性。在一些实施例中，所述植酸酶多肽包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:25、seq id no:26、seq id no:27、seq id no:28、seq id no:29、seq id no:30、seq id no:31、seq id no:32、seq id:no:33、seq id no:34、seq id no:35、seq id no:36和seq id no:37。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该日粮进一步包含以下一种或多种：(a)包含至少一种细菌菌株的直接饲喂微生物、(b)至少一种其他酶、和/或(c)精油。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，工程化的植酸酶多肽或其片段以至少约0.1g/吨饲料的量存在。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该日粮进一步包含在开食日粮中约0.62％至0.72％、在生长日粮中约0.54％至0.64％、和/或在育肥日粮中约0.42％至0.55％的钙。在一些实施例中，该育肥日粮包含约0.46％至0.55％的钙。在其他实施例中，该育肥日粮包含约0.42％至0.50％的钙。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该日粮包含在开食日粮中约1.18％至1.22％、在生长日粮中约1.06％至1.10％、和/或在育肥日粮中约0.88％至1.0％的氨基酸(例如，可消化赖氨酸)。在一些实施例中，该育肥日粮包含约0.96％至1.0％的氨基酸(例如，可消化赖氨酸)。在其他实施例中，该育肥日粮包含约0.88％至0.92％的氨基酸(例如，可消化赖氨酸)。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该日粮包含在开食日粮中约2824至2950kcal/kg、在生长日粮中约2924至3050kcal/kg、和/或在育肥日粮中约2970至3120kcal/kg的代谢能。在一些实施例中，该育肥日粮包含约2970至3100kcal/kg的代谢能。在其他实施例中，该育肥日粮包含约2994至3120kcal/kg的代谢能。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，对于所有阶段(开食、生长和育肥日粮)，该日粮包含约0.13％至0.17％的钠。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该日粮含有植酸盐来源，该植酸盐来源包含玉米、小麦、豆粕、菜籽、稻和/或麦麸中的一种或多种。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该日粮进一步包含燕麦皮。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该日粮缺乏肉和/或骨粉。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该日粮进一步包含一种或多种选自由木聚糖酶、蛋白酶、淀粉酶和葡糖淀粉酶组成的组的另外的饲料酶。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该日粮是开食日粮。在本文公开的任何实施例的一些实施例中，该日粮是生长日粮。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该日粮是育肥日粮。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该家禽是肉鸡或蛋鸡。
[0012]
在另外的方面，本文提供了一种用于在一个或多个指标方面改善动物性能的方法，该方法包括向动物施用有效量的本文公开的任何日粮。在一些实施例中，该一个或多个指标选自由以下组成的组：饲料效率增加、增重增加、饲料转化率降低、饲料中营养物或能量的消化率改善、氮保留量改善、避免坏死性肠炎负面作用的能力改善和免疫应答改善。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该动物是家禽。在本文公开的任何实施例中的一些实施例中，该家禽选自由火鸡、鸭、鸡、鹅、野鸡、鹌鹑和鸸鹋组成的组。在一些实施例中，该鸡选自由蛋鸡和肉鸡组成的组。在一些实施例中，与饲喂未补充本文公开的任何植酸
酶的不含无机磷酸盐的日粮的蛋鸡的产蛋量相比，蛋鸡的产蛋量提高多达12.5％。在其他实施例中，与来自饲喂未补充本文公开的任何植酸酶的不含无机磷酸盐的日粮的蛋鸡的蛋质量相比，蛋质量提高多达15.6％，。
附图说明
[0013]
图1a和图1b是描绘在(a)第0至22天和(b)第0至42天期间日粮(pc/ipf)与性别(f/m)之间的相互作用对fcr(g/g)的影响的柱状图。带有不同上标字母的平均值在p《0.05时显著不同；处理平均值的比较通过tukey检验进行。ipf＝不含无机磷酸盐；f＝雌性；m＝雄性。
[0014]
序列简述
[0015]
以下序列遵循37 c.f.r.
§§
1.821-1.825(“requirements for patent applications containing nucleotide sequences and/or amino acid sequence disclosures-the sequence rules[含有核苷酸序列和/或氨基酸序列公开的专利申请的要求-序列规则]”)并符合世界知识产权组织(wipo)标准st.25(2009)、以及欧洲专利公约(epc)和专利合作条约(pct)细则第5.2和49.5(a-bis)条、以及行政章程第208款和附件c关于序列表的要求。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循37c.f.r.
§
1.822所示的规则。
[0016]
seq id no:1对应于工程化的植酸酶phy-13594的预测的成熟序列。
[0017]
seq id no:2对应于工程化的植酸酶phy-10931的预测的成熟序列。
[0018]
seq id no:3对应于工程化的植酸酶phy-10957的预测的成熟序列。
[0019]
seq id no:4对应于工程化的植酸酶phy-11569的预测的成熟序列。
[0020]
seq id no:5对应于工程化的植酸酶phy-11658的预测的成熟序列。
[0021]
seq id no:6对应于工程化的植酸酶phy-11673的预测的成熟序列。
[0022]
seq id no:7对应于工程化的植酸酶phy-11680的预测的成熟序列。
[0023]
seq id no:8对应于工程化的植酸酶phy-11895的预测的成熟序列。
[0024]
seq id no:9对应于工程化的植酸酶phy-11932的预测的成熟序列。
[0025]
seq id no:10对应于工程化的植酸酶phy-12058的预测的成熟序列。
[0026]
seq id no:11对应于工程化的植酸酶phy-12663的预测的成熟序列。
[0027]
seq id no:12对应于工程化的植酸酶phy-12784的预测的成熟序列。
[0028]
seq id no:13对应于工程化的植酸酶phy-13177的预测的成熟序列。
[0029]
seq id no:14对应于工程化的植酸酶phy-13371的预测的成熟序列
[0030]
seq id no:15对应于工程化的植酸酶phy-13460的预测的成熟序列。
[0031]
seq id no:16对应于工程化的植酸酶phy-13513的预测的成熟序列。
[0032]
seq id no:17对应于工程化的植酸酶phy-13637的预测的成熟序列。
[0033]
seq id no:18对应于工程化的植酸酶phy-13705的预测的成熟序列。
[0034]
seq id no:19对应于工程化的植酸酶phy-13713的预测的成熟序列。
[0035]
seq id no:20对应于工程化的植酸酶phy-13747的预测的成熟序列。
[0036]
seq id no:21对应于工程化的植酸酶phy-13779的预测的成熟序列。
[0037]
seq id no:22对应于工程化的植酸酶phy-13789的预测的成熟序列。
[0038]
seq id no:23对应于工程化的植酸酶phy-13798的预测的成熟序列。
[0039]
seq id no:24对应于工程化的植酸酶phy-13868的预测的成熟序列。
[0040]
seq id no:25对应于工程化的植酸酶phy-13883的预测的成熟序列。
[0041]
seq id no:26对应于工程化的植酸酶phy-13885的预测的成熟序列。
[0042]
seq id no:27对应于工程化的植酸酶phy-13936的预测的成熟序列。
[0043]
seq id no:28对应于工程化的植酸酶phy-14004的预测的成熟序列。
[0044]
seq id no:29对应于工程化的植酸酶phy-14215的预测的成熟序列。
[0045]
seq id no:30对应于工程化的植酸酶phy-14256的预测的成熟序列。
[0046]
seq id no:31对应于工程化的植酸酶phy-14277的预测的成熟序列。
[0047]
seq id no:32对应于工程化的植酸酶phy-14473的预测的成熟序列。
[0048]
seq id no:33对应于工程化的植酸酶phy-14614的预测的成熟序列。
[0049]
seq id no:34对应于工程化的植酸酶phy-14804的预测的成熟序列。
[0050]
seq id no:35对应于工程化的植酸酶phy-14945的预测的成熟序列。
[0051]
seq id no:36对应于工程化的植酸酶phy-15459的预测的成熟序列。
[0052]
seq id no:37对应于工程化的植酸酶phy-16513的预测的成熟序列。
具体实施方式
[0053]
关于适当使用有限资源如无机磷(p)和减少p污染的全球可持续性意识日益增长。虽然家禽在所有动物蛋白质中具有最低的环境影响，但在商业实践中，它仍使用显著量的无机磷酸盐。本技术的发明人惊奇地发现，在肉鸡日粮中使用下一代生物合成细菌6-植酸酶可完全消除用一种或多种无机磷酸盐来源补充日粮的需要和/或可显著减少用一种或多种无机磷酸盐来源补充日粮的需要。所有饲喂补充了植酸酶的不含无机磷酸盐的日粮的动物相对于饲喂含有外源添加的无机磷酸盐的日粮的动物，具有相当的或更好的生长和饲料转化。此外，测试显示这些动物没有表现出经历磷酸盐缺乏的动物的骨丢失或脱矿质特性的症状。相反，与对照相比，饲喂补充了植酸酶、不含无机磷酸盐的日粮的动物的骨抗断强度没有恶化。这代表了第一份显示在所有生长阶段具有正常的生长特性的100％植物的、完全不含无机物且商业相关的肉鸡日粮的报告。因此，使用本文公开的补充了植酸酶、不含无机磷酸盐的日粮既提供了降低的饲料成本(特别是对于大规模工业规模的禽群)形式的经济优势，又提供了由于作为大规模家禽生产的副产物的磷酸盐污染降低而带来的显著的环境益处。
[0054]
引用的所有专利、专利申请和出版物均通过援引以其全文并入本文。
[0055]
在本公开中，使用了许多术语和缩写。除非另外特别说明，以下定义适用。
[0056]
如本文所用，单数形式“一种/一个(a/an)”和“所述/该(the)”包括复数个指示物，除非上下文中另外明确指明。例如，术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可包括多种化合物，包括其混合物。例如，术语“一种/一个(a/an)”、“该/所述(the)”、“一种或多种/一个或多个(one or more)”和“至少一种/至少一个(at least one)”在本文中可互换使用。
[0057]
术语“和/或”以及“或”在本文中可互换使用，并且是指两个指定的特征或组分中的每一个具有或不具有另一个的特定公开。因此，如在本文中的短语“a和/或b”中使用的术语“和/或”旨在包括“a和b”、“a或b”、“a”(单独)和“b”(单独)。同样，如短语“a、b和/或c”中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下方面中的每一者：a、b和c；a、b或c；a或c；a或b；b或c；a和
c；a和b；b和c；a(单独)；b(单独)；以及c(单独)。
[0058]
使用单数形式的词包括复数形式，反之亦然。
[0059]
术语“包含/包括(comprises/comprising)”、“包括(includes/including)”、“具有”以及它们的变形可互换使用，并且意指“包括但不限于”。应当理解，无论在何处用语言“包含”来描述方面，也都提供了以“由
……
组成”和/或“基本上由
……
组成”的术语描述的类似方面。
[0060]
术语“由
……
组成”意指“包括并限于”。
[0061]
术语“基本上由
……
组成”意指组合物的指定材料或方法的指定步骤，以及那些不会对材料或方法的基本特性产生实质性影响的附加材料或步骤。
[0062]
贯穿本技术，各种实施例可以范围的形式呈现。应当理解的是，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应被理解为对本文所述的实施例的范围的不灵活的限制。因此，范围的描述应被认为是具有确切公开的所有可能的子范围以及该范围内的单独数值。例如，范围诸如1至6的描述应被认为具有确切公开的子范围，诸如1至2、1至3、1至4和1至5、2至3、2至4、2至5、2至6、3至4、3至5、3至6等，以及该范围内的单独数字，例如1、2、3、4、5、和6。无论范围的宽度如何，这都适用。
[0063]
如本文所用，术语“约”可允许值或范围的一定程度的可变性，例如在规定值或范围的规定极限的10％以内、5％以内或1％以内。
[0064]
术语“植酸酶”(肌醇六磷酸磷酸水解酶)是指催化植酸(肌醇六磷酸或ip6)(在谷物和油料种子中发现的一种难消化的有机形式的磷)的水解并释放可用形式的无机磷的一类磷酸酶。
[0065]
如本文所用，“家禽”是指禽类诸如火鸡、鸭、鸡、肉仔鸡和蛋鸡。
[0066]
参考书“commercial poultry nutrition[商业家禽营养]”(第3版，2005，isbn 0-9695600-5-2；通过援引并入本文)是关于鸡生产的营养方面领域的标准教科书。以下是被认为与本发明相关的背景的概述。
[0067]
在家禽日粮中递送能量的主要成分是玉米、大豆、豆油和氨基酸。玉米是代谢能的主要贡献者。主要由支链淀粉组成的胚乳淀粉和主要是油的胚芽构成玉米的能量值。以kcal/kg表示的单独的玉米在85％干物质时的典型能量值在3014至3313的范围内。开食和生长日粮的能量水平通常在3000至3100kcal/kg的范围内。在许多国家，小麦也常用于家禽日粮中。此类日粮具有与上述类似的能量水平。大豆作为蛋白质来源已成为其他蛋白质来源与之进行比较的世界标准。大豆的氨基酸谱对于大多数类型的家禽是优异的，并且当与玉米或高粱组合时，甲硫氨酸通常是不足量的唯一因素。另外，脂肪和油在日粮中提供了集中的能量来源，并且甚至相对小的水平变化也可对日粮me具有显著作用。最后，用合成氨基酸诸如甲硫氨酸和赖氨酸补充该日粮。所用的其他重要来源是大麦、高粱和其他谷类，以及对能量有贡献的副产品。
[0068]
用于优化的商业化肉鸡生产的鸡通常根据其年龄饲喂不同的日粮。例如，用于肉鸡生产的鸡可使用三种或四种日粮来饲养。这些日粮通常被称为“开食”、“生长”和“育肥”。“开食前”日粮也是可能的。因此，本文公开的工程化植酸酶可以不同的剂量水平包括在仅开食日粮、仅生长日粮、仅育肥日粮、任何两个阶段的组合或所有阶段的组合中，只要它们不含或基本上不含无机磷酸盐。
[0069]“无机磷”和“无机磷酸盐”在本文中可互换使用，表示通常添加到家禽饲料中以确保动物接受足够磷酸盐来满足动物营养要求的日粮补充剂。然而，当所述日粮还包含适当剂量的本文公开的工程化植酸酶多肽且日粮含有足够的植酸盐作为底物时，本文公开的家禽日粮不含或基本上不含无机磷酸盐。本文用于描述本文公开的日粮配制品中无机磷酸盐的量的表述“基本上没有(substantially none或substantially no)”是指存在的任何量是痕量、无意中包括的量和/或在日粮中小于约0.1％的量。
[0070]“开食”、“生长”和“育肥”日粮通常以粗蛋白含量来区分，粗蛋白含量通常由成分诸如豆粕(sbm)提供。例如，用于肉仔鸡的开食日粮可任选地含有约22-25重量％的粗蛋白含量，诸如22％、23％、24％或25％，其中23％或25％是优选的。在另一个实例中，用于肉仔鸡的生长日粮可任选地含有约21-23重量％的粗蛋白含量，诸如21％、22％或23％，其中22％是优选的。在另一个实例中，用于肉仔鸡的育肥日粮可任选地含有约19-23重量％的粗蛋白含量，诸如19％、20％、21％、22％或23％，其中19％、20％或21％是优选的。
[0071]
另外地或替代性地，“开食”、“生长”和“育肥”可通过代谢能(me)含量来区分，该代谢能通常对于开食日粮是最低的，对于育肥日粮是最高的，其中生长日粮具有两者之间的水平。例如，用于肉仔鸡的开食日粮可具有约3000或3025kcal/kg(
±
50、40、30、20、10、5或更小kcal/kg)的me。在另一个实例中，用于肉仔鸡的生长日粮可具有约3100kcal/kg或3150kcal/kg(
±
50、40、30、20、10、5或更小kcal/kg)的me。在另一个实例中，用于肉仔鸡的生长日粮可具有约3200kcal/kg(
±
50、40、30、20、10、5或更小kcal/kg)的me。
[0072]
本文所述的家禽日粮可以是素食或非素食产品。素食产品不含肉或鱼产品。非素食日粮可含有鱼产品(诸如鱼粉)或肉产品(诸如肉衍生物或其他不含无机磷酸盐的肉产品)中的一种或两种。
[0073]
术语“混合机液体应用(mixer liquid application)”和“mla”在本文中可互换使用，并且是指动物饲料生产，其中热敏化合物(特别是酶)可在调节和制粒之前以液体形式应用于动物饲料并在调节和制粒后在饲料中保持功能。
[0074]
术语“饲料”、“动物饲料”或“日粮”在本文中可互换使用，分别是指旨在或适于被非人动物食用、摄入、消化的任何天然或人工日粮、膳食等或此类膳食的组分。优选地，术语“饲料”用于指在饲养家畜时饲喂动物的产品。
[0075]
如本文所用，“饲料添加剂”是指在营养物中单独或一起使用的一种或多种成分、物质(例如细胞)的产物，例如以改善食物(例如，动物饲料)的质量、改善动物的性能和/或健康和/或增强食物或食物中物质的消化率。
[0076]
如本文所用，术语“食物”以广义使用-并且涵盖用于人的任何形式的食物和食物产品以及用于动物的食物(即饲料)。
[0077]
食物或饲料可以是溶液形式或固体形式，这取决于用途和/或应用模式和/或施用模式。在一些实施例中，本文提及的酶可用作食物或饲料物质或用于食物或饲料物质的制备或生产。
[0078]
如本文所用，术语“食物或饲料成分”包括添加到或可添加到食物或食料中的配制品，并且包括可在各种产品中以低水平使用的配制品。食物成分可以是溶液形式或固体形式，这取决于用途和/或应用模式和/或施用模式。本文所述的酶可用作食物或饲料成分或用于制备或生产。这些酶可添加到或可不添加到食物补充剂中。用于单胃动物的饲料组合
物通常包括包含植物产品的组合物，该植物产品含有植酸盐。此类组合物包括但不限于玉米粉、豆粕、菜籽粕、棉籽粕、玉蜀黍、小麦、大麦和高粱基饲料。
[0079]
如本文所用，术语“制粒”是指可以是固体、圆形、球形和圆柱形片剂的丸粒，特别是饲料丸粒和固体挤出动物饲料的生产。已知饲料制粒制造工艺的一个实例通常包括在室温下将食物或饲料成分混合在一起至少1分钟，将混合物转移到缓冲仓中，将混合物输送到蒸汽调节器(即调节)中，任选地将经蒸汽调节的混合物转移到膨胀器中，将混合物转移到制粒机或挤出机中，最后将丸粒转移至丸粒冷却器中。(fairfield,d.1994.第10章,pelleting cost center.in feed manufacturing technology iv.[制粒成本中心，饲料制造技术iv](mcellhiney编辑),american feed industry association,arlington,va.[美国饲料工业协会，弗吉尼亚州阿灵顿],第110-139页)。
[0080]
术语“丸粒”是指已经受热处理，诸如蒸汽处理(即调节)并通过机器压制或挤出的动物饲料的组合物(通常衍生自谷物)。该丸粒可掺入有液体配制品或干燥配制品的形式的酶。干燥配制品可以是包衣的或未包衣的，并且可以是颗粒形式。术语“颗粒”用于由酶(诸如植酸酶，例如本文公开的任何工程化的植酸酶多肽)和其他化学物质(诸如盐和糖)组成的颗粒，并且可使用多种技术(包括流化床制粒方法以形成层状颗粒)中的任一种形成。
[0081]
与在固体或液体配制品中的确定有关的术语植酸酶活性意指1ftu(植酸酶单位)，其被定义为在37℃、ph 5.5的反应条件下在一分钟内从5.0mm植酸钠底物(来自稻)中释放1微摩尔无机正磷酸盐所需的酶的量，这也在iso 2009植酸酶测定(一种用于确定植酸酶活性的标准测定，见国际标准iso/dis 30024:1-17,2009)中进行了定义。
[0082]
替代性地，如本文所用，一单位的植酸酶(u)可被定义为在孔雀绿测定中在25℃、ph分别为5.5或3.5的反应条件下在一分钟内从0.2mm植酸钠底物(来自稻)中释放1微摩尔无机正磷酸盐的酶的量。
[0083]
如本文所用，术语“比活性”是每毫升酶单位的数目除以以mg/ml为单位的(总)蛋白质浓度(mg/ml)。因此，比活性值通常以单位/mg表示。替代性地，术语“比活性”是每毫升酶单位的数目除以以mg/ml为单位的植酸酶浓度。
[0084]
如本文所用，术语“差示扫描量热法”或“dsc”是一种热分析技术，其中增加样品和参考物温度所需的热量的差异作为温度的函数来测量。在整个实验中，样品和参考物均保持在几乎相同的温度下。通常，dsc分析的温度程序被设计成使得样品架温度作为时间的函数线性增加。参考样品在待扫描的温度范围内应具有明确定义的热容量。
[0085]
术语“益生菌”意指通过选择性地刺激一种或有限数量的有益细菌的生长和/或活性而有益地影响宿主的不可消化的食物成分。
[0086]
如本文所用，术语“直接饲喂微生物”(“dfm”)是活的(有活力的)微生物的来源，当以足够数量应用时可赋予其接受者益处，即益生菌。dfm可包含一种或多种此类微生物，诸如细菌菌株。dfm的类别包括芽孢杆菌、乳酸菌和酵母。因此，术语dfm涵盖以下中的一种或多种：直接饲喂细菌、直接饲喂酵母、直接饲喂酵母以及它们的组合。
[0087]
芽孢杆菌纲(bacilli)是独特的、形成孢子的革兰氏阳性杆菌。这些孢子非常稳定，并且可承受环境条件，诸如热、水分和一定范围的ph。这些孢子当被动物摄取时萌发成有活性的营养细胞，并且可用于粉和丸粒日粮中。乳酸菌是产生对病原体有拮抗作用的乳酸的革兰氏阳性球菌。由于乳酸菌似乎有点热敏感，所以它们不用于丸粒日粮。乳酸菌的种
类包括双歧杆菌(bifidobacterium)、乳杆菌(lactobacillus)和链球菌(streptococcus)。
[0088]
术语“益生菌”、“益生菌培养物”和“dfm”在本文中可互换使用，并定义当例如以足够数量摄取或局部应用时有益地影响宿主生物体(即通过赋予宿主生物体一种或多种可证明的健康益处诸如健康、消化、和/或性能益处)的活微生物(包括例如细菌或酵母)。益生菌可改善一个或多个粘膜表面的微生物平衡。例如，粘膜表面可以是肠、泌尿道、呼吸道或皮肤。如本文所用，术语“益生菌”还涵盖可刺激免疫系统的有益分支并同时减少粘膜表面(例如肠道)中的炎症反应的活微生物。虽然没有益生菌摄入的下限或上限，但已表明，至少10
6-10
12
、优选地至少10
6-10
10
、优选地10
8-109cfu作为日剂量将在受试对象中有效地实现有益的健康效果。
[0089]
如本文所用，术语“cfu”意指“集落形成单位”并且是有活力的细胞的量度，其中集落代表衍生自单个祖细胞的细胞的集合。
[0090]
术语“分离的”意指处于在自然界中不存在的形式的或环境中的物质，并且不反映分离物已被纯化的程度，但表示从天然形式或天然环境中分离或分开。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)至少部分地从与其天然相关的天然存在的成分中的一种或多种或全部中去除的任何物质，包括但不限于任何宿主细胞、酶、工程化的酶、核酸、蛋白质、肽或辅因子；(3)任何相对于自然界中发现的物质经人工改造的物质；或(4)通过增加物质相对于与其天然相关的其他成分的量而修饰的任何物质。术语“分离的核酸分子”、“分离的多核苷酸”、和“分离的核酸片段”将可互换使用并且是指单链或双链的rna或dna的聚合物，任选地含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。dna聚合物形式的分离的核酸分子可由cdna、基因组dna或合成dna的一个或多个片段构成。
[0091]
术语“纯化(purify)”、“纯化的(purified)”和纯化(purification)意指去除不需要的组分、材料污染物、混合物或瑕疵使得基本上纯净或干净。例如，纯化当应用于核酸或多肽时通常表示如通过本领域熟知的分析技术确定的基本上不含其他组分的核酸或多肽(例如，纯化的多肽或多核苷酸在电泳凝胶、色谱洗脱液和/或经受密度梯度离心的介质中形成离散的带)。例如，在电泳凝胶中产生基本上一条带的核酸或多肽是“纯化的”。纯化的核酸或多肽是至少约50％纯的，通常是至少约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约99.5％、约99.6％、约99.7％、约99.8％或更加纯的(例如，基于摩尔的重量百分比)。在相关意义上，当在应用纯化或富集技术之后存在分子浓度的大幅度增加时，组合物中的分子得到富集。术语“富集”是指化合物、多肽、细胞、核酸、氨基酸或其他特定物质或组分以高于起始组合物的相对或绝对浓度存在于组合物中。
[0092]
术语“肽”、“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用，并且是指通过肽键连接在一起的氨基酸的聚合物。“蛋白质”或“多肽”包含氨基酸残基的聚合序列。贯穿本公开使用了遵照iupac-iub生化命名联合委员会(joint commission on biochemical nomenclature)(jcbn)定义的氨基酸的单字母和3字母代码。单字母x是指二十种氨基酸中的任一种。还应当理解，由于遗传密码的简并性，多肽可由多于一种核苷酸序列编码。突变可由亲本氨基酸的单个字母代码命名，随后是位置编号，然后是变体氨基酸的单个字母代码。例如，将在位置87处的甘氨酸(g)突变为丝氨酸(s)表示为“g087s”或“g87s”。当描述修饰时，括号中列出的氨基酸后面的位置指示在该位置处被任何列出的氨基酸取代的列表。例如，6(l，i)意指
位置6可被亮氨酸或异亮氨酸取代。有时，在序列中，将斜线(/)用于定义取代，例如，f/v指示该位置可能有苯丙氨酸或缬氨酸。
[0093]
如本文所用，关于氨基酸残基位置，“对应于”(corresponding to或corresponds to或correspond to)或“对应”是指在蛋白质或肽中所列举位置处的氨基酸残基，或者与蛋白质或肽中所列举的残基类似、同源或等同的氨基酸残基。如本文所用，“对应区域”通常是指相关蛋白质或参考蛋白质中的类似位置。
[0094]
术语“衍生自”和“获得自”不仅是指由所讨论的生物体的菌株生产或可由其生产的蛋白质，而且还指由从此类菌株分离的dna序列编码并在含有此类dna序列的宿主生物体中产生的蛋白质。另外，该术语是指由合成的和/或cdna来源的dna序列编码并且具有所讨论的蛋白质的鉴定特性的蛋白质。
[0095]
术语“氨基酸”是指蛋白质或多肽的基本化学结构单元。本文用于鉴定特定氨基酸的以下缩写可见于表a中。
[0096]
表a.单个字母和三个字母的氨基酸缩写
[0097]
[0098][0099]
本领域普通技术人员将认识到，可对本文公开的氨基酸序列进行修饰，同时保留与所公开的氨基酸序列相关的功能。例如，在本领域中熟知的，导致在给定位点处产生化学等价的氨基酸但不影响所编码蛋白质的功能特性的基因改变是常见的。
[0100]
术语“密码子优化的”，当它指用于转化各种宿主的基因或核酸分子的编码区时，是指改变基因或核酸分子的编码区中的密码子，以反映宿主生物体的典型密码子使用，而不改变dna编码的多肽。
[0101]
如本文所用，术语“转化”是指将核酸分子转移或引入宿主生物体中。核酸分子可作为线性或环状形式的dna引入。核酸分子可以是自主复制的质粒，或者它可整合到生产宿主的基因组中。含有转化核酸的生产宿主被称为“转化的”或“重组的”或“转基因的”生物体或“转化体”。
[0102]
术语“重组”和“工程化的”是指例如通过化学合成或通过经基因工程技术操纵分离的核酸片段来将两个原本分离的核酸序列片段进行人工组合。例如，其中已天然地或通过实验室操纵插入了来自不同分子、来自相同分子的另一部分或人工序列的一个或多个片段或基因的dna，导致在基因中和随后在生物体中引入新序列。术语“重组”、“转基因”、“转化的”、“工程化的”、“基因工程化的”和“经修饰用于外源基因表达”在本文中可互换使用。
[0103]
术语“重组构建体”、“表达构建体”、“重组表达构建体”和“表达盒”在本文中可互换使用。重组构建体包含核酸片段的人工组合，例如，并非一起存在于在自然界中的调控和编码序列。例如，构建体可以包含衍生自不同来源的调控序列和编码序列，或者包含衍生自相同来源但以不同于天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。此类构建体可单独使用或可与载体结合使用。如果使用载体，则载体的选择取决于如本领域技术人员熟知的将用于转化宿主细胞的方法。例如，可使用质粒载体。熟练的技术人员很清楚为了成功转化、选择和繁殖宿主细胞载体上必须存在的遗传元件。熟练的技术人员还将认识到，不同的独立转化事件可能导致不同的表达水平和模式(jones等人,(1985)embo j[欧洲分子生物学学会会刊]4:2411-2418；de almeida等人,(1989)mol gen genetics[分子普通遗传学]218:78-86)，并且因此通常筛选多个事件以获得显示所需表达水平和模式的品系。此类筛选可
programs.[带空位的blast和psi blast是新一代蛋白质数据库搜索程序]nucleic acids res[核酸研究]1997第1组；25(17):3389-402)。使用该信息，可对蛋白质序列进行分组。
[0108]
可使用lasergene生物信息计算包的megalign程序(威斯康星州麦迪逊的dnastar公司(dnastar inc.,madison,wi))、vector nti v.7.0的alignx程序(马里兰州贝塞斯达的informax公司(informax,inc.,bethesda,md))或emboss开放软件包(embl-ebi；rice等人.,trends in genetics[遗传学趋势]16,(6):276-277(2000))进行序列比对和同一性百分比计算。可使用比对的clustal方法(诸如clustalw；例如版本1.83)(higgins和sharp,cabios[生物信息学],5:151-153(1989)；higgins等人.,nucleic acids res.[核酸研究]22:4673-4680(1994)；以及chenna等人.,nucleic acids res[核酸研究]31(13):3497-500(2003)，经由欧洲生物信息学研究所获自欧洲分子生物学实验室)用默认参数来进行序列的多重比对。用于clustalw蛋白质比对的适合参数包括空位存在罚分＝15、空位延伸＝0.2、矩阵＝gonnet(例如，gonnet250)、蛋白质endgap＝-1、蛋白质gapdist＝4并且ktuple＝1。在一个实施例中，快速或慢速比对使用在慢速比对情况下的默认设置。替代性地，可修改使用clustalw方法(例如版本1.83)的参数以同样使用ktuple＝1，空位罚分＝10，空位延伸＝1，矩阵＝blosum(例如，blosum64)，窗口＝5，以及保存的顶部对角线＝5。替代性地，可使用来自版本10.2.4的mafft比对以默认设置、评分矩阵blosum62、空位开放罚分1.53和偏移值0.123)来导出多序列比对。
[0109]
muscle程序(robert c.edgar.muscle:multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput[muscle：高精度和高通量的多序列比对]nucl.acids res.[核酸研究](2004)32(5):1792-1797)是多序列比对算法的另一个实例。
[0110]
图2描绘了系统发生或进化树，基于氨基酸序列的相似性和差异显示了包括工程化的植酸酶多肽及其片段的各种植酸酶之间的相关性。
[0111]
术语“工程化的植酸酶多肽”意指多肽不是天然存在的并且具有植酸酶活性。
[0112]
注意，工程化的植酸酶多肽的片段是工程化的植酸酶多肽的一部分或子序列，其能够像工程化的植酸酶多肽一样起作用，即，其保留了植酸酶活性。
[0113]
术语“载体”是指设计用于将核酸引入一种或多种细胞类型的多核苷酸序列。载体包括但不限于克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌体颗粒、表达盒等。
[0114]
如本文所用，“表达载体”意指包含dna序列的dna构建体，该dna序列可操作地连接到能够在合适的宿主中实现dna表达的合适的控制序列上。此类控制序列可包括实现转录的启动子、控制转录的任选操纵子序列、编码mrna上适合的核糖体结合位点的序列、增强子以及控制转录和翻译终止的序列。
[0115]
如本文所用，术语“表达”是指前体抑或成熟形式的功能性终产物(例如，mrna或蛋白质)的产生。表达也可指将mrna翻译成多肽。
[0116]
基因的表达涉及基因的转录和mrna翻译成前体或成熟蛋白质。“成熟”蛋白质是指经翻译后加工的多肽；即初级翻译产物中存在的任何信号序列、原肽(prepeptide)或前肽(propeptide)已被去除的多肽。“前体”蛋白质是指mrna翻译的初级产物；即仍然存在原肽和前肽。前肽和原肽可以是但不限于细胞内定位信号。“稳定转化”是指将核酸片段转移到宿主生物体的基因组中，包括细胞核的和细胞器两者的基因组，从而导致遗传稳定的遗传。相比之下，“瞬时转化”是指将核酸片段转移到宿主生物体的细胞核中或含有dna的细胞器
中，从而导致基因表达而无整合或稳定的遗传。
[0117]
因此，在一个实施例中，描述了一种重组构建体，该重组构建体包含在生产宿主中起作用的调控序列，该调控序列与编码如本文所述的工程化的植酸酶多肽及其片段的核苷酸序列可操作地连接。
[0118]
该重组构建体可包含在生产宿主中起作用的调控序列，该调控序列与编码本文所述的任何工程化的植酸酶多肽及其片段的核苷酸序列可操作地连接。此外，生产宿主选自由细菌、真菌、酵母、植物或藻类组成的组。优选的生产宿主是丝状真菌里氏木霉。
[0119]
替代性地，使用如chong,curr protoc mol biol.[最新分子生物学实验方法汇编]2014；108:16.30.1-16.30.11中所述的无细胞蛋白质合成是可能的。
[0120]
本文还描述了一种用于生产工程化的植酸酶多肽或其片段的方法，该方法包括：
[0121]
(a)用本文所述的重组构建体转化生产宿主；以及
[0122]
(b)在产生工程化的植酸酶多肽或其片段的条件下培养步骤(a)的生产宿主。
[0123]
任选地，可从生产宿主中回收工程化的植酸酶多肽或其片段。
[0124]
在另一方面，可通过本文所公开的方法中的任一种获得含有植酸酶的培养物上清液。
[0125]
在另一个实施例中，描述了编码如本文所述的工程化的植酸酶多肽或其片段中的任一种的多核苷酸序列。
[0126]
可包括在表达载体中的可能的起始控制区或启动子是众多的并且是本领域技术人员所熟悉的。“组成型启动子”是一种在大多数环境和发育条件下具有活性的启动子。“诱导型”或“阻抑型”启动子是指在环境或发育调控下具有活性的启动子。在一些实施例中，由于环境因素的变化，启动子是诱导型或阻抑型的，这些环境因素包括但不限于如在本领域中已知的碳、氮或其他营养物可用性、温度、ph、渗透压、一种或多种重金属的存在、一种或多种抑制剂的浓度、压力或前述因素的组合。在一些实施例中，诱导型或阻抑型启动子可被代谢因子诱导或阻抑，诸如如在本领域中已知的某些碳来源的水平、某些能量来源的水平、某些分解代谢物的水平、或前述因素的组合。
[0127]
在一个实施例中，启动子是宿主细胞的天然启动子。例如，在一些情况下，当里氏木霉是宿主时，启动子可以是天然的里氏木霉启动子，诸如在genbank中以登录号d86235保藏的cbh1启动子。可用于真菌表达的启动子的其他合适的非限制性实例包括cbh2、egl1、egl2、egl3、egl4、egl5、xyn1和xyn2、产黄青霉菌(p.chrysogenus)的阻抑型酸性磷酸酶基因(phoa)启动子(参见例如，graessle等人,(1997)appl.environ.microbiol.[应用与环境微生物学],63:753-756)、葡萄糖阻抑型pck1启动子(参见例如，leuker等人,(1997),gene[基因],192:235-240)、麦芽糖诱导型葡萄糖阻抑型met3启动子(参见liu等人,(2006),eukary.cell[细胞],5:638-649)、pki启动子和cpc1启动子。有用启动子的其他实例包括来自泡盛曲霉(a.awamori)和黑曲霉(a.niger)葡糖淀粉酶基因的启动子(参见例如，nunberg等人,(1984)mol.cell biol.[分子与细胞生物学]15 4:2306-2315和boel等人.,(1984)embo j.[欧洲分子生物学学会会刊]3:1581-1585)。此外，里氏木霉xln1基因的启动子可能是有用的(参见例如，epa 137280al)。
[0128]
控制转录终止的dna片段也可以衍生自优选的生产宿主细胞的各种天然基因。在某些实施例中，包括终止控制区是任选的。在某些实施例中，表达载体包括衍生自优选的宿
tris，ph 7.4；1mm edta)或10mm mops(ph 6.0)缓冲液(吗啉丙磺酸)和聚乙二醇(peg)。据信，聚乙二醇起到融合细胞膜的作用，从而允许培养基的内容物被递送到木霉属物种菌株的细胞质中，并且将质粒dna转移到细胞核中。这种融合经常留下整合到宿主染色体中的质粒dna的多个拷贝。
[0137]
通常在转化中使用含有已以105至107/ml、优选地2
×
106/ml的密度经受渗透性处理的木霉属物种原生质体或细胞的悬浮液。将100μl体积的这些原生质体或细胞在适当的溶液(例如，1.2m山梨糖醇；50mm cacl2)中与期望的dna混合。通常，向摄取溶液中添加高浓度的peg。可向原生质体悬浮液中添加0.1至1倍体积的25％peg 4000。然而，向原生质体悬浮液中添加约0.25倍体积是优选的。也可将添加剂诸如二甲亚砜、肝素、亚精胺、氯化钾等添加到摄取溶液中并帮助转化。类似的程序可用于其他真菌宿主细胞。(参见，例如美国专利号6,022,725和6,268,328，其两者通过援引并入本文)。
[0138]
优选地，用载体系统构建了遗传稳定的转化体，由此编码植酸酶多肽或其片段的核酸被稳定整合到宿主菌株染色体中。然后通过已知技术纯化转化体。
[0139]
将表达载体引入细胞后，在有利于在启动子序列控制下的基因表达的条件下培养转染或转化的细胞。
[0140]
通常，细胞在含有生理盐和营养物的标准培养基中培养(参见例如，pourquie,j.等人,biochemistry and genetics of cellulose degradation[纤维素降解的生物化学和遗传学],aubert,j.p.等人编辑,academic press[学术出版社],第71-86页,1988以及iimen,m.等人,(1997)appl.environ.microbiol.[应用与环境微生物学]63:1298-1306)。常见的商业制备的培养基(例如，酵母麦芽提取物(ym)肉汤、卢里亚-贝尔塔尼(luria bertani，lb)肉汤和沙氏葡萄糖(sabouraud dextrose，sd)肉汤也可用于本发明。
[0141]
培养条件也是标准的(例如，将培养物在大约28℃下在适当的培养基中在振荡培养或发酵罐中孵育，直到达到期望的植酸酶表达水平)。给定丝状真菌的优选培养条件是本领域已知的，并且可在科学文献中和/或从真菌的来源诸如美国典型培养物保藏中心(american type culture collection)和真菌基因种源中心(fungal genetics stock center)中找到。
[0142]
在真菌生长已建立后，将细胞暴露于有效引起或允许植酸酶并且特别是如本文所定义的植酸酶表达的条件下。在植酸酶编码序列在诱导型启动子的控制下的情况中，将诱导剂(例如糖、金属盐或抗微生物剂)以有效诱导植酸酶表达的浓度添加到培养基中。可使用从宿主细胞分泌的工程化的植酸酶多肽或其片段作为全肉汤配制品，只需最少的生产后处理。
[0143]
可使用本领域已知的任何培养方法来实现重组微生物的用过的全发酵液的制备，从而导致工程化的植酸酶多肽或其片段的表达。
[0144]
术语“用过的全发酵液”在本文中被定义为包括培养基、细胞外蛋白质(例如，酶)和细胞生物质的发酵材料的未分级内容物。应当理解，术语“用过的全发酵液”还涵盖已使用本领域熟知的方法裂解或透化的细胞生物质。
[0145]
发酵后，获得发酵液，通过常规分离技术去除微生物细胞和各种悬浮固体(包括残留的粗发酵材料)，以便获得植酸酶溶液。通常使用过滤、离心、微滤、旋转真空鼓式过滤、超滤、离心后超滤、萃取或色谱法等。
[0146]
有可能任选地从生产宿主中回收期望的蛋白质。在另一方面，通过使用本领域技术人员已知的任何方法获得含有培养物上清液的工程化的植酸酶多肽或其片段。
[0147]
这些技术的实例包括但不限于亲和色谱法(tilbeurgh等人,(1984)febs lett.[欧洲生化学会联合会快报]16:215)、离子交换色谱方法(goyal等人,(1991)biores.technol.[生物资源技术]36:37；fliess等人,(1983)eur.j.appl.microbiol.biotechnol.[欧洲应用微生物学与生物技术杂志]17:314；bhikhabhai等人,(1984)j.appl.biochem.[应用生物化学杂志]6:336；以及ellouz等人,(1987)chromatography[色谱法]396:307)，包括使用具有高分辨率能力的材料的离子交换(medve等人,(1998)j.chromatography a[色谱法期刊a]808:153)、疏水相互作用色谱(参见，tomaz和queiroz,(1999)j.chromatography a[色谱法期刊a]865:123)；两相分配(参见，brumbauer等人,(1999)bioseparation[生物分离]7:287)；乙醇沉淀；反相hplc、硅胶或阳离子交换树脂色谱法诸如deae、色谱聚焦、sds-page、硫酸铵沉淀和凝胶过滤(例如，sephadex g-75)。期望的纯化程度将根据工程化的植酸酶多肽或其片段的用途而变化。在一些实施例中，纯化将不是必需的。
[0148]
另一方面，可能需要浓缩含有工程化的植酸酶多肽或其片段的溶液以便优化回收率。使用未浓缩的溶液需要增加孵育时间以便收集经富集或纯化的酶沉淀物。使用常规浓缩技术浓缩含酶溶液，直至获得期望的酶水平。含酶溶液的浓缩可通过在本文中所讨论的技术中的任一种来实现。富集和纯化的示例性方法包括但不限于旋转真空过滤和/或超滤。
[0149]
另外，可使用例如沉淀剂(诸如金属卤化物沉淀剂)来进行期望蛋白质产物的浓缩。金属卤化物沉淀剂氯化钠也可用作防腐剂。金属卤化物沉淀剂以有效沉淀工程化的植酸酶多肽或其片段的量使用。常规测试后，选择至少有效量和最佳量的金属卤化物以有效引起酶的沉淀，以及用于使回收最大化的沉淀条件，包括孵育时间、ph、温度和酶浓度，对于本领域普通技术人员来说将是显而易见的。通常，向浓缩的酶溶液中添加至少约5％w/v(重量/体积)至约25％w/v的金属卤化物，并且通常为至少8％w/v。
[0150]
沉淀酶的另一种替代方式是使用有机化合物。示例性有机化合物沉淀剂包括：4-羟基苯甲酸、4-羟基苯甲酸的碱金属盐、4-羟基苯甲酸的烷基酯、以及这些有机化合物中的两种或更多种的共混物。有机化合物沉淀剂的添加可在添加金属卤化物沉淀剂之前、与之同时或之后进行，并且两种沉淀剂、有机化合物和金属卤化物的添加可依次或同时进行。通常，有机沉淀剂选自由以下组成的组：4-羟基苯甲酸的碱金属盐(诸如钠盐或钾盐)，和4-羟基苯甲酸的直链或支链烷基酯，其中该烷基基团含有1至12个碳原子，以及这些有机化合物中的两种或更多种的共混物。另外的有机化合物还包括但不限于4-羟基苯甲酸甲酯(称为对羟基苯甲酸甲酯)、4-羟基苯甲酸丙酯(称为对羟基苯甲酸丙酯)。对于进一步的描述，参见例如美国专利号5,281,526。有机化合物沉淀剂的添加提供了沉淀条件在ph、温度、浓度、沉淀剂、蛋白质浓度和孵育时间方面的高度灵活性的优点。通常，向浓缩的酶溶液中添加至少约0.01％w/v且不超过约0.3％w/v的有机化合物沉淀剂。
[0151]
孵育期后，经富集或纯化的酶然后与解离的色素和其他杂质分离，并通过常规分离技术诸如过滤、离心、微滤、旋转真空过滤、超滤、压滤、交叉膜微滤、交叉流膜微滤等收集。通过用水洗涤沉淀物可获得酶沉淀物的进一步富集或纯化。例如，用含有金属卤化物沉淀剂的水、或用含有金属卤化物和有机化合物沉淀剂的水洗涤经富集或纯化的酶沉淀物。
[0152]
有时从表达宿主中缺失基因是有利的，其中基因缺陷可通过表达载体治愈。在需要获得具有一种或多种灭活基因的真菌宿主细胞的情况下，可使用已知的方法(例如，公开于美国专利号5,246,853、美国专利号5,475,101、和wo 92/06209中的方法)。可通过完全或部分缺失、通过插入失活或通过使基因对其预期目的不起作用的任何其他方式(使得阻止基因表达功能性蛋白)来完成基因灭活。
[0153]
来自木霉属物种或其他丝状真菌宿主的任何已被克隆的基因均可被缺失，例如cbh1、cbh2、egl1和egl2基因。在一些实施例中，基因缺失可通过本领域已知的方法将待灭活的期望基因的形式插入质粒来完成。然后在期望基因编码区内部，在一个或多个适当的限制性酶位点处切割缺失质粒，并用选择性标记替换该基因编码序列或其部分。来自待缺失的基因的基因座的侧翼dna序列(优选地在约0.5至2.0kb之间)保留在标记基因的任一侧。适当的缺失质粒将通常具有存在于其中的独特的限制性酶位点，使得含有缺失基因的片段(包括侧翼dna序列)和选择性标记基因能够作为单个线性片被去除。
[0154]
根据所用的宿主细胞，可进行转录后和/或翻译后修饰。转录后和/或翻译后修饰的一个非限制性实例是多肽的“剪切”或“截短”。在另一种情况下，这种剪切可导致获得成熟植酸酶多肽并且进一步去除n或c-末端氨基酸以产生保留酶促活性的截短形式的植酸酶。
[0155]
转录后或翻译后修饰的其他实例包括但不限于肉豆蔻酰化、糖基化、截短、脂化、以及酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸磷酸化。本领域技术人员将认识到蛋白质可能经历的转录后或翻译后修饰的类型可能取决于表达该蛋白质的宿主生物体。
[0156]
多肽在表达后可能发生进一步的序列修饰。这包括但不限于氧化、去糖基化、糖化等。已知当与葡萄糖或其他还原糖一起孵育时，特别是在高于30℃的温度和中性或碱性ph下，糖化可影响植酸酶的活性。消除赖氨酸残基的蛋白质工程化可用于防止此类修饰。这样的实例可见于us 8,507,240中。例如，酵母表达可产生高度糖基化的多肽，从而导致分子量明显增加。另外，国际公开日期为2013年8月15日的wo 2013/119470(通过援引并入本文)涉及具有增加的稳定性(据信这是由于糖基化增加)的植酸酶。
[0157]
如本文所用，术语“糖基化”是指聚糖与分子例如蛋白质的附接。糖基化可以是酶促反应。附接可通过共价键形成。短语“高度糖基化的”是指分子(诸如酶)在许多位点和所有或几乎所有可用的糖基化位点(例如n-连接的糖基化位点)处被糖基化。替代性地或除此之外，短语“高度糖基化的”可指在所有或基本上所有n-连接的糖基化位点处的广泛的糖酵解分支(诸如，与特定n-连接的糖基化位点相关的糖分解部分的大小和数量)。在一些实施例中，工程化的植酸酶多肽在所有或基本上所有共有序列n-连接的糖基化位点(即nxs/t共有序列n-连接糖基化位点)处被糖基化。
[0158]
如本文所用，术语“聚糖”是指多糖或寡糖，或糖缀合物(诸如糖蛋白)的碳水化合物部分。聚糖可以是单糖残基的均聚物或杂聚物。它们可以是直链或支链分子。
[0159]
植酸酶可具有不同程度的糖基化。已知此类糖基化可提高在储存和应用期间的稳定性。广泛的
[0160]
本文公开的任何工程化的植酸酶多肽或其片段的活性可如上所讨论进行确定。
[0161]
据信将稳健的工程化的植酸酶多肽或其片段以液体形式应用到饲料中与应用包衣颗粒形式的此类植酸酶相比是有益的。这种包衣颗粒是目前制造适于高温调节和制粒的
植酸酶产品的商业方法。稳健的酶的液体应用的益处包括；1)动物摄取后，酶将立即开始起作用，因为酶在与饲料相互作用之前不必从包衣颗粒中释放出来，2)酶在整个饲料中的分布得到改善，因此确保了酶向动物更一致的递送，这对进食少量饲料的幼小动物尤其重要，3)在饲料中的均匀分布使得更容易测量饲料中的酶，以及4)在稳健的植酸酶的情况下(诸如本文公开的工程化的植酸酶多肽和片段)，它可开始降解饲料中已存在的植酸盐。
[0162]
换句话说，新型工程化的植酸酶多肽及其片段非常稳健，以至于在调节和制粒之前不需要特殊的包衣或配制来将其应用于饲料，因为它们已被工程化以承受在工业饲料生产中所使用的调节和制粒的压力。因此，本文所述的新型工程化的植酸酶多肽及其片段的稳健性使得它们可以未包衣的颗粒(granule或particle)的形式或当置于液体中时可以未包衣和未保护的形式应用。
[0163]
应当指出，工程化的植酸酶多肽及其片段可在固体载剂上廉价地配制而不特别需要保护性包衣，并且在整个调节和制粒过程中仍保持活性。当其中使用苛刻条件的某些区域需要或如果条件允许(例如在高于90℃的超调节饲料的情况下)时，以固体形式应用时提供附加热稳定性的保护性包衣对于获得制粒稳定性可能是有益的。
[0164]
所公开的工程化的植酸酶多肽或其片段是使用蛋白质工程领域中已知的方法和技术的组合衍生的，该方法和技术包括系统发育分析、位点评估文库、组合文库、高通量筛选和统计分析。
[0165]
在一方面，本公开涉及一种还与seq id no:1的氨基酸序列具有至少82％序列同一性的工程化的植酸酶多肽或其片段。
[0166]
本领域技术人员将理解，此类至少82％序列同一性还包括82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
[0167]
本领域技术人员将理解，此类至少79％序列同一性还包括79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
[0168]
还可提及以下内容，因为在一些实施例中，提供了：
[0169]
a)一种还与seq id no:2、3、8、10、12、18、19、24、26、27、28、30、31、32、33、和/或36的氨基酸序列具有至少81％(诸如81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的工程化的植酸酶多肽或其片段。
[0170]
b)一种还与seq id no:1、4、5、7、9、11、14、15、17、21、25、34、和/或35的氨基酸序列具有至少82％(诸如82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的工程化的植酸酶多肽或其片段；
[0171]
c)一种还与seq id no:13的氨基酸序列具有至少83％(诸如，83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的工程化的植酸酶多肽或其片段；
[0172]
d)一种还与seq id no:6和/或22的氨基酸序列具有至少79％(诸如，79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的工程化的植酸酶多肽或其片段；和/或
[0173]
e)一种还与seq id no:16、20、23、29、和/或37的氨基酸序列具有至少80％(诸如，80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的工程化的植酸酶多肽或其片段。
[0174]
在进一步的方面，多肽包含工程化的植酸酶多肽的核心结构域或者是工程化的植酸酶多肽的核心结构域片段。“核心结构域片段”在本文中被定义为从多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个氨基酸的多肽。如本文所用，短语“核心结构域”是指涵盖维持多肽的结构和功能(诸如植酸水解)所必需的氨基酸的多肽区域。核心结构域中的氨基酸可被进一步修饰以提高在各种条件下(诸如但不限于ph)的热稳定性或催化活性。在一些非限制性实施例中，本文公开的工程化的植酸酶多肽或其片段的核心结构域对应于seq id no:1的氨基酸位置14-325。在其他非限制性实施例中，核心结构域对应于seq id no:1的氨基酸位置13-326、12-327、11-328、10-329、9-330、8-331、7-332、6-333、5-334、4-335、3-336、2-337或1-338。在其他实施例中，核心结构域的n-末端对应于seq id no:1的氨基酸位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或25，并且核心结构域的c-末端对应于seq id no:1的氨基酸位置315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、或413。
[0175]
因此，本文还提供了：
[0176]
f)一种与seq id no:6的氨基酸14-325具有至少78％(诸如，78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的工程化的植酸酶多肽或其核心结构域片段，其中所述氨基酸位置对应于seq id no:1的氨基酸位置；
[0177]
g)一种与seq id no:2、8、27和/或37的氨基酸14-325具有至少79％(诸如，79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的工程化的植酸酶多肽或其核心结构域片段，其中所述氨基酸位置对应于seq id no:1的氨基酸位置；
[0178]
h)一种与seq id no:3、10、12、18、25、26、28、30、32和/或35的氨基酸14-325具有至少81％(诸如，81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的工程化的植酸酶多肽或其核心结构域片段，其中所述氨基酸位置对应于seq id no:1的氨基酸位置；
[0179]
i)一种与seq id no:1、4、5、7、9、11、13-17、21、22、31、33、34和/或36的氨基酸14-325具有至少82％(诸如，82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的工程化的植酸酶多肽或其核心结构域片段，其中所述氨基酸位置对应于seq id no:1的氨基酸位置；
[0180]
j)一种与seq id no:19、20、23和/或24的氨基酸14-325具有至少83％(诸如，83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的工程化的植酸酶多肽或其核心结构域片段，其中所述氨
基酸位置对应于seq id no:1的氨基酸位置；和/或
[0181]
k)一种与seq id no:29的氨基酸14-325具有至少84％(诸如，84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的工程化的植酸酶多肽或其核心结构域片段，其中所述氨基酸位置对应于seq id no:1的氨基酸位置。
[0182]
在另一方面，本文公开的工程化的多肽或其片段中的任一种在ph3.5下包含至少约100u/mg的比活性。比活性范围(u/mg，在ph 3.5下)包括但不限于约100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000、1025、1050、1075、2000等。
[0183]
在另一方面，本文公开的工程化的多肽或其片段中的一些工程化的多肽或其片段在ph 5.5下包含至少约100u/mg的比活性。比活性范围(u/mg，在ph 5.5下)包括但不限于约100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000、1025、1050、1075、2000等。
[0184]
在仍另一方面，本文公开的工程化的植酸酶多肽或其片段中的任一种可在约3.0或更低的ph下以液体形式稳定。这在本文所述的工程化的植酸酶多肽或其片段通过动物消化道时十分相关，如下所讨论的。
[0185]
在另一个实施例中，描述了包含本文所述的工程化植酸酶多肽或其片段中的任一种的不含无机磷酸盐的日粮。
[0186]
重要的是，饲料添加剂酶(例如植酸酶)在通过动物消化道时经受非常苛刻的条件，即低ph和消化酶的存在。胃蛋白酶是单胃动物胃肠道中存在的最重要的蛋白水解消化酶之一。胃蛋白酶在酸性区域具有低特异性和高ph耐受性(ph 1.5-6.0稳定直至ph 8.0)。本文所述的工程化的植酸酶多肽或其片段在很大程度上耐受胃蛋白酶，而胃蛋白酶对于良好的体内性能是必需的。
[0187]
包含本文所述的工程化的植酸酶多肽或其片段中的任一种的不含无机磷酸盐的日粮可(i)单独使用或(ii)与包含至少一种细菌菌株的直接饲喂微生物组合使用或(iii)与至少一种其他酶组合使用或(iv)与包含至少一种细菌菌株的直接饲喂微生物和至少一种其他酶组合使用，或(v)(i)、(ii)、(iii)或(iv)中的任一种进一步包含至少一种其他饲料添加剂组分，并且任选地，工程化的植酸酶多肽或其片段以至少0.1g/吨饲料(诸如至少约0.1g/吨、0.2g/吨、0.3g/吨、0.4g/吨、0.5g/吨、0.6g/吨、0.7g/吨、0.8g/吨、0.9g/吨、1g/吨、1.1g/吨、1.2g/吨、1.3g/吨、1.4g/吨、1.5g/吨、1.6g/吨、1.7g/吨、1.8g/吨、1.9g/吨、2g/吨、2.1g/吨、2.2g/吨、2.3g/吨、2.4g/吨、2.5g/吨、2.6g/吨、2.7g/吨、2.8g/吨、2.9g/吨、3g/吨或更多)的量存在。
[0188]
在一些非限制性实施例中，植酸酶以约200ftu/kg至约1000ftu/kg饲料、更优选地约300ftu/kg饲料至约750ftu/kg饲料、更优选地约400ftu/kg饲料至约500ftu/kg饲料的范围存在于日粮中。在一个实施例中，植酸酶以超过约200ftu/kg饲料、合适地超过约300ftu/kg饲料、合适地超过约400ftu/kg饲料的量存在于喂养料中。在一个实施例中，植酸酶以少于约1000ftu/kg饲料、合适地少于约750ftu/kg饲料的量存在于喂养料中。在一些实施例
biochemistry and molecular biology)命名委员会的酶命名法-推荐(enzyme nomenclature—recommendations)(1992)-isbn 0-12-226164-3中提供的分类，其通过援引并入本文。
[0199]
在另一个实施例中，该木聚糖酶可以是来自芽孢杆菌属、木霉属(trichodermna)、嗜热真菌属(therinomyces)、曲霉属、腐质霉属和青霉属的木聚糖酶。在另一个实施例中，该木聚糖酶可以是axtra或avizyme 中的木聚糖酶，两者都是可从丹尼斯科公司(danisco a/s)商购获得的产品。在一个实施例中，木聚糖酶可以是两种或更多种木聚糖酶的混合物。在另一个实施例中，木聚糖酶是内切-1,4-β-木聚糖酶或1,4-β-木糖苷酶。
[0200]
在一个实施例中，本公开涉及包含本文公开的工程化的植酸酶多肽或其片段中的任一种和木聚糖酶的不含无机磷酸盐的日粮。在一个实施例中，该不含无机磷酸盐的日粮包含10-50、50-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-750和大于750的木聚糖酶单位/g组合物。
[0201]
在一个实施例中，该不含无机磷酸盐的日粮包含500-1000、1000-1500、1500-2000、2000-2500、2500-3000、3000-3500、3500-4000、4000-4500、4500-5000、5000-5500、5500-6000、6000-6500、6500-7000、7000-7500、7500-8000和大于8000的木聚糖酶单位/g组合物。
[0202]
应当理解，一个木聚糖酶单位(xu)是在ph 5.3和50℃下每分钟从燕麦木聚糖(oat-spelt-xylan)底物中释放0.5μmol还原糖当量(通过二硝基水杨酸(dns)测定-还原糖方法以木糖计)的酶的量。(bailey等人,journal of biotechnology[生物技术杂志],第23卷,(3),1992年5月,257-270)。
[0203]
淀粉酶是一类能够将淀粉水解为较短链的寡糖(诸如麦芽糖)的酶。然后与从原始的淀粉分子转移相比，葡萄糖部分可更容易地从麦芽糖转移到单甘油酯或糖基单甘油酯。术语淀粉酶包括α-淀粉酶(e.g.3.2.1.1)、g4形成淀粉酶(e.g.3.2.1.60)、β-淀粉酶(e.g.3.2.1.2)和γ-淀粉酶(e.c.3.2.1.3)。淀粉酶可以是细菌或真菌来源的，或是化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。
[0204]
在一个实施例中，淀粉酶可以是两种或更多种淀粉酶的混合物。在另一个实施例中，淀粉酶可以是来自地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)的淀粉酶(例如α-淀粉酶)和来自解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)的淀粉酶(例如α-淀粉酶)。在一个实施例中，α-淀粉酶可以是axtra或avizyme中的α-淀粉酶，两者都是可从丹尼斯科公司商购获得的产品。在另一个实施例中，淀粉酶可以是抗胃蛋白酶α-淀粉酶，诸如抗胃蛋白酶木霉属(诸如里氏木霉)α淀粉酶。在英国申请号101 1513.7(其通过援引并入本文)和pct/ib2011/053018(其通过援引并入本文)中传授了一种合适的抗胃蛋白酶α-淀粉酶。
[0205]
应当理解，一个淀粉酶单位(au)是在ph 6.5和37℃下每分钟从非水溶性交联淀粉聚合物底物中释放1mmol糖苷键的酶的量。(这在本文中可被称为用于确定1au的测定)。
[0206]
在一个实施例中，本公开涉及包含本文公开的工程化植酸酶多肽或其片段中的任一种和淀粉酶的不含无机磷酸盐的日粮。在一个实施例中，本公开涉及包含本文公开的工程化植酸酶多肽或其片段中的任一种、木聚糖酶和淀粉酶的不含无机磷酸盐的日粮。在一
9500、9500-10000、10000-11000、11000-12000、12000-13000、13000-14000、14000-15000和大于15000的蛋白酶单位/g组合物。
[0216]
在其他实施例中，相对于国家研究委员会(nrc)或肉鸡饲养者推荐的那些，日粮可具有降低的(诸如显著降低的)无机磷酸盐水平。在一些实施例中，日粮含有相对于国家研究委员会(nrc)或肉鸡饲养者所推荐水平的0.2％至约75％的无机磷酸盐水平，诸如相对于国家研究委员会(nrc)或肉鸡饲养者所推荐的水平(诸如以下实例部分中讨论的推荐水平)的约0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％或75％中的任一种的无机磷酸盐水平。
[0217]
至少一种直接饲喂微生物(dfm)可包含至少一种有活力的微生物，诸如有活力的细菌菌株或有活力的酵母或有活力的真菌。优选地，dfm包含至少一种有活力的细菌。
[0218]
有可能dfm可以是形成孢子的细菌菌株，因此术语dfm可由孢子构成或含有孢子，例如细菌孢子。因此，如本文所用，术语“有活力的微生物”可包括微生物孢子，诸如内生孢子或分生孢子。替代性地，本文所述的饲料添加剂组合物中的dfm可不由微生物孢子构成或不含有微生物孢子，例如内生孢子或分生孢子。
[0219]
微生物可以是天然存在的微生物，或者其也可以是转化的微生物。
[0220]
如本文所述的dfm可包含来自一种或多种以下属的微生物：乳杆菌属、乳球菌属(lactococcus)、链球菌属(streptococcus)、芽孢杆菌属、片球菌属(pediococcus)、肠球菌属(enterococcus)、明串珠菌属(leuconostoc)、肉食杆菌属(carnobacterium)、丙酸杆菌属(propionibacterium)、双歧杆菌属、梭菌属和巨球菌属(megasphaera)以及它们的组合。
[0221]
优选地，dfm包含一种或多种选自以下芽孢杆菌属物种的细菌菌株：枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、蜡状芽孢杆菌(bacillus cereus)、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌(bacillus pumilis)和解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)。
[0222]
如本文所用，“芽孢杆菌属”包括如本领域技术人员已知的“芽孢杆菌属”内的所有物种，包括但不限于枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌(b.lentus)、短芽孢杆菌(b.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(b.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(b.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌(b.clausii)、耐盐芽孢杆菌(b.halodurans)、巨大芽孢杆菌(b.megaterium)、凝结芽孢杆菌(b.coagulans)、环状芽孢杆菌(b.circulans)、吉氏芽孢杆菌(b.gibsonii)、短小芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌(b.thuringiensis)。应认识到，芽孢杆菌属继续经历分类学上的重组。因此，该属旨在包括已被重新分类的物种，包括但不限于诸如嗜热脂肪芽孢杆菌(现在被命名为“嗜热脂肪地芽孢杆菌”)或多粘芽孢杆菌(bacillus polymyxa)(现在被命名为“多粘类芽孢杆菌(paenibacillus polymyxa)”)的生物体。在压力环境条件下产生抗性内生孢子被认为是芽孢杆菌属的决定性特征，尽管该特性也适用于最近命名的脂环酸芽孢杆菌属(alicyclobacillus)、双芽孢杆菌属(amphibacillus)、解硫胺素芽孢杆菌属(aneurinibacillus)、厌氧芽孢杆菌属(anoxybacillus)、短芽孢杆菌属(brevibacillus)、
线芽孢杆菌属(filobacillus)、薄壁芽孢杆菌属(gracilibacillus)、喜盐芽孢杆菌属(halobacillus)、类芽孢杆菌属(paenibacillus)、需盐芽孢杆菌属(salibacillus)、耐热芽孢杆菌属(thermobacillus)、脲芽孢杆菌属(ureibacillus)和枝芽孢杆菌属(virgibacillus)。
[0223]
在另一方面，dfm可进一步与以下乳球菌属物种组合：乳脂乳球菌(lactococcus cremoris)和乳酸乳球菌(lactococcus lactis)以及它们的组合。
[0224]
dfm可进一步与以下乳杆菌属物种组合：布氏乳杆菌(lactobacillus buchneri)、嗜酸乳杆菌(lactobacillus acidophilus)、干酪乳杆菌(lactobacillus casei)、开菲尔乳杆菌(lactobacillus kefiri)、双叉乳杆菌(lactobacillus bifidus)、短乳杆菌(lactobacillus brevis)、瑞士乳杆菌(lactobacillus helveticus)、副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)、鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)、唾液乳杆菌(lactobacillus salivarius)、弯曲乳杆菌(lactobacillus curvatus)、保加利亚乳杆菌(lactobacillus bulgaricus)、清酒乳杆菌(lactobacillus sakei)、罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)、发酵乳杆菌(lactobacillus reuteri)、香肠乳杆菌(lactobacillus farciminis)、乳酸乳杆菌(lactobacillus lactis)、德氏乳杆菌(lactobacillus delbreuckii)、植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)、类植物乳杆菌(lactobacillus paraplantarum)、香肠乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、卷曲乳杆菌(lactobacillus crispatus)、加氏乳杆菌(lactobacillus gasseri)、约氏乳杆菌(lactobacillus johnsonii)和詹氏乳杆菌(lactobacillus jensenii)、以及它们的任何组合。
[0225]
在另一方面，dfm可进一步与以下双歧杆菌属物种组合：乳酸双歧杆菌(bifidobacterium lactis)、两歧双歧杆菌(bifidobacterium bifidium)、长双歧杆菌(bifidobacterium longum)、动物双歧杆菌(bifidobacterium animalis)、短双歧杆菌(bifidobacterium breve)、婴儿双歧杆菌(bifidobacterium infantis)、链状双歧杆菌(bifidobacterium catenulatum)、假小链双歧杆菌(bifidobacterium pseudocatenulatum)、青春双歧杆菌(bifidobacterium adolescentis)和角双歧杆菌(bifidobacterium angulatum)、以及它们的任何组合。
[0226]
可提及以下物种的细菌：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、肠球菌、肠球菌属物种和片球菌属物种、乳杆菌属物种、双歧杆菌属物种、嗜酸乳杆菌、乳酸片球菌(pediococsus acidilactici)、乳酸乳球菌、两歧双歧杆菌、枯草芽孢杆菌、特氏丙酸杆菌(propionibacterium thoenii)、香肠乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、埃氏巨球形菌(megasphaera elsdenii)、丁酸梭菌(clostridium butyricum)、动物双歧杆菌动物亚种(bifidobacterium animalis ssp.animalis)、罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)、蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)、唾液乳杆菌唾液亚种(lactobacillus salivarius ssp.salivarius)、丙酸杆菌物种以及它们的组合。
[0227]
本文所述的包含一种或多种细菌菌株的直接饲喂微生物可以是同一类型(属、种和菌株)，或者可包含属、种和/或菌株的混合物。
[0228]
替代性地，dfm可与wo 2012110778中公开的一种或多种产品或这些产品中包含的微生物组合，并且总结如下：枯草芽孢杆菌菌株2084登录号nrrlb-50013、枯草芽孢杆菌菌
株lssao1登录号nrrl b-50104和枯草芽孢杆菌菌株15a-p4 atcc登录号pta-6507(来自enviva 以前称为)；枯草芽孢杆菌菌株c3102(来自)；枯草芽孢杆菌菌株pb6(来自)；短小芽孢杆菌(8g-134)；肠球菌ncimb 10415(sf68)(来自)；枯草芽孢杆菌菌株c3102(来自和)；地衣芽孢杆菌(来自)；肠球菌和片球菌(来自poultry)；乳杆菌、双歧杆菌和/或肠球菌(来自)；枯草芽孢杆菌菌株qst 713(来自)；解淀粉芽孢杆菌cect-5940(来自和plus)；屎肠球菌(enterococcus faecium)sf68(来自)；枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌(来自)；乳酸菌7屎肠球菌(来自)；芽孢杆菌菌株(来自)；酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)(来自)；肠球菌(来自biomin)；乳酸片球菌、肠球菌、动物双歧杆菌动物亚种、罗伊氏乳杆菌、唾液乳杆菌唾液亚种(来自biomin)；香肠乳杆菌(来自)；肠球菌(来自oralin)；肠球菌(2个菌株)、乳酸乳球菌dsm 1103(来自probios-pioneer)；鼠李糖乳杆菌和香肠乳杆菌(来自)；枯草芽孢杆菌(来自)；肠球菌(来自)；酿酒酵母(来自levucell sb)；酿酒酵母(来自levucell sc 0&me)；乳酸片球菌(来自bactocell)；酿酒酵母(来自(以前为))；酿酒酵母ncyc sc47(来自sc47)；丁酸梭菌(来自)；肠球菌(来自fecinor和fecinor)；酿酒酵母ncyc r-625(来自)；酿酒酵母(来自)；肠球菌和鼠李糖乳杆菌(来自)；枯草芽孢杆菌和米曲霉(来自)；蜡样芽孢杆菌(来自)；蜡样芽孢杆菌东洋变体(bacillus cereus var.toyoi)ncimb40112/cncm i-1012(来自)，或其他dfm，诸如地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌(来自yc)和枯草芽孢杆菌(来自)。
[0229]
dfm可与pro组合，后者可从丹尼斯科公司商购获得。enviva是芽孢杆菌菌株2084登录号nrrl b-50013、芽孢杆菌菌株lssao1登录号nrrl b-50104和芽孢杆菌菌株15a-p4 atcc登录号pta-6507的组合(如在us 7,754,469 b中所传授的-通过援引并入本文)。
[0230]
也可将本文所述的dfm与来自以下属的酵母组合：酵母属(saccharomyces)物种。
[0231]
优选地，本文所述的dfm包含通常被认为是安全(gras)并且优选地经gras批准的微生物。
[0232]
本领域普通技术人员将很容易意识到来自本文所述属内的特定微生物物种和/或菌株，其用于食品和/或农业工业中并且其通常被认为适合于动物消费。
[0233]
在一些实施例中，重要的是dfm是热耐受的，即耐热的。当饲料被制粒时尤其如此。因此，在另一个实施例中，dfm可以是耐热微生物，诸如耐热细菌，包括例如芽孢杆菌属物种。
[0234]
在其他方面，可能希望dfm包含产生孢子的细菌，诸如芽孢杆菌纲，例如芽孢杆菌
属物种。当生长条件不利时，芽孢杆菌纲能够形成稳定的内生孢子，并且对热、ph、水分和消毒剂具有很强的抗性。
[0235]
本文所述的dfm可减少或防止致病性微生物(如产气荚膜梭菌(clostridium perfringens)和/或大肠杆菌和/或沙门氏菌属(salmonella)物种和/或弯曲杆菌属(campylobacter)物种)的肠道建立。换句话说，dfm可以是抗致病性的。如本文所用，术语“抗致病性”意指dfm抵抗病原体的作用(负面作用)。
[0236]
如上所述，dfm可以是任何合适的dfm。例如，以下测定“dfm测定”可用于确定微生物作为dfm的适合性。如本文所用的dfm测定在us 2009/0280090中有更详细的解释。为了避免疑问，根据本文所传授的“dfm测定”选择作为抑制性菌株(或抗致病性dfm)的dfm是根据本公开使用的适合的dfm，即在根据本公开的饲料添加剂组合物中使用的dfm。
[0237]
每个管接种有来自代表性簇的代表性病原体(例如，细菌)。
[0238]
将来自需氧或厌氧生长的潜在dfm的上清液添加到接种管中(不添加上清液的对照除外)并孵育。孵育后，测量对照管和上清液处理管中每种病原体的光密度(od)。
[0239]
然后可将与对照(不含有任何上清液)相比产生较低od的(潜在dfm)菌株的集落分类为抑制性菌株(或抗致病性dfm)。因此，如本文所用的dfm测定在us 2009/0280090中有更详细的解释。
[0240]
优选地，在这种dfm测定中使用的代表性病原体可以是以下的一种(或多种)：梭菌属，诸如产气荚膜梭菌和/或艰难梭菌(clostridium difficile)，和/或大肠杆菌和/或沙门氏菌属物种和/或弯曲杆菌属物种。在一个优选的实施例中，该测定用以下中的一种或多种进行：产气荚膜梭菌和/或艰难梭菌和/或大肠杆菌，优选地产气荚膜梭菌和/或艰难梭菌。更优选地产气荚膜梭菌。
[0241]
抗致病性dfm包括以下细菌中的一种或多种并在wo 2013029013中有所描述：
[0242]
枯草芽孢杆菌菌株3bp5登录号nrrl b-50510、
[0243]
解淀粉芽孢杆菌菌株918atcc登录号nrrl b-50508和
[0244]
解淀粉芽孢杆菌菌株1013atcc登录号nrrl b-50509。
[0245]
dfm可被制备成培养物和载剂(如果使用的话)，并可被添加到带式或桨式混合器中并混合约15分钟，尽管时间可增加或减少。将这些组分共混，使得得到培养物和载剂的均匀混合物。最终产物优选地为干燥、可流动的粉末。然后可将包含一种或多种细菌菌株的dfm添加到动物饲料或饲料预混物中，添加到动物的水中，或以本领域已知的其他方式施用(优选地与本文所述的酶同时)。
[0246]
在dfm混合物中包含的单个菌株的比例可从1％至99％并且优选地从25％至75％变化。
[0247]
动物饲料中dfm的合适剂量可在约1
×
103cfu/g饲料至约1
×
10
10
cfu/g饲料、合适地在约1
×
104cfu/g饲料至约1
×
108cfu/g饲料之间、合适地在约7.5
×
104cfu/g饲料至约1
×
107cfu/g饲料之间的范围内。
[0248]
在另一方面，喂养料中dfm的剂量超过约1
×
103cfu/g饲料、合适地超过约1
×
104cfu/g饲料，合适地超过约5
×
104cfu/g饲料、或合适地超过约1
×
105cfu/g饲料。
[0249]
不含无机磷酸盐的日粮中dfm的剂量为约1
×
103cfu/g组合物至约1
×
10
13
cfu/g组合物、优选地1
×
105cfu/g组合物至约1
×
10
13
cfu/g组合物、更优选地在约1
×
106cfu/g组合
物至约1
×
10
12
cfu/g组合物之间并且最优选地在约3.75
×
107cfu/g组合物至约1
×
10
11
cfu/g组合物之间。在另一方面，饲料添加剂组合物中dfm的剂量大于约1
×
105cfu/g组合物、优选地大于约1
×
106cfu/g组合物并且最优选地大于约3.75
×
107cfu/g组合物。在一个实施例中，饲料添加剂组合物中dfm的剂量大于约2
×
105cfu/g组合物、合适地大于约2
×
106cfu/g组合物、合适地大于约3.75
×
107cfu/g组合物。
[0250]
在另一方面，公开了用于在动物饲料中使用的不含无机磷酸盐的日粮，该不含无机磷酸盐的日粮包含如本文所述的具有植酸酶活性的至少一种多肽，单独地或与至少一种直接饲喂微生物组合、或与至少一种其他酶组合、或与至少一种直接饲喂微生物和至少一种其他酶组合使用，其中该饲料添加剂组合物包含的可以是任何形式诸如颗粒状颗粒。此类颗粒状颗粒可通过选自由以下组成的组的方法产生：高剪切制粒、鼓式制粒、挤出、滚圆、流化床凝集、流化床喷雾包衣、喷雾干燥、冷冻干燥、制粒、喷雾冷却、涡流盘雾化、凝聚、压片或上述方法的任何组合。
[0251]
此外，颗粒状饲料添加剂组合物的颗粒可具有大于50微米并且小于2000微米的平均直径。
[0252]
本领域技术人员将理解动物饲料可包括用于家禽、猪、反刍动物、水产养殖和宠物的植物材料，诸如玉米、小麦、高粱、大豆、低芥酸菜籽、向日葵、或这些植物材料或植物蛋白来源中的任一种的混合物。预期动物性能参数，诸如生长、饲料摄入量和饲料效率，以及改善的均匀性、降低的动物棚舍中的氨浓度和因此改善的动物福利和健康状况都将得到改善。
[0253]
因此，公开了一种用于提高动物饲料的营养价值的方法，其中可将如本文所述的工程化的植酸酶或其片段中的任一种添加到动物饲料中。
[0254]
如本文所用的短语“有效量”是指单独地或与一种或多种其他活性剂(诸如但不限于一种或多种另外的酶、一种或多种dfm、一种或多种精油等)组合赋予动物在一个或多个指标上改善的性能所需的活性剂(诸如植酸酶，例如本文公开的工程化的植酸酶多肽中的任一种)的量。
[0255]
如本文所用，术语“动物性能”可通过任何指标诸如但不限于饲料效率和/或动物的增重、和/或通过饲料转化率和/或通过饲料中营养物的消化率(例如，氨基酸消化率或磷消化率)和/或饲料中可消化能量或代谢能、和/或通过氮保留和/或通过动物避免疾病负面作用的能力或通过受试对象的免疫应答来确定。
[0256]
动物性能特性可包括但不限于：体重；增重；质量；体脂百分比；身高；体脂分布；生长；生长速率；蛋大小；蛋重量；蛋质量；产蛋率；矿物质吸收；矿物质排泄、矿物质保留；骨密度；骨强度；饲料转化率(fcr)；平均每日饲料摄入量(adfi)；平均日增重(adg)；铜、钠、磷、氮和钙中的任何一种或多种的保留和/或分泌；氨基酸保留或吸收；矿化、骨矿化屠体产量和屠体品质。
[0257]“在一个或多个指标上改善的动物性能”意指与不包含本文所述的饲料添加剂组合物的饲料相比，由于使用包含所述饲料添加剂组合物的饲料，受试对象中的饲料效率增加和/或增重增加和/或饲料转化率降低和/或饲料中营养物或能量的消化率改善和/或氮保留量改善和/或避免坏死性肠炎负面作用的能力改善和/或免疫应答改善。
[0258]
优选地，所谓“改善的动物性能”意指饲料效率增加和/或增重增加和/或饲料转化
率降低。如本文所用，术语“饲料效率”是指在一段时间内给动物随意饲喂或饲喂指定量的食物时出现的动物增重的量。如本文所用的“指标的改善”或“改善的指标”是指在动物定义的指标下列出的至少一个参数的改善。
[0259]
所谓“饲料效率增加”意指与在不存在根据本发明的饲料添加剂组合物的情况下饲喂的动物相比，在饲料中使用所述饲料添加剂组合物导致每单位饲料摄入量的增重增加。
[0260]
如本文所用，术语“饲料转化率”是指饲喂给动物以使动物体重增加指定量的饲料量。
[0261]
改善的饲料转化率意指较低的饲料转化率。
[0262]“较低的饲料转化率”或“改善的饲料转化率”意指在饲料中使用饲料添加剂组合物导致饲喂给动物以使动物体重增加指定量所需的饲料量与在饲料不包含所述饲料添加剂组合物时使动物体重增加相同量所需的饲料量相比较低。
[0263]
性能参数的改善可相对于其中所用饲料不包含植酸酶的对照。
[0264]
术语胫骨灰分是指骨矿化的量化方法。该参数给出了磷是缺乏(例如，在磷缺乏阴性对照日粮中含量应低)还是足够(例如，植酸酶处理中的含量与满足肉鸡磷需求的阳性对照日粮相当)的指示
[0265]
术语“磷缺乏日粮”是指其中磷水平不足以满足动物营养需求的日粮，例如，配制的饲料中磷水平远低于国家研究委员会(nrc)或肉鸡饲养者所推荐的水平。动物饲料中的矿物质水平低于最佳生长所需的水平。如果日粮中缺乏磷，钙也不会被动物吸收。ca过多可导致磷(p)消化率变差，并造成不溶性矿物-植酸盐复合物的形成。p和ca两者的缺乏可导致骨骼完整性降低，生长低于正常水平，并最终导致体重减轻。
[0266]
术语“矿化”或“矿化”涵盖矿物质沉积或矿物质的释放。矿物质可从动物体内沉积或释放。矿物质可从饲料中释放。矿物质可包括动物日粮中必需的任何矿物质，并且可包括钙、铜、钠、磷、铁和氮。
[0267]
如本文所用的营养物消化率意指营养物从胃肠道或胃肠道特定区段(例如小肠)消失的分数。营养物消化率可被测量为施用给受试对象的营养物与受试对象粪便中排出的营养物之间的差异，或者施用给受试对象的营养物与保留在胃肠道指定区段(例如回肠)上的消化物中的营养物之间的差异。
[0268]
如本文所用，营养物消化率可如下测量：通过在一段时间内营养物的摄入量与通过排泄物完全收集而得出的营养物的排出量之间的差异；或者使用不被动物吸收的惰性标记，并允许研究人员计算在整个胃肠道或胃肠道的区段中消失的营养物的量。此类惰性标记可以是二氧化钛、氧化铬或酸不溶性灰分。消化率可表示为在饲料中营养物的百分比，或表示为可消化营养物的质量单位/饲料中的营养物的质量单位。
[0269]
如本文所用的营养物消化率涵盖磷消化率、淀粉消化率、脂肪消化率、蛋白质消化率和氨基酸消化率。可消化磷(p)可被定义为回肠可消化p，其为总p摄入量中动物在回肠末端吸收的比例，或粪便可消化p，其为总p摄入量中粪便中未排泄的比例。
[0270]
如本文所用的术语“存活率”意指存活的受试对象数量。术语“改善的存活率”是“降低的死亡率”的另一种说法。
[0271]
如本文所用的术语“屠体产量”意指在商业或实验性宰杀过程之后以活体重量的
比例计的屠体量。术语屠体意指已被宰杀用于食用并去除头部、内脏、四肢部分和羽毛或皮肤的动物躯体。如本文所用，术语肉产量意指以活体重的比例计的可食用肉量，或以活体重的比例计的指定肉块量。
[0272]
术语“屠体品质”和“肉品质”可互换使用，并且是指组成品质(肥瘦比率)以及适口性因素，诸如觉外观、气味、坚实度、多汁性、嫩度和风味。例如，生产没有“木质胸肉(woody breast)”的家禽。在美国，小部分鸡肉中的肌肉异常导致出现木质胸肉的品质问题，这种状况导致鸡胸肉难以接触，并且经常颜色苍白且质地较差。木质胸肉不会给人们带来任何健康或食品安全隐患，并且鸡本身的健康也不会受到负面影响。
[0273]“增重增加”是指与饲喂不含饲料添加剂组合物的饲料的动物相比，饲喂包含所述饲料添加剂组合物的饲料的动物体重增加。
[0274]
术语“动物饲料组合物”、“饲料”、“喂养料”和“秣料(fodder)”可互换使用，并且可包含选自下组的一种或多种饲料材料，该组包含：a)谷类，诸如小粒谷物(例如小麦、大麦、黑麦、燕麦以及它们的组合)和/或大粒谷物，诸如玉蜀黍或高粱；b)来自谷类的副产物，诸如玉米蛋白粉、含可溶物的干酒糟(ddgs)(特别是基于玉米的含可溶物的干酒糟(cddgs))、麦麸、粗小麦粉、小麦次粉、米糠、稻壳、燕麦皮、棕榈仁和柑橘渣；c)从来源诸如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、低芥酸菜籽、鱼粉、干血浆蛋白质、肉和骨粉、马铃薯蛋白、乳清、干椰肉、芝麻获得的蛋白质；d)从植物和动物来源获得的油和脂肪；和/或e)矿物质和维生素。
[0275]
合适地，如本文所提及的预混物可以是由微量成分诸如维生素、矿物质、化学防腐剂、抗生素、发酵产物和其他必需成分构成的组合物。预混物通常是适合于共混进商业口粮内的组合物。
[0276]
如本文所用，术语“接触”是指将工程化的植酸酶多肽或其片段中的任一种(或包含工程化的植酸酶多肽或其片段中的任一种的组合物)间接或直接应用于产品(例如饲料)。可使用的应用方法的实例包括但不限于：在包含饲料添加剂组合物的材料中处理产品，通过将饲料添加剂组合物与产品混合而直接应用，将饲料添加剂组合物喷雾到产品表面上或将产品浸入饲料添加剂组合物的配制品中。在一个实施例中，将本发明的饲料添加剂组合物优选地与产品(例如喂养料)混合。替代性地，饲料添加剂组合物可包含在喂养料的乳液或原始成分中。对于一些应用而言，重要的是组合物在待被影响/处理的产品表面上可用或可用于待被影响/处理的产品表面。这允许组合物赋予性能益处。
[0277]
可将本文所述的工程化的植酸酶多肽或其片段中的任一种(或包含此类工程化的植酸酶多肽或其片段的组合物)与受控量的所述酶用于散布、包衣和/或浸渍产品(例如，不含或基本上不含无机磷的日粮或喂养料或喂养料的原始成分)。
[0278]
在另一方面，可将饲料添加剂组合物均化以产生粉末。粉末可与本领域已知的其他组分混合。粉末或包含粉末的混合物可被强制通过模具，并将所得的线料切割成合适的不同长度的丸粒。
[0279]
任选地，制粒步骤可包括在形成丸粒之前的蒸汽处理或调节阶段。可将包含粉末的混合物置于调节器例如具有蒸汽注入的混合器中。将混合物在调节器中加热达到指定温度，诸如60℃-100℃，典型温度将是70℃、80℃、85℃、90℃或95℃。停留时间可从几秒到几分钟不等。应当理解，本文所述的工程化的植酸酶多肽或其片段中的任一种(或包含工程化
的植酸酶多肽或其片段中的任一种的组合物)适合于添加到任何适当的饲料材料中。
[0280]
在其他实施例中，可将颗粒引入饲料制粒过程中，其中饲料预处理过程可在70℃至95℃之间诸如在85℃与95℃之间进行长达几分钟。
[0281]
在一些实施例中，基于纯酶蛋白，工程化的植酸酶多肽或其片段中的任一种可以1ppb(十亿分率)至10％(w/w)的范围存在于饲料中。在一些实施例中，工程化的植酸酶多肽或其片段以1-100ppm(百万分率)的范围存在于喂养料中。优选剂量可以是每吨饲料产品或饲料组合物1-20g工程化的植酸酶多肽或其片段，或在最终饲料产品中1-20ppm工程化的植酸酶多肽或其片段的最终剂量。
[0282]
优选地，饲料中存在的工程化的植酸酶多肽或其片段应为至少约50-10,000ftu/kg，相当于大约0.1至20mg工程化的植酸酶多肽或其片段的蛋白质/kg。
[0283]
范围可包括但不限于以上讨论的下限和上限的任何组合。
[0284]
包含本文所述的工程化的植酸酶多肽或其片段中的任一种和组合物的配制品和/或制剂可以任何合适的方式制备，以确保配制品包含活性植酸酶。此类配制品可以是液体、干粉或颗粒，其可以是未包衣未保护的，或者可涉及使用热防护包衣，这取决于加工条件。如上所述，工程化的植酸酶多肽及其片段可在固体载剂上廉价地配制而不特别需要保护性包衣，并且在整个调节和制粒过程中仍保持活性。当其中使用苛刻条件的某些区域需要或如果条件允许(例如在高于90℃的超调节饲料的情况下)时，以固体形式应用时提供附加热稳定性的保护性包衣对于获得制粒稳定性可能是有益的。
[0285]
本文所述的饲料添加剂组合物可被配制成干粉或颗粒，如wo 2007/044968(称为tpt颗粒)或wo 1997/016076或wo 1992/012645中所述(所述文献各自通过援引并入本文)。
[0286]
在一个实施例中，饲料添加剂组合物可被配制成用于饲料组合物的颗粒，该颗粒包含：核心；活性剂(例如，植酸酶，诸如本文公开的工程化的植酸酶多肽中的任一种)；和至少一个包衣，在经历选自以下中的一种或多种的条件后，颗粒的活性剂保持至少50％活性、至少60％活性、至少70％活性、至少80％活性：a)饲料制粒过程，b)蒸汽加热饲料预处理过程，c)储存，d)作为未制粒混合物中的成分储存，和e)作为包含选自以下的至少一种化合物的饲料基础混合物或饲料预混物中的成分储存：微量矿物质、有机酸、还原糖、维生素、氯化胆碱以及产生酸性或碱性饲料基础混合物或饲料预混物的化合物。
[0287]
关于颗粒，至少一个包衣可包含占颗粒的至少55％w/w的水分水合材料；和/或至少一个包衣可包含两个包衣。这两个包衣可以是水分水合包衣和防潮包衣。在一些实施例中，水分水合包衣可占颗粒的25％w/w至60％w/w并且防潮包衣可占颗粒的2％w/w至15％w/w。该水分水合包衣可选自无机盐、蔗糖、淀粉和麦芽糖糊精，并且该防潮包衣可选自聚合物、树胶、乳清和淀粉。
[0288]
在其他实施例中，可将颗粒引入饲料制粒过程中，其中饲料预处理过程可在70℃至95℃之间诸如在85℃与95℃之间进行长达几分钟。
[0289]
饲料添加剂组合物可被配制成用于动物饲料的颗粒，该颗粒包含：核心；活性剂，在储存之后以及在颗粒作为一种成分的蒸汽加热制粒过程之后，颗粒的活性剂保持至少80％活性；防潮包衣；和占该颗粒至少25％w/w的水分水合包衣，该颗粒在蒸汽加热制粒过程之前具有小于0.5的水分活度。
[0290]
颗粒可具有选自聚合物和树胶的防潮包衣并且该水分水合材料可是无机盐。水分
水合包衣可占颗粒的25％至45％w/w并且防潮包衣可占颗粒的2％至10％w/w。
[0291]
替代性地，该组合物处于适合于消费的液体配制品中，优选地，此类液体消费品含有以下中的一种或多种：缓冲液、盐、山梨糖醇和/或甘油。
[0292]
此外，可通过将酶应用(例如喷雾)到载剂底物(诸如磨碎的小麦)上来配制饲料添加剂组合物。
[0293]
在一个实施例中，饲料添加剂组合物可被配制成预混物。仅举例而言，预混物可包含一种或多种饲料组分，诸如一种或多种矿物质和/或一种或多种维生素。
[0294]
在一个实施例中，将直接饲喂微生物(“dfm”)和/或工程化的植酸酶多肽或其片段与至少一种生理学上可接受的载剂一起配制，该载剂选自以下中的至少一种：麦芽糖糊精、石灰石(碳酸钙)、环糊精、小麦或小麦组分、蔗糖、淀粉、na2so4、滑石、pva、山梨糖醇、苯甲酸盐、山梨酸盐、甘油、蔗糖、丙二醇、1,3-丙二醇、葡萄糖、对羟基苯甲酸酯、氯化钠、柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐、钙、偏亚硫酸氢盐、甲酸盐以及它们的混合物。
[0295]
应当指出，工程化的植酸酶多肽及其片段中的任一种可用于谷物应用中，例如用于非食品/饲料应用(例如乙醇生产)中的谷物加工。
[0296]
实例
[0297]
除非本文另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。singleton等人,dictionary of microbiology and molecular biology[微生物学和分子生物学词典],2d版,john wiley and sons,new york[约翰威利父子出版公司，纽约州](1994)，以及hale和marham,the harper collins dictionary of biology[哈珀柯林斯生物学词典],harper perennial,n.y.[哈珀永久出版社，纽约州](1991)为技术人员提供了本公开中所用的许多术语的通用词典。
[0298]
本公开在下面的实例中进一步定义。应当理解的是，这些实例虽然指示了某些实施例，但仅以举例说明的方式给出。从以上讨论和实例中，本领域的技术人员能够确定本公开的基本特性，并且在不脱离本公开的实质和范围的情况下，可进行各种改变和修改以适应各种用途和条件。
[0299]
实例1：用于商业日粮中以完全替换无机磷酸盐的下一代生物合成细菌6-植酸酶的功效
[0300]
在德克萨斯农工大学(美国)的肉鸡研究中评价了用于商业日粮中以完全替换无机p的植酸酶变体phy-13885的功效。
[0301]
总共测试了10次处理，并且将这些分成两部分研究。在研究的第一部分中，给4个测试组饲喂钙(ca)减少和完全替换无机p的日粮。在研究的第二部分中，给4个测试组饲喂进一步减少可消化氨基酸(aa)、代谢能(me)和钠(na)的日粮。在研究的两部分的数据分析中使用两个阳性对照。
[0302]
第1部分：具有ca减少、无机p的完全替换的4种测试日粮与两个阳性对照的比较：
[0303]
使用六种处理。配制满足肉鸡营养需求、营养充足但不过度指定的阳性对照日粮(pc1，处理1)。该日粮基于玉米、小麦、豆粕、菜籽、稻和麦麸，以在4个阶段提供足够的底物(植酸盐)：开食0-10日龄，生长11-21日龄，育肥1，21-35日龄，以及育肥2，35-42日龄。配制不含任何无机磷(p)的阴性对照基础日粮，其中ca减少(相对于pc1，每个阶段约0.2％-0.3％单位，表1a、b)。基础日粮补充有下一代生物合成细菌6-植酸酶：1)在所有4个阶段中
均为1000ftu/kg(处理2，nc1a)；2)在开食阶段中为2000ftu/kg，在生长阶段中为1500ftu/kg以及在育肥阶段1和2中为1000ftu/kg(nc1b，处理3)；3)在开食阶段中为3000ftu/kg，在生长阶段中为2000ftu/kg以及在育肥阶段1和2中为1000ftu/kg(nc1c，处理4)；4)与nc1b相同，但减少71kcal/kgme并补充2000xu/kg danisco木聚糖酶(nc1d，处理5)。配制第二阳性对照日粮，其中me相对于pc1减少71kcal/kg，添加2000xu/kgdanisco木聚糖酶(处理6，pc2)。
[0304]
对于6种处理的每种处理，使用10个重复的24只禽类/围栏(ross308；50％雄性和50％雌性)。在所有阶段随意给禽类饲喂碎屑(开食阶段)或丸粒日粮(生长阶段和育肥阶段)。在第21天和试验结束时，随机选择4只禽类(2只雄性和2只雌性)以确定脱脂胫骨灰分含量。在试验结束时，从随机选择的禽类(6只禽类/圈)测量屠体品质。
[0305]
表1a：试验1第1部分开食阶段和生长阶段的成分和计算的营养物
[0306]
[0307]
[0308][0309]
表1b：试验1第1部分的育肥1和育肥2阶段的成分和计算的营养物组成
[0310]
[0311]
[0312]
[0313][0314]
*植酸酶由表达共有序列细菌植酸酶基因的生物合成变体的真菌(里氏木霉)生产菌株(杜邦营养生物科学公司(dupont nutrition and biosciences))发酵而产生。
[0315]
使用单因素anova分析数据，使用tukey hsd检验分离处理平均值。p《0.05被认为是统计学上显著的差异。
[0316]
性能结果总结在表2中。
[0317]
表2，在ca减少的日粮中用植酸酶完全替换无机p对肉鸡性能的影响，试验1第1部分
[0318]
[0319]
[0320][0321]
a、b、c：列中的不同上标指示显著差异，p《0.05
[0322]
*pc1：营养充足但不过度指定的阳性对照日粮；nc1a：在所有4个阶段中以1000ftu/kg补充植酸酶。nc1b：在开食阶段中以2000ftu/kg、在生长阶段中以1500ftu/kg、以及在育肥阶段1和2中以1000ftu/kg补充植酸酶；nc1c：在开食阶段中以3000ftu/kg、在生长阶段中以2000ftu/kg、以及在育肥阶段1和2中以1000ftu/kg补充植酸酶；nc1d：nc1b，其中减少71kcal/kg me并补充2000xu/kg danisco木聚糖酶；pc2：相对于pc1减少71kcal/kg me，其中添加2000xu/kg danisco木聚糖酶。
[0323]
*tukey检验显示相同上标
[0324]
**fcrc：体重校正的fcr，例如bw差值为2.85kg：fcrc＝fcr
(0-42d)
+(((2.85-bw
d42，kg
)*1000)/32)/100，2.85kg的bw用于ross 308混合性别。
[0325]
结果显示，与pc和ross 308肉鸡饲养者目标相比，在日粮中具有不同剂量策略的植酸酶或与木聚糖酶组合，其中日粮配制成具有低ca、足够的植酸盐底物和支持砂囊发育的燕麦皮，可完全替换所有无机p并保持肉鸡的性能(表2和表14)。
[0326]
与对照相比，处理的骨抗断强度没有恶化，相反，在42天时，与没有任何酶的pc相比，最高起始植酸酶剂量(3000ftu)和2000ftu植酸酶+木聚糖酶组合的骨强度显著更高(p《0.05)(表4)。
[0327]
表4，在ca减少的日粮中用植酸酶完全替换无机p对肉鸡骨灰分和骨抗断强度的影响，试验1第1部分
[0328][0329][0330]
a、b、c：列中的不同上标指示显著差异，p《0.05
[0331]
*pc1：营养充足但不过度指定的阳性对照日粮；nc1a：在所有4个阶段中以
1000ftu/kg补充植酸酶。nc1b：在开食阶段中以2000ftu/kg、在生长阶段中以1500ftu/kg、以及在育肥阶段1和2中以1000ftu/kg补充植酸酶；nc1c：在开食阶段中以3000ftu/kg、在生长阶段中以2000ftu/kg、在育肥阶段1和2中以1000ftu/kg补充植酸酶；nc1d：nc1b，其中减少71kcal/kg me并补充2000xu/kg danisco木聚糖酶；pc2：相对于pc1减少71kcal/kg me，其中添加2000xu/kg danisco木聚糖酶。
[0332]
所有测试组保持屠体特性。然而，以3000ftu/kg(开食)、2000ftu/kg(生长)、1000ftu/kg(育肥1和2)添加植酸酶的处理与两个对照相比显示出更大的(p《0.05)胸肉产量(表5)。
[0333]
表5，在ca减少的日粮中用植酸酶完全替换无机p对肉鸡屠体特性的影响，试验1第1部分
[0334][0335][0336]
a、b、c：列中的不同上标指示显著差异，p《0.05
[0337]
*pc1：营养充足但不过度指定的阳性对照日粮；nc1a：在所有4个阶段中以1000ftu/kg补充植酸酶。nc1b：在开食阶段中以2000ftu/kg、在生长阶段中以1500ftu/kg、以及在育肥阶段1和2中以1000ftu/kg补充植酸酶；nc1c：在开食阶段中以3000ftu/kg、在生长阶段中以2000ftu/kg、在育肥阶段1和2中以1000ftu/kg补充植酸酶；nc1d：nc1b，其中减少71kcal/kg me并补充2000xu/kg danisco木聚糖酶；pc2：相对于pc1减少71kcal/kg me，其中添加2000xu/kg danisco木聚糖酶。
[0338]
第2部分：除了ca减少、无机p的完全替换之外还具有可消化aa、me和na的进一步减少的4种测试日粮与两个阳性对照的比较。
[0339]
在四个测试组(nc2a、nc2b、nc2c、nc2d)中，使用与nc1a、nc1b、nc1c和nc1d相同的酶内含物，然而，基于给定剂量水平的底物特异性基质(为phy而开发，由杜邦营养生物科学公司(dupont nutrition&biosciences)生产的商业植酸酶)，将这些日粮配制成具有进一步减少的可消化aa、me和na，如表6a、b所示。
[0340]
表6a：试验1第2部分开食阶段和生长阶段的成分和计算的营养物
[0341]
[0342]
[0343][0344][0345]
表6b：试验1第2部分的育肥1和育肥2阶段的成分和计算的营养物组成
[0346]
[0347]
[0348][0349]
*植酸酶由表达共有序列细菌植酸酶的生物合成变体的真菌(里氏木霉)生产菌株(杜邦营养生物科学公司)发酵而生产。
[0350]
当与不含酶的对照(pc1)相比时，当将植酸酶和植酸酶+木聚糖酶添加到具有减少的可消化aa、me和na的日粮中时，所有测试组在每个阶段和0-42d期间保持性能参数(表7)。
[0351]
表7，用植酸酶完全替换无机p补充到ca、可消化aa、me和na减少的日粮中对肉鸡性能的影响，试验1第2部分
[0352]
[0353]
[0354][0355]
a、b、c：列中的不同上标指示显著差异，p《0.05
[0356]
*pc1：营养充足但不过度指定的阳性对照日粮；与pc1相比，所有nc2日粮都减少了ca、可消化动物酸、me和na。nc2a：在所有4个阶段中以1000ftu/kg补充植酸酶。nc2b：在开食阶段中以2000ftu/kg、在生长阶段中以1500ftu/kg、以及在育肥阶段1和2中以1000ftu/kg补充植酸酶；nc2c：在开食阶段中以3000ftu/kg、在生长阶段中以2000ftu/kg、以及在育肥阶段1和2中以1000ftu/kg补充植酸酶；nc2d：nc2b，其中减少71kcal/kg me并补充2000xu/kg danisco木聚糖酶；pc2：相对于pc1减少71kcal/kg me，其中添加2000xu/kg danisco木聚糖酶。
[0357]
**fcrc：体重校正fcr，例如fcrc＝fcr(0-42d)+(((2.85-bwd42，kg)*1000)/32)/100。2.85kg的bw用于ross 308混合性别。
[0358]
当与不含酶的对照(pc1)相比时，当将植酸酶和植酸酶+木聚糖酶添加到除了ca减少和无机p的完全替换之外还具有减少的可消化aa、me和na的日粮中时，所有测试组在第21天和第42天保持胫骨灰分和胫骨抗断强度(表8)。
[0359]
表8，用植酸酶完全替换无机p补充到ca、可消化aa、me和na减少的日粮中对肉鸡胫骨灰分和胫骨抗断强度的影响，试验1第2部分
[0360][0361][0362]
a、b、c：列中的不同上标指示显著差异，p《0.05
[0363]
*pc1：营养充足但不过度指定的阳性对照日粮；与pc1相比，所有nc2日粮都减少了
ca、可消化动物酸、me和na。nc2a：在所有4个阶段中以1000ftu/kg补充植酸酶。nc2b：在开食阶段中以2000ftu/kg、在生长阶段中以1500ftu/kg、以及在育肥阶段1和2中以1000ftu/kg补充植酸酶；nc2c：在开食阶段中以3000ftu/kg、在生长阶段中以2000ftu/kg、以及在育肥阶段1和2中以1000ftu/kg补充植酸酶；nc2d：nc2b，其中减少71kcal/kg me并补充2000xu/kg danisco木聚糖酶；pc2：相对于pc1减少71kcal/kg me，其中添加2000xu/kg danisco木聚糖酶。
[0364]
当与不含酶的对照(pc1)相比时，当将植酸酶和植酸酶+木聚糖酶添加到除了ca减少和无机p的完全替换之外还具有减少的可消化aa、me和na的日粮中时，所有测试组保持屠体特性，然而，用植酸酶(在开食、生长和育肥中为2000、1500和1000ftu)+木聚糖酶(2000u/kg)的组合处理减少了脂肪垫产量(表9)。
[0365]
表9，用植酸酶完全替换无机p补充到可消化ca、aa、me和na减少的日粮中对肉鸡中屠体产量(％)的影响，试验1第2部分
[0366][0367][0368]
a、b、c：列中的不同上标指示显著差异，p《0.05
[0369]
*pc1：营养充足但不过度指定的阳性对照日粮；与pc1相比，所有nc2日粮都减少了ca、可消化动物酸、me和na。nc2a：在所有4个阶段中以1000ftu/kg补充植酸酶。nc2b：在开食阶段中以2000ftu/kg、在生长阶段中以1500ftu/kg、以及在育肥阶段1和2中以1000ftu/kg补充植酸酶；nc2c：在开食阶段中以3000ftu/kg、在生长阶段中以2000ftu/kg、在育肥阶段1和2中以1000ftu/kg补充植酸酶；nc2d：nc2b，其中减少71kcal/kg me并补充2000xu/kg danisco木聚糖酶；pc2：相对于pc1减少71kcal/kg me，其中添加2000xu/kg danisco木聚糖酶。
[0370]
实例2：用于商业日粮中以完全替换无机磷酸盐的下一代生物合成细菌6-植酸酶的功效的进一步评估
[0371]
在第二研究中重复实例1中描述的试验，以增加发现的可靠性。第二研究也在美国德克萨斯农工大学(texas a&m university(usa))进行。
[0372]
测试了十种处理并且设计与试验1完全相同。唯一的修改是：1)仅使用雄性ross 308肉鸡，每围栏26只禽类；2)燕麦皮保持在1％并且使用大豆皮(表10a、b)。
[0373]
以与试验1中相同的方式分析数据，第一部分与对照相比，试验组仅被配制成具有
减少的矿物质(例如ca和无机p的全部替换)。第二部分与对照组相比，试验组进一步减少了可消化aa、me和na。
[0374]
第1部分：具有ca减少、无机p的完全替换的4种测试日粮与两个阳性对照的比较。
[0375][0376]
表10b.试验2的育肥1和育肥2阶段的成分和计算的营养物组成
[0377][0378]
植酸酶由表达共有序列细菌植酸酶的生物合成变体的真菌(里氏木霉)生产菌株(杜邦营养生物科学公司)发酵而生产。
[0379]
在开食阶段，阳性对照组与试验组之间的性能没有发现显著差异。在0-21日龄期间，nc1a、nc1c和nc1d、pc2与pc1相比改善(p《0.05)bw并且fcr降低。在总体0-42日龄期间，对于bw观察到类似的响应，与pc1相比，nc1a、b、c中的fcr降低(p《0.05)(表11)。在测试日粮中，体重校正的fcrc低于pc1(p《0.05)。
[0380]
这些结果证实了第一次试验的发现：与pc和ross 308肉鸡饲养者的推荐相比，在日粮中具有不同剂量策略的植酸酶或与木聚糖酶组合，其中日粮配制成具有低ca、足够的植酸盐底物和支持砂囊发育的燕麦皮，可完全替换所有无机p并保持肉鸡的性能。
[0381]
表11，在ca减少的日粮中用植酸酶完全替换无机p对肉鸡性能的影响，试验2第1部分
[0382]
[0383]
[0384][0385]
a、b、c：列中的不同上标指示显著差异，p《0.05
[0386]
*pc1：营养充足但不过度指定的阳性对照日粮；nc1a：在所有4个阶段中以1000ftu/kg补充植酸酶。nc1b：在开食阶段中以2000ftu/kg、在生长阶段中以1500ftu/kg、以及在育肥阶段1和2中以1000ftu/kg补充植酸酶；nc1c：在开食阶段中以3000ftu/kg、在生长阶段中以2000ftu/kg、在育肥阶段1和2中以1000ftu/kg补充植酸酶；nc1d：nc1b，其中减少71kcal/kg me并补充2000xu/kg danisco木聚糖酶；pc2：相对于pc1减少71kcal/kg me，其中添加2000xu/kg danisco木聚糖酶。
[0387]
**fcrc：体重校正的fcr，校正至3.11kg的bw(例如fcrc＝fcr(0-42d)+(((3.11-bwd42，kg)*1000)/32)/100)。3.11kg用于ross 308雄性肉鸡。
[0388]
第2部分：除了ca减少、无机p的完全替换之外还具有可消化aa、me和na的进一步减少的4种测试日粮与两个阳性对照的比较。
[0389]
在四个测试组(nc2a、nc2b、nc2c、nc2d)中，使用与nc1a、nc1b、nc1c和nc1d相同的酶内含物，然而，基于给定剂量水平的底物特异性基质配制具有进一步减少的可消化aa、me和na的这些日粮，如表12a、b所示。
[0390]
表12a：试验2第1部分开食阶段和生长阶段的成分和计算的营养物组成
[0391]
[0392]
[0393]
[0394][0395]
表12b：试验2的育肥1和育肥2阶段的成分和计算的营养物组成
[0396]
[0397]
[0398][0399]
[0400]
*植酸酶由表达共有序列细菌植酸酶基因的生物合成变体的真菌(里氏木霉)生产菌株(杜邦营养生物科学公司)发酵而产生。
[0401]
当与不含酶的对照(pc1)相比时，当将植酸酶和植酸酶+木聚糖酶添加到具有减少的可消化aa、me和na的日粮中时，所有测试组在每个阶段和0-42d期间保持性能参数(表13)。
[0402]
表13，用植酸酶完全替换无机p并减少可消化aa、me和na对肉鸡性能的影响，试验2第2部分
[0403]
[0404][0405]
a、b、c：列中的不同上标指示显著差异，p《0.05
[0406]
*pc1：营养充足但不过度指定的阳性对照日粮；所有nc进一步减少可消化动物酸、me和na。nc2a：在所有4个阶段中以1000ftu/kg补充植酸酶。nc2b：在开食阶段中以2000ftu/kg、在生长阶段中以1500ftu/kg、以及在育肥阶段1和2中以1000ftu/kg补充植酸酶；nc2c：在开食阶段中以3000ftu/kg、在生长阶段中以2000ftu/kg、以及在育肥阶段1和2中以1000ftu/kg补充植酸酶；nc2d：nc2b，其中减少71kcal/kg me并补充2000u/kg danisco木聚糖酶；pc2：相对于pc1减少71kcal/kg me，其中添加2000u/kg danisco木聚糖酶。
[0407]
**fcrc：体重校正的fcr，校正至3.11kg的bw(例如fcrc＝fcr(0-42d)+(((3.11-bwd42，kg)*1000)/32)/100)。3.11kg用于ross 308雄性肉鸡。
[0408]
与ross 308饲养者目标的比较：
[0409]
饲喂pc1日粮的肉鸡的最终bw非常接近ross 308性能目标(表14)。从第21天开始，植酸酶处理优于ross 308性能目标，对于nc1日粮，试验1和2中第42天的最终bw平均分别增
加3.4％和3.6％。
[0410]
表14，ross 308性能目标(bw，kg)分别与试验1和2的平均bw的比较
[0411][0412]
总之，来自两个研究的结果证实，使用适当的日粮配制品和使用有效的植酸酶，所有的无机磷可被不含肉骨粉的植酸酶替换，并且保持了肉鸡的性能。这是第一份显示在所有生长阶段具有正常的生长特性的100％植物的、完全不含无机p的商业相关肉鸡日粮的报告。
[0413]
经济效益计算
[0414]
本研究的数据显示，完全替换无机p显著节省饲料成本。完全替换无机磷并减少ca，饲料成本节省高达$7.7/mt。随着进一步减少可消化aa、me和na，饲料成本节省高达$19.8/mt。当使用木聚糖酶与植酸酶的组合时，应用木聚糖酶的me矩阵值，饲料成本可降低$23.5/mt(表15)。
[0415]
表15，估计成本节省
[0416][0417][0418]
*饲料成本基于当前us价格来计算并且包括酶的成本
[0419]
饲料成本/kg体重增重可减少高达0.046usd，在年产500000mt肉鸡活重的情况下，集成商节省的成本超过一百万美元。
[0420]
实例3：作为含有木聚糖酶的肉鸡日粮中无机磷酸盐的完全替换物的新型共有序列细菌6-植酸酶变体
[0421]
本研究通过将新型共有序列6-植酸酶变体(phy-13885，“phyg”)应用于含有木聚糖酶并且在不添加无机磷酸盐(pi)的情况下从开食阶段到育肥阶段植酸-p水平梯度降低的日粮中，来评价其在肉鸡饲料中的性能。
[0422]
材料和方法
[0423]
禽类、鸡舍和实验设计：该研究在西班牙加泰罗尼亚(catalonia,spain)的农业食品研究与技术研究所(agrifood research and technology)(irta)mas bov
é
研究机构进行。所有实验程序按照欧洲指令2010/63/eu(2010)和西班牙有关研究中动物护理和使用指南(b.o.e.编号252，皇室法令(real decreto)2010/2005)进行。使用2
×
2因素排列，包括两种日粮和两种性别。从商业孵化场获得总共1,248只混合性别的ross 308肉鸡幼仔，并随机分配到24层围栏中(每围栏52只禽类，42日龄的放养密度≤16kg/m2)，每种日粮处理有12个围栏，包括六个雄性围栏和6个雌性围栏。以随机完全区组设计将禽类分配到每种处理，该设计包括对应于动物棚舍内位置的6个区组。围栏衬有已用戊二醛消毒的新鲜刨花。处理日粮在开食阶段(第0至11天)期间以碎屑形式并且在生长阶段(第11至22天)和育肥阶段(第22至35天和第35至42天)期间以丸粒形式提供作为阶段日粮。在研究期间随意提供日粮和水。将围栏置于环境受控的肉鸡棚舍中，光照方案为：在第1至2天期间ld24:0h，在第3至7天期间ld18:6h，此后ld14:10h。温度最初保持在32℃至34℃，然后在第3天至第28天期间逐渐降低至19℃至21℃，之后保持在该温度，与饲养者推荐一致。
[0424]
处理日粮：日粮是基于玉米、豆粕、小麦、菜籽粕、米糠、豆油和麦麸的复合日粮，并按阶段配制(表16)。包括燕麦皮以刺激砂囊发育，并且使用大豆皮作为填充材料。根据饲养者推荐(安伟捷荷兰公司(aviagen nl)，2014)配制阳性对照日粮(pc)以提供足够水平的所有营养物，除了me由于来自木聚糖酶的能量贡献而低71kcal/kg。在开食阶段植酸盐含量高，在随后阶段逐渐降低(植酸-p：开食阶段期间0.34％，生长阶段期间0.33％，育肥1阶段期间0.29％，育肥2阶段期间0.28％)。pc还含有取决于生长阶段(表16)的1.54％至0.94％(以饲料为基础)的来自mcp的pi和在所有阶段中每千克日粮在里氏木霉中产生的2,000木聚糖酶单位(xu)的商业木聚糖酶(danisco木聚糖酶，杜邦动物营养公司(dupont animal nutrition))。第二日粮被配制成不含无机磷酸盐(ipf)，与pc相同，除了钙(ca)减少0.2个百分点和完全不存在添加的pi，以在第0至11天期间3,000ftu/kg、在第11至22天期间2,000ftu/kg和在第22至42天期间1,000ftu/kg的剂量水平补充在里氏木霉(phyg；杜邦动物营养公司)中表达的新型共有序列细菌6-植酸酶变体。通过混合除氨基酸、维生素和矿物质预混合物和酶之外的所有成分来大批制备饲料。在添加到混合器之前，将氨基酸、维生素和矿物质预混物与10kg饲料混合。将酶与磨碎的玉米预混合，然后添加到日粮中以确保均匀分布。在80℃下进行制粒。
[0425]
表16，按阶段处理日粮的成分和计算的营养物含量(％，以饲料为基础)。
[0426]
[0427]
[0428][0429]1ipf，不含无机磷酸盐
[0430]2一千克饲料含有：维生素a：10000iu；维生素d3：4800iu；维生素e：45mg；维生素k3：3mg；维生素b1：3mg；维生素b2：9mg；维生素b6：4.5mg：维生素b
12
：40mg；叶酸：1.8mg；生物素：150mg；泛酸钙：16.5mg；烟酸：65mg；mn(以mnso4.h2o计)：90mg；zn(以zno计)：66mg；i(以ki计)：1.2mg；fe(以feso4.h2o计)：54mg；cu(以cuso4.5h2o计)：12mg；se(以naseo3计)：0.18mg；bht：25mg；甲酸钙：5mg；硅酸，干燥并沉淀：25mg；硬脂酸钙：25mg；碳酸钙：至4g。
[0431]3排除来自基础日粮的植酸酶的贡献。
[0432]
采样和测量：将禽类和饲料在第0、11、22、35和42天称重，并用于计算平均bw、平均每日饲料摄入(adfi)和平均每日增重(adg)，以每围栏为基础表示。每天监测围栏的禽类死亡率，记录并用于计算死亡率校正的饲料转化率(fcr)。此外，仅对于整个周期(第0至42天)，通过用3个点/100g与pc的bw差值来校正fcr值，计算体重校正的fcr(fcrc)。
[0433]
在第11天、第22天和第42天，通过颈脱位法对每围栏2只禽类实施安乐死，并对收集的右和左胫骨采样以确定灰分含量。按围栏汇集胫骨，并在分析前冷冻在-20℃。
[0434]
由西班牙的irta mas bov
é
分析日粮样品的dm、cp、灰分、p和ca。由irta(西班牙康斯坦蒂(constant
í
,spain))测量植酸酶活性，并通过丹麦布兰德的杜邦研究中心(dupont research centre,brabrand,denmark)分析木聚糖酶。
[0435]
化学分析：解冻右胫骨，然后去除腓骨、肌肉和结缔组织。然后将骨烘干，在乙醚中脱脂，再次烘干，然后根据dersjant-li等人(2020b)先前描述的方法灰化。分别根据aoac方法925.09、942.05和968.06(aoac，2000)分析饲料中的干物质、cp和灰分。根据aoac方法965.17(aoac，1990)通过irta(mas bov
é
，西班牙)分析饲料中的磷。通过电感耦合等离子体质谱法(icp-ms；安捷伦科技模型7700x)在西班牙巴塞罗那的比斯瓦尔堡办公室实验室(ofice laboratory castellbisbal(barcelona,spain))根据pacquette等人(2018)描述的方法分析饲料中的钙。通过iso方法30024:2009(动物饲料-植酸酶活性的确定)确定植酸酶，其中一个植酸酶单位(ftu)被定义为在ph 5.5和37℃下每分钟从植酸盐中释放1μmol无机磷酸盐的酶的量。根据romero等人(2014)的方法确定木聚糖酶活性，其中一个xu被定义为在ph4.2和50℃下每分钟从小麦阿拉伯木聚糖中释放0.48μmol还原糖如木糖的酶的量。
所有饲料分析一式两份进行。
[0436]
统计分析：所有数据以围栏作为实验单位呈现。通过2
×
2因素方差分析(anova)来分析所有数据以评价处理和性别及其相互作用对性能和骨灰分量度的主要影响。在鉴定出因子之间的显著相互作用的情况下，使用tukey检验分离平均值。使用jmp 14.0的fit模型平台(jmp，2019；北卡罗来纳州卡里的sas研究所有限公司(sas institute inc.,cary,nc))进行分析。pep《0.10时差异被认为是显著的，被认为是一种趋势。
[0437]
结果
[0438]
在日粮处理中所分析的营养物和酶活性的水平呈现在表17中。
[0439]
表17，按阶段划分的所分析的处理日粮的营养物含量(％原样)和酶活性
[0440][0441]1ipf，不含无机磷酸盐
[0442]2基于成分中所分析的植酸-p水平
[0443]
生长性能和死亡率：在所有单独生长阶段，接受ipf日粮的禽类的adg、adfi和fcr与pc相当或相比有所改善(表18)：在第0至11天期间，处理ipf中的平均adg、adfi和fcr与由pc产生的对应值相当；在第11至22天期间，与pc相比，处理ipf中adg和adfi增加，并且fcr降低(在所有情况下p＜0.001)；在第22至35天期间，处理ipf中的adg增加(p＜0.01)，而adfi和fcr与pc没有差异；在第35至42天期间，adg在处理ipf相对于pc中增加(p＜0.05)，并且与pc相比，fcr倾向于降低(p＜0.10)(表18)。处理ipf相对于pc的阳性生长性能影响在第11至22天期间最大(adg+6.02％，adfi+4.57％，fcr-2个点，相对于pc，p＜0.001，表18)。
[0444]
表18，按阶段划分的日粮和性别对肉鸡生长性能量度的影响；主要影响和相互作用影响的因素分析1。
[0445][0446]1因素分析是具有2种日粮和2种性别的2
×
2因素方差分析(anova)。
[0447]
所有生长性能参数(adg、adfi和fcr)都针对死亡率进行了校正。
[0448]2ipf，不含无机磷酸盐。
[0449]
在累积基础上，与pc相比，处理ipf在第0至22天和第0至35天中的每一者期间均改善了bw、adg、adfi和fcr(在所有情况下p＜0.05)(表19)。对于整个周期(第0至42天)，相对于pc，ipf使第42天bw改善了3.97％(p＜0.01)，adg改善了4.10％(p＜0.01)，adfi改善了1.94％(p＝0.05)并且fcrc降低了6个点(p＜0.001)(表19)。
[0450]
表19，日粮和性别对肉鸡生长性能量度的累积影响；主要影响和相互作用影响的因素分析1。
[0451][0452]1因素分析是具有2种日粮和2种性别的2
×
2因素方差分析(anova)。所有生长性能参数(adg、adfi和fcr)都针对死亡率进行了校正。
[0453]2fcrc：体重校正的fcr，通过用3个点/100g与pc的bw差值来校正fcr值而计算。
[0454]3epef，欧洲性能效率因子(安伟捷公司(aviagen)，2018)＝adg(g)x(100-死亡率(％))/(10 x fcr)。
[0455]4饲养者目标：ross 308/ross 308 ff肉鸡：性能目标，安伟捷公司，2019。
[0456]5ipf：不含无机磷酸盐。
[0457]
与处理无关，在大多数单独生长阶段(表18)和累积生长阶段(表19)期间，雄性禽类始终表现出比雌性禽类更高的bw、adg、adfi和更低的fcr(p＜0.05)。这种总体趋势的例外包括：第0至11天，在此期间雄性和雌性禽类之间的生长性能结果量度没有差异；以及第35至42天和总体(第0至42天)，在此期间雄性和雌性中fcr是等同的，但雄性中bw、adg和adfi较高。在第22至35天期间性别差异最大(雄性相对于雌性，adg：+18.54％(p＜0.001)；adfi：+16.85％(p＜0.001)，fcr：-2.2个点(p＝0.05))。
[0458]
在第11至22天(p＜0.05)、第0至22天(p＜0.01)和第0至42天(p＜0.05)期间对fcr以及在整个时期(第0至42天)(p＜0.001)对fcrc存在性别与日粮处理之间的相互作用。这些相互作用的性质使得ipf日粮在降低fcr(相对于pc)中的有益效果在雄性中比在雌性中更大(效果大小差异在第0至22天期间为1.9个fcr点，在第0至42天期间为4.0个fcr点)(图1a和图1b)。
[0459]
跨处理和生长阶段的死亡率等于或低于3％。在任何阶段，按性别或处理划分的死亡率水平没有差异(表18和表19)。
[0460]
按日粮和性别划分的在围栏内的禽类之间的禽类bw的一致性(基于个体禽类重量)呈现在表20中。第11、22和42天中每一天的体重cv一致地为12％或更低。处理日粮或性别对bw cv值没有主要影响或相互作用影响，除了在第22天ipf处理相对于pc存在较低bw的
cv的趋势(p《0.10)，以及在第42天bw的cv在雄性中比在雌性中更高(p《0.05)(表20)。
[0461]
表20，按日粮和性别划分的禽类bw的一致性(变异系数(cv))1。
[0462][0463]1将禽类单独称重，然后基于每围栏计算变异系数。
[0464]2ipf，不含无机磷酸盐
[0465]
cv，变异系数＝标准偏差/平均值
[0466]
胫骨灰分和抗断强度：在所有时间点(第11天、第22天和第42天)的胫骨灰分含量在ipf处理中保持与pc相当，并且在雄性与雌性之间没有差异(表21)。
[0467]
表21，在第11、22和42天phyg与木聚糖酶组合对胫骨灰分(％dm)的影响；主要影响和相互作用影响的因素分析1。
science association 109
th annual meeting.[家禽科学协会第109次年会]2020(摘要149))进一步证实了1,000ftu/kg下的phyg在不含pi的肉鸡日粮中的额外磷影响，引起了在15日龄的雄性肉鸡中dm、n、ge和aa的aid的改善(dersjant-li等人,poultry science association 109
th annual meeting.[家禽科学协会第109次年会]2020(摘要149))。不受理论的约束，有可能的是，在本研究中在开食阶段(3,000ftu/kg)和生长阶段(2,000ftu/kg)中使用的高剂量水平的phyg，当禽类生长速率高时，与由这些日粮的植酸盐含量提供的足够的可用底物结合，使得禽类能够在这些早期生长阶段中从植酸酶的存在中获得更大的益处。
[0474]
总之，将新型共有序列细菌6-植酸酶变体phyg以按阶段递减的剂量水平添加到含有木聚糖酶而没有添加无机p的复合日粮中，在所有生长阶段期间保持或改善了与营养充足的对照日粮相当的肉鸡生长性能。胫骨灰分也保持与对照日粮相当。这些发现增加了关于phyg在含有木聚糖酶的肉鸡日粮中作为pi的完全替代物的功效的现有证据，并且证实了按阶段所采用的分级phyg剂量水平和日粮植酸-p含量在所测试的日粮设置中的适用性。
[0475]
实例4：在具有或不具有木聚糖酶的日粮中评价新型共有序列细菌6-植酸酶变体(phyg)对肉鸡生长性能和骨矿化的影响
[0476]
本实例显示了在具有或不具有木聚糖酶的日粮中评价的新型共有序列细菌6-植酸酶变体(phy-13885，“phyg”)对肉鸡生长性能和骨矿化的影响。
[0477]
材料和方法
[0478]
禽类和棚舍：所有动物护理程序都得到了斯科特霍斯特饲料研究机构动物伦理委员会(institutional animal ethics committee of schothorst feed research)的批准。
[0479]
从商业孵化场获得总共26,240只ross 308一日龄肉鸡(混合的雄性和雌性)，并以820只禽类/围栏和8只围栏/处理在32层围栏中分配四种日粮处理。围栏中容纳有新鲜刨花并位于肉鸡棚舍中，在该肉鸡棚舍中，环境温度最初保持在34.5℃，在37日龄时降低至20℃，在24:0h的明暗循环下持续第一个24h，接着是22l:2d h。从第3天开始，明暗循环为8l:4d:10l:2d。在试验期间，使禽类随意获得水和日粮。
[0480]
日粮处理：在具有2个水平的木聚糖酶和2个水平的植酸酶的2
×
2因素排列中测试四种日粮处理，包括：1)基于混合谷物和油籽粉的阳性对照(pc1)，其含有来自磷酸一钙(mcp)的无机磷酸盐(pi)，2)补充有2,000xu/kg木聚糖酶并减少了75kcal/kg me的pc1(pc2)，3)和4)分别将pc1和pc2重新配制成不含无机磷酸盐(ipf)并减少了ca(-0.15百分点)，在开食阶段补充3,000ftu/kg(1-10d，0.33％植酸-p)、在生长阶段补充2000ftu/kg(10-22d，0.31％植酸-p)并且在育肥阶段补充1000ftu/kg(22-37d，0.26％植酸-p)的phyg(ipf1和ipf2)。日粮的详细组成在表22中给出。开食日粮以碎屑的形式饲喂，而生长和育肥日粮以标准丸粒(3.0mm)的形式饲喂。
[0481]
表22，测试日粮(原样)的饲料配制品和计算的营养物
[0482]
[0483]
[0484][0485]
*每kg日粮供应的维生素和矿物质预混物(基于0.5％剂量)：
[0486]
维生素a 10,000iu；维生素d3 3,333iu；维生素e 50mg；维生素k3 2.5mg；维生素b1 2.5mg；维生素b2 7.5mg；维生素b6 5mg；维生素b12 25mg；烟酸50mg；d-泛酸15mg；氯化胆碱500mg；叶酸1.5mg；生物素0.25mg；fe 50mg(以feso4.h2o计)；cu 12.5mg(以cuso4.5h2o计)；mn 75mg(以mno计)；zn 70mg(以znso4.h2o计)；i 2mg(以ca(io3)2计)；se 0.25mg(以na2seo3计)；抗氧化剂(luctanox ef 5mg；bht 2.01mg，没食子酸丙酯0.17mg)。
[0487]
**预混物sacox含有12,000mg盐霉素钠(浩卫制药有限公司(huvepharma nv))，在成品饲料中以0.582％的包合率递送70ppm。
[0488]
采样和测量：在到达实验农场时(第0天)随机选择约180只禽类，测量体重(bw)。在第10天和第22天，通过自动称重秤监测每个围栏的bw。在第37天，由于自动称重平台对于测量后期生长阶段和育肥阶段禽类的bw是不准确的，所以所有禽类都是每围栏手动称重的。在每个周期结束时，以每围栏为基础记录饲料摄入量并用于计算fcr，进行死亡率校正。在第21和36天，提取并汇集每围栏4只雄性禽类的左胫骨，用于确定脱脂胫骨灰分含量。通过对骨进行高压灭菌去除邻近组织；将胫骨最初在40℃下并且随后在70℃下干燥过夜。根据watson等人(2006)的改进方法，使用100％石油醚提取脂肪。将经脂肪提取的胫骨在103℃下干燥4小时并在马弗炉中在700℃下灰化24小时以确定骨灰分含量(数据待报告)。根据三点弯曲设置分析胫骨和肱骨抗断强度。在分析前四小时，将骨从冰箱中取出并将它们逐渐调节至20℃。测量每个骨的宽度和厚度。然后将骨定位在两个支架上。对于在d21收集的胫骨，支架之间的距离为40mm，对于在d36收集的胫骨，支架之间的距离为45mm，对于在d36收集的肱骨，支架之间的距离为40mm。对胫骨中部施加不断增大的力，直到其最终断裂。抗弯强度以压力(单位：mpa)测量。压力计算为(3*断裂时施加的力*支架长度)/(2*宽度*厚度2))。力以牛顿表示；支架长度、宽度和厚度以mm表示。根据iso178(硬质塑料的弯曲特性测定)进行测量。
[0489]
化学分析：分析所有处理日粮的代表性样品的干物质(dm)、粗蛋白(cp)、粗脂肪、粗纤维、ca、p、植酸-p和植酸酶。通过荷兰莱利斯塔德的斯科特霍斯特饲料研究所(schothorst feed research(lelystad,the netherlands))进行营养分析。
[0490]
对于所有分析，一式两份地分析样品。根据以下方法分析营养物：水分，nen-iso 6496(1999)；粗蛋白，nen-en-iso 16634(2008)；粗脂肪，nen-iso 6492(1999)；粗纤维，
nen-iso 6865(2001)；淀粉，nen-iso 15914(2005)；磷，nen-iso 6491(1999)；钙，nen-en-iso 6869(2001)；以及灰分，nen-iso 5984(2003)。日粮中的植酸磷(pp[肌醇六磷酸(ip6)])浓度和日粮中的植酸酶活性由丹麦布拉布兰德的杜邦实验室(dupont laboratories(brabrand,denmark))使用yu等人(2012)描述的方法测定。一个植酸酶单位(ftu)被定义为在ph 5.5和37℃下每分钟从植酸钠底物中释放1μmol无机正磷酸盐的酶的量(aoac，2000)。
[0491]
统计分析：基于围栏作为实验单位来分析数据，并使用jmp14进行分析。通过用2个水平的木聚糖酶和2个水平的植酸酶作为2
×
2因素排列的双向anova和作为随机效应的区组来分析数据。使用以下模型：yij＝μ+blocki+phytasej+xylanasek+(植酸酶
×
木聚糖酶)jk+eijk，
[0492]
其中：yij＝因变量；μ＝总平均值；blocki＝重复影响(i＝1
…
8)；phytasej＝phyg影响(j＝1、2)；xylanasek＝木聚糖酶影响(k＝1、2)，(植酸酶
×
木聚糖酶)jk＝phyg和木聚糖酶之间相互作用的影响，并且eijk＝残差。
[0493]
基于tukey检验鉴定处理之间的差异，其中p《0.05和p《0.1被认为具有显著性趋势。
[0494]
结果
[0495]
对于任何生长性能和骨参数均无植酸酶
×
木聚糖酶相互作用(表23和表24)。与相应的对照组相比，ipf处理在每个阶段和总体0-37天保持最终体重。因素分析显示，植酸酶减少第10至22天和第22至37天的饲料摄入量以及第0至22天和第0至37天的累积饲料摄入量(p《0.05)。类似地，通过植酸酶补充降低了第10至22天和第22至37天的水摄入量以及第0至37天的累积水摄入量(p《0.05)。通过植酸酶补充改善了第22至37天的饲料转化率以及第0至37天的累积饲料转化率(p《0.05)。在累积0至37日龄，通过植酸酶和木聚糖酶补充降低了每kg体重增重的累积饲料成本(p《0.05)。
[0496]
表23，用植酸酶和木聚糖酶完全替换无机p对0-37日龄的日粮阶段特定生长性能和累积生长性能的影响
[0497]
[0498]
[0499]
[0500][0501]
表24，用植酸酶和木聚糖酶完全替换无机p对骨灰分(％dm)和骨强度(mpa)的影响
[0502]
[0503]
[0504][0505]
ipf处理在所有采样点均保持了骨抗断强度。在第21天，通过植酸酶补充增加了胫骨抗断强度(p＝0.011)。
[0506]
在具有和不具有植酸酶的日粮中，与对照相比，木聚糖酶补充能够补偿75kcal me减少并保持性能。
[0507]
数据证实植酸酶单独或与木聚糖酶组合可从第1天完全替换肉鸡中的无机p，以及在商业环境下保持或改善肉鸡的性能和骨抗断强度。